Yazarlar protokolünün gelişimi ile yardımcı A. Benham teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma BAB NIH hibe NS06747 tarafından finanse edildi

1. Görüntüleme için Worms hazırlanması Bu protokolün segmenti yayınlanan C. dayanmaktadır elegans kültür teknikleri 1,2 ve Şekil 1&#39;de belirtilmiştir. <ol><li> NA22 E. ile yüksek pepton NGM agar (10 cm) numaralı seribaşı üzerine solucanlar büyür coli bakterisinin neredeyse açlıktan kadar. Immun Eğer, bir tabak güvenilir yol boyunca hesap kayıpları dikkate alındığında, ve görüntüleme için worm (Part 2) seçmek için kullanılan katı kriterleri, leke 1 kişi için yeterli solucanlar üretecek. </li><li> Tabağa GKD 2 0 birkaç ml dökerek Hasat solucanlar, kısaca dönen ve 15 ml konik tüp (tekrar tüpe solucanlar en aktarmak gerekirse) içine sıvı dökme. 3 dakika, 1000x g klinik santrifüj Pelet. Süpernatant kalan bakteriler kaldırmak için netleşene kadar GKD 2 O ile 1-3x pelet yıkayın. Solucanlar cam sopa gibi, süpernatantlar kaldırmak için polipropilen transferi pipet kullanın(Bu adım itibaren yumurta canlılık kayıpları önlemek için adımlar arasındaki zaman en aza indirmek için önemlidir). </li><li> Son yıkamadan sonra, Pastör pipetiyle solucan pelet 5 ml alkalin hipoklorit solüsyonu içinde solucanlar ve serbest yumurta lyse için. Hafifçe sallayın ve bir kere dakikada bir mikroskop altında tüpleri inceleyin. Solucanların yaklaşık% 50 (bunlar eğildi ve açık kırık görünecektir) parçalanır zaman, Yumurta Tampon, tersini birkaç kez üst tüp dolum ve 3 dakika, 1000x g pelet tarafından parçalama feshedebilir. Lizis süresi 5 dk geçmemelidir. </li><li> Transferi pipetle süpernatantı ve Yumurta Tampon ile pelet 3x yıkayın. </li><li> Enkaz yumurta ayırmak için, GKD 2 O% 30 sakaroz bir yastık onları yüzer: adım 1.4 den son yıkamadan sonra, dikkatle 5 ml GKD 2 0 süpernatan ve Pastör pipetiyle pelet çıkarın. GKD 2 O 5 ml steril% 60 sakkaroz ekleyin ve iyice karıştırın. Klinik santrifüj 6 dk, 1000x g Spin. Yumurta (bunlar ha olacak menisküs de toplayacak) bulutlu bir görünüm ettik, enkaz pelet olacak iken. </li><li> Plastik bir transferi pipet kullanarak, minimal hacim yumurta emmek ve dereceye giremeyen NGM agar transfer. Tüp yan yapışan yumurta hafifçe aşağı durulanır ve de transfer edilebilir. Bir adet 10 cm analiz zorlanma başına plaka yeterli dereceye giremeyen. </li><li> 20 gece boyunca yumurta (~ 16 saat) ° C ile dereceye giremeyen inkübe edin Birkaç saat için biraz kapalı kapağı bırakarak kurutun ilk birkaç saat için plaka havalandırın, ama bir gecede kapsayacak emin olun. </li><li> Yumurtadan çıktıktan sonra, S Bazal bir 15 ml konik boru (tüp içine dökün, birkaç mL S plaka Bazal, girdap eklemek) için L1 larva transferi. Klinik S Bazal minimum hacmi tekrar süspansiyon santrifüj (3 dk, 1000x g) ve NA22 bakteri ile tohumlanan 10 cm NGM agar için transfer Pelet. Adım 1.1 &#39;den her orijinal plaka için buraya 2 tabak kullanın. Solucanlar istenilen yaşına kadar inkübe edin. </li><li> Bir veya iki kez günlük kültürleri izler. Tehlike o isenizf açlıktan, taze NA22 plakaları transfer. Vahşi tip N2 solucanlar için, açlıktan hayvanları uzak gıda tükenmiş bölgeleri kitleler halinde göç gibi plaka üzerinde hareket ettiği solucanlar bir çizgi veya dalga oluşumu önce gelmelidir. Bu formları sonra, gıda tamamen birkaç saat içinde seyreltilmiş edilecektir. </li><li> Worms şimdi immun veya canlı görüntüleme için hazırdır. Sağlam solucanlar, çok sayıda kolaylıkla görüntülenebilir çünkü Tespit ve süspansiyon solucanlar boyama en uygunudur. Solucanlar sayıda görüntüleme için gerekli olduğundan ve Finney Ruvkun protokolüne göre 3-6 boyanması prosedürler dondurma-çatlama prosedürler için tercih edilir. </li></ol> 2. Konfokal Görüntüleme <ol><li> Konfokal görüntüleme için kızaklar üzerinde solucan takın. Mikrolitre başına