Yazarlar Eliana Di Cairano (Post-doktora bursu) ve Stefania Moretti (doktora bursu) destek için Universita degli Studi di Milano kabul etmek istiyorum. Bu çalışma CP Üniversitesi Araştırma Programı PUR tarafından desteklenen PHluorin inşa Dr. Dotti Francesco veri analizi konusunda yardım almak için, ve teknik yardım için Silvia Marsicano için biz, Prof. Jeremy M. Henley, Biyokimya Okulu, Bristol, Birleşik Krallık Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum.

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu <ol><li> SH-SY5Y hücre kültürü Not: denemeleri, insan nöroblastom SH- SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15 kullanılarak yapılmıştır. SH-SY5Y hücreleri değişken kümeleri ve diğer yapışıcı hücreler bir karışımı olarak büyür. Sıkıca TIRFM için çok önemlidir cam kapak, bağlı büyümeye hücreleri için protokol (hücre yoğunluğu, yarma oranı, vb.) Rapor talimatları izleyin. <ol><li> Başlamadan önce, laminer akış biyo-güvenlik kabini altında, steril fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) ve kültür ortamının elverişli hacmi oluşturmak. <ol><li> 150 mM NaCI, 24 mM fosfat tampon maddesi, pH 7.4 konsantrasyonları ile PBS, 50 ml olun. Çözüm Filtre. </li><li> Yüksek glukoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml), L-glutamin (Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) hücre ortamı 50 ml yapmak 2 mM) vesodyum piruvat (1 mM). Çözüm Filtre. </li></ol></li><li> Tam büyüme ortamı çıkarın ve 3 ml PBS ile hücrelerin yıkayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca (6 cm Petri için)% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit, 2 ml (EDTA) ile inkübe hücreleri,% 5 CO2 ve pipet kullanarak hücreleri ayırmak. </li><li> DMEM 2 ml ilave etmek suretiyle deaktive tripsin ve 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanır. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu içine hücreleri dağıtmak için aşağı yeterince Süpernatantı pelet DMEM 1 ml ekleyin ve çözüm yukarı pipet ve. </li><li> Tam orta 3 ml içeren yeni 6 cm çapında Petri kabındaki 4: Onlara 1 Böl. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de, 6 cm çapında Petri tabaklarında kültür içinde hücreleri koruyun. Haftada bir kez alt-kültür ya da 80 kapalı ne zaman - yüzey alanının% 90. </li></ol></li><li> Görüntüleme için SH-SY5Y hücre kaplama <ol><li> TIRFM deneyleri için, levhaCam kapakların üzerine hücreler. İstihdam cam 0.17 ± 0.005 mm kalınlığında ve 1,5255 ± 0.00015 kırılma indeksi ile kapsar. Başlamadan önce, aşağıdaki gibi cam lamelleri hazırlamak: <ol><li> Temiz cam% 90 etanol, O / N kapsar. </li><li> Damıtılmış su (damıtılmış su üç değişiklik) içinde iyice yıkayın. Kuru cam bir kurutma fırınında kapsar. </li><li> Talep cam Petri kapları içinde kapsamaktadır ve 3 saat boyunca 200 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir fırın içinde sterilize edilir. </li></ol></li><li> Transfeksiyondan bir önceki gün, 3.5 cm Petri için, her lamel kültür ortamının 1 ml ilave edilir ve bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1.1.5, komple ortam içinde 1 ml hücre pelletini askıya ve sayısı - adımda 1.1.3 tarif edildiği gibi hücreler tripsinize. De / 3 x 10 5 hücre elde etmek için her bir Petri kabına ekleyin hücre süspansiyonu doğru hacim hesaplanır. Bu yoğunluk optimum hücre büyümesi ve etkili transfeksiyon için gereklidir. 37 ° C&#39;de inkübe edin% 5 CO2 inkübatöründe O / N. </li></ol></li><li> Polietilenimin SH-SY5Ytransfection (PEI) Not: sinaptik kesecikler dinamikleri görselleştirmek için, synapto-pHluorin içeren pCB6 vektörü kullanılmıştır. synapto-pHluorin yeşil floresan proteini (GFP), 16 ve yapı da, yaygın olarak nöronlar 9 içinde sinaptik vezikül özelliklerinin incelenmesi için kullanılmıştır edilmiştir 2. sinaptobrevin veziküler membran proteini, bir pH&#39;a duyarlı varyantın çerçeve füzyonu ile oluşturuldu. <ol><li> Transfeksiyon başlamadan önce, aşağıdaki çözümlerden 10 ml yapmak. 1 ay gibi maksimal olarak çözüm tutun. <ol><li> 150 mM NaCI çözeltisi olun. 0.01 N HCI ile pH 5.5&#39;e ayarlayın. </li><li> 150 mM NaCI çözeltisi içinde% 10 polietilenimin (25 kDa lineer PEI) bir PEI solüsyonu yapın. Çözeltinin pH değeri 8.8&#39;e yükselir. 0.01 N HCI ile 7.8&#39;e pH ayarlayın. </li></ol></li><li> Sonra kaplama 24 saat, orta kaldırmak ve 1.5 ml yenilemetam bir ortam. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de hücreler tutun. </li><li> Laminer akış biyo-güvenlik kabini altında, 1.5 ml mikrofüj tüpü içinde, 150 mM NaCI çözeltisi 25 ul ve 3.5 cm&#39;lik bir Petri tabağı başına PEI solüsyonu 100 ul plasmid DNA 3 mikrogram ekleyin. </li><li> Vorteks 10 sn için, daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DNA / PEI karışımı inkübe edilir. </li><li> Dikkatle hücreleri ile lamelleri içeren Petri kabı DNA / PEI karışımı ekleyin ve hafifçe eşit Petri kabındaki reaktif dağıtmak için sallayın. </li><li> 4 saat sonra ortam değiştirme ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de hücreler O / N inkübe edin. Transfeksiyondan sonra 48 saat - görüntüleme deneyleri 24 gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi 2. Hücre Görüntüleme (TIRFM