birkaç yüz solucanların yoğunluğunu ayarlayın. % 2 agaroz bir ped olun S-bazal (cut-off 25 iğne takılmış 3 ml şırınga ile uygulanan) görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için vazelin ince bir halka ile çevrili. Bir Pipetibir kapak kayma üzerine solucan süspansiyon birkaç mikrolitre (görüntüleme canlı solucanlar eğer anestezi kullanırlar) ve kapağı kayma üzerine agaroz pedi düşürmek, yüzey üzerinde eşit solucanlar yayılıyor. </li><li> Görüntüleme için solucanlar seçin. ± 45 ° (0 ° doğrudan hedefi yönelmiş demektir burada) daha ilgi sinapsların daha fazla radyal deplasman, objektif lens yönelmiştir solucanlar seçin. Photobleaching önlemek için (birkaç saniye) hızlı bir şekilde bu değerlendirme gerçekleştirin. İlk kültürlerin ölçekli yeterli solucanlar bu geometrik kriterleri tatmin edecek sağlamak için optimize edilmiştir. </li><li> Numunenin konfokal görüntüleme tamamlayın. 0.4 yaklaşık 14 mikron kalınlığında kesitler kapsamına girenler olabilir nispeten düz örnekleri iyi sonuçlar üretebilir. Yüksek hızlı, düşük çözünürlüklü görüntü (512 x 512 piksel) hızlı doğru veri toplanması için yeterlidir. Bu floresans hesaplanmasına yol olarak, doyurarak aşırı sinyal gücü ile dedektör kaçınınsinyalleri. </li></ol> 3. Bireysel Synaptic Kümelerin Otomatik Tanımlama ve Analiz <ol><li> Açık çoklu TIF çıkış Volocity 4.0 (veya üstü) yazılım (Perkin Elmer) kullanarak konfokal mikroskop dosyaları. </li><li> Bitki uzakta faiz yapısı içermeyen görüntünün alanlarını (Image -&gt; Genişletilmiş Odak -&gt; Actions - - &#39;Freehand ROI&#39; aracını kullanarak ilgi&gt; Alan seç Seçimi&gt; Kırp; Şekil 2A). Not Genişletilmiş Odak analizinizi yardım için bilgisayar ekranında bir z-düzlemi projeksiyon üreten, ancak temel veri etkilemez; aynı gerekirse) parlaklık ve kontrast ayarlamaları için de geçerlidir. </li><li> Line Tool kullanılarak analiz alanının uzunluğunu ölçün. Hat uzunluğu hesaplanır ve veri tablosu (Şekil 2B) eklenecektir. </li><li> Filtresi (Ölçümler modu) &#39;Yoğunluk tarafından Nesneler&#39; kullanarak nesneleri tanımlayın. Sinaptik kümeler olduğu gibi, bir eşiğin belirtinvurgulanmış ve non-sinaptik arka plan (Şekil 2C) değildir. Başka bir renk etiketli bağımsız bir sinaptik marker İçerme sinapsların açıkça belirlemek yardımcı olabilir. Tipik sinapsların bir kaç birkaç yüz voksellerden arasında değişir. Bir kontrol örneği ile bir kez eşik ayarlayın ve sonraki tüm örnekler için kullanabilirsiniz. Bu deneyci çelişki potansiyelini tanıttı çünkü her bir örnek eşikleme ayrı ayrı kabul edilemez. Objeler seçilir ve (Şekil 2B) otomatik olarak tablo haline getirilmiştir. </li><li> Düzenlemek ve İhracat verileri. Bu genellikle arka lekeler olduğundan, 2 veya daha az voksellerden nesneleri ortadan kaldırın. Bunlar, başka filtrelenmesi, bir sonraki analiz elimine edilebilir. &#39;Nesne boyutu&#39; ile bunların kaldırılmasına aşağı, yeniden sıralama veri dosyası kolaylaştırmak için böylece tüm grup birlikte olacak. Microsoft Excel veya diğer elektronik tablo programı açılabilir CSV formatında veri verir. Her resim bir çıktı dosyası oluşturur. </li><li> Eğer Volocity yumuşakeşya kullanılamaz, alternatif yöntemler 3 boyutlu bilgi kaybı olmasına rağmen (Tartışma bakın), (örneğin ref. 7 veya ImageJ kullanarak manuel analizi) faydalanilabilir konfokal veri Z-düzlem projeksiyonlar analiz etmektir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Sunulan kantifikasyon metodu farklı parlaklık ve farklı birimlerin küme nüfusu ayırt edebilmelidir. Şekil 3 &#39;de temsili görüntü ve karşılık gelen sayısal verilerin bu parametreleri esas alınarak farklılaşma örnekleri gösterirler. Genel bir kural olarak sonuçlar göze bellidir ne uygun olmalıdır. C sinirin ventral kord İmmünoboyama UNC-49 GABA reseptörünün durumda elegans, tüm hayvanlar genellikle büyüklük ve olgunluk çok benzeri çıktı ve beş solucanlar bir grup (analiz sinir kordon boyunu normalize) için toplam sinaptik floresan değerleri standart hata gösterdi<html> ortalama 4 yaklaşık% 10 arasında değerlere. Genetik mutasyon ve diğer deneysel tedaviler (örn. ilaca maruz kalma) hacim ve yoğunluk değerleri ve sinaptik kümelerin frekans dağılımları sadece değiştirebilir, ama belki, zaman seyri ve solucanların senkronize gelişimsel değişkenliğinin yüksek yol. Ancak nicel sonuçlar her zaman hata oluştu ve yeniden eşikleme veya artefactual nesnelerin kaldırılması gibi düzeltici eylem önermek nerede açığa çıkarmalıdır Volocity tarafından belirlenen görüntüleri ve nesneleri denetim, görsel ve değilse takdir ne yansıtmalıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> Şekil 1.. Senkron C. hazırlanması elegans kültürler. Senkron kültürleri bu prosedür elde çünkü C. elegans gelişimi tutuklamalar ve gıda yokluğunda L1 larva ve besin geldiğinde devam eder. <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> Şekil 2. Sinaptik punktumlarda kantitasyonu. <ol class="ualpha"><li> Görüntünün gereksiz bölgeleri dosya boyutlarını azaltmak ve özgünlüğü artırmak için kırpılır. Sol panelde görüntü başlangıç ​​gösterir, orta panel seçilmiş bölgeyi gösterir, sağ panel kırpma sonra görüntü gösterir. Kırmızı sinyal UNC-49 GABA reseptör immünfloresan olduğunu, yeşil sinyal presinaptik GABA nöronlar 4 olarak ifade synaptobrevin-GFP (presinaptik belirteci) olduğunu. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . </li><li> A hattı analiz edilecek sinir kord parçasının uzunluğu çekilir, ve uzunluğu otomatik sonuçlar Tablo kaydedilir. Bu bilgiler, solucanlar boyama sırasında parçalanır halinde birkaç misli değişebilir analiz sinir kordun uzunluğu, nedeniyle sinaptik verileri normalize için gereklidir.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakamı görmek için buraya tıklayın. </li><li> A tek tek eşik sinaptik kümeler tanımlamak için uygulanır. Sol paneli eşik önce görüntü gösterir; farklı eşik seviyesi örnekleri ayrı paneller (yeşil sinyal atlanmıştır) &#39;de gösterilmiştir. Her tespit nesne renkli bir bölge olarak görüntü üzerinde tasvir edilmiştir. En soldaki panelinde görsel belirgin sinaptik kümeleri ve en sağ paneldeki renkli bölgeler arasındaki yazışmalar unutmayın. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . </li><li> Her tanımlanan nesnesi sonuçlar tablo ayrıca listelenmiştir. Bireysel nesneler seçilebilir ve istenirse muayene için görüntü üzerinde vurgulanır. Bu tablo kırmızı (&#39;rodamin&#39;) ve yeşil (&#39;EGFP&#39;) kanallar için bilgi içerir; nesneleri olduklarından yeşil kanal bilgileri potansiyel yanıltıcıkesinlikle kırmızı floresan göre belirledi. Bu analizi de tek renkli görüntüler üzerinden yapılabilir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . </li></ol><img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> Şekil 3. Temsilcisi sonuçları. Temsilcisi mikrograflarından wild-tip C&#39;den önce UNC-49 GABA reseptörleri için boyandı elegans (A) ve muscimol, uzun pozlama sonra downregüle olmak reseptörleri neden olan bir GABA reseptör agonisti olan (B) tedavi sonrası. Paneller önce (solda) ve (sağda) eşikleme ve küçük arka lekeleri çıkarıldıktan sonra kırpılmış görüntüleri gösterir. (C) gösterilen örnekler için kantitatif sinaptik parametrelerin Arsalar (A) ve (B): toplam floresans sinir kablosu uzunluğu (solda) ve kümülatif olasılık histogramları bireysel sinaps floresans içerik (orta) ve sinaps hacmi (righ normalizet), agonist pozlama (muscimol tedavi için işlenmemiş, n = 115 sinaps n = 60 sinapsların ile indüklenen sinaptik içerik ve hacim olarak istatistiksel olarak anlamlı bir azalma göstererek; p &lt;0.001, Kolmogorov-Smirnov testi <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-test.html</a> ).

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan yöntemi C. sinapsların büyük popülasyonlar için kantitatif çok parametre veri ayıklamak için tasarlanmıştır elegans, tedavi grupları içindeki tutarlılığı en üst düzeye çıkarırken. Üç özellikleri bu hedeflere katkıda. İlk olarak, immun tüm hayvanlar aynı yaşta olması için senkron solucan nüfus yapılmaktadır. Ifade seviyelerinin gelişim düzenlemesi deneysel tedavinin etkisi gizleyen bu adım kritiktir (örn. UNC-49 GABA reseptörü immünfloresans içi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Yazılım Adı </td><td> Şirket </td><td></td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Volocity v4.0 ya da daha yüksek </td><td> Perkin Elmer / Improvision </td><td></td><td> Bu yazılım erişim için yerel görüntüleme çekirdek tesis edin. Demo yazılımı Perkin Elmer web sitesinde mevcuttur. Bu yöntem, yalnızca Volocity kantitasyonu modülü gerektirir. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 2. Özel reaktifleri ve ekipmanları. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Yumurta tampon </td><td> NaCl KCl CaCI2 MgCl2 HEPES (7.3 pH ayarlama) </td> &lt;td&gt; 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM </td></tr><tr><td> Alkalin Hipoklorit (5 ml) </td><td> Taze çamaşır suyu (30 gün açıldıktan sonra şişe atmak) 10 N NaOH GKD 2 O </td><td> 1.0 ml 0.25 ml 3,75 ml </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Çözümler. </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

Synapse gücü presinaptik nörotransmitter serbest olaylara postsinaptik yanıtların genlik ifade eder, ve genel nöral devre fonksiyonu üzerinde büyük etkisi vardır. Synapse gücü kritik postsinaptik membran üzerinde sinaptik da kümelenmiş ve nörotransmitter reseptörlerinin bolluk bağlıdır. Reseptör düzeyleri gelişimsel olarak kurulan ve sinaptik plastisite ve nöromodülasyon önemli mekanizmalarını temsil eden yüzey lokalize, subsynaptic ve hücre içi havuzları arasında reseptör kaçakçılığı tarafından değiştirilebilir. Synaptically-lokalize nörotransmitter reseptör bolluk ölçmek için titiz bir yöntem geliştirme ve sinaptik plastisite çalışmak esastır. Olmayan-sinaptik havuzlarından sinaptik ayırt ve sinaps farklı lokalize reseptör popülasyonlar arasında ayrım, mekansal bilgi korur, çünkü floresan mikroskobu optimum bir yaklaşımdır. Genetik model organizma Caenorhabditis Eleganlar, özellikle de sağlıklı hayvan yerli sinapsların muayene izin, küçük boyutu ve göreceli kendi sinir sisteminin basitliği, şeffaflığı, ve güçlü genetik tekniklerin durumu nedeniyle bu çalışmalar için uygundur. Burada C. floresan etiketli sinaptik nörotransmitter reseptörleri hesaplamak için bir yöntem sunmak elegans. Onun temel özelliği çoklu düzlem konfokal mikroskop çıktı dosyaları, tablolama konumu, hacmi, floresan ve her sinaps için toplam floresan üç boyutlu bireysel sinapsların otomatik tanımlama ve analiz olduğunu. Bu yaklaşım konfokal veri z-düzlemi projeksiyonlar manuel analizi üzerinde iki temel avantajı vardır. Konfokal veri seti her düzlemde yer alması nedeniyle Birincisi, hiçbir veri genellikle piksel yoğunluğu ortalamaları ya da maxima dayalı, z-düzlemi projeksiyon yoluyla kaybolur. Sinapsların İkincisi, otomatik tanımlama, ama ex kontrol edilebilirsinaps, çok sayıda veri doğru ve hızlı ekstraksiyon izin veri analizi ilerledikçe perimenter,. Örnek başına sinaps binlerce yüzlerce kolayca büyük veri üreten istatistiksel gücü maksimize etmek için ayarlar, elde edilebilir. C. hazırlarken dikkat edilmesi gereken noktalar analiz ve tedavi grupları içinde hayvanlar arasındaki değişkenliği en aza indirmek için konfokal görüntüleme gerçekleştirmek için elegans da tartışılır. C. analiz etmek için geliştirilmiş olsa da elegans postsinaptik reseptörler, bu yöntem gerçekten synaptically-lokalize protein, ya, ayrık kümeler, punktumlarda veya organeller yerleştiğini herhangi bir floresans sinyalinin herhangi bir türü için genellikle yararlıdır. Prosedür üç aşamada gerçekleştirilir: 1) örnekleri, 2 hazırlanması) konfokal görüntüleme, ve 3) görüntü analizi. Basamak 1 ve 2 C. özgü elegans, 3. adımı genellikle odaklı mikrograflar herhangi punktat floresan sinyal için geçerli iken.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans at JoVE.com

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri quantifies<em&gt; C. elegans</em&gt;, Sinaps yüzlerce hızla z-düzlemi projeksiyon tarafından tanıtılan bozulmaları olmadan tek bir örnek içinde karakterize izin vererek.

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

10.2K Görüntüleme.  University of Toledo. Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri quantifies C. elegans, Sinaps yüzlerce hızla z-düzlemi projeksiyon tarafından tanıtılan bozulmaları olmadan tek bir örnek içinde karakterize izin vererek.

Video: Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Nörobilim

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

ve Otomatik Analizi<em&gt; C. elegans</emCelest Yazılım Kullanma&gt; Deniz Davranışı

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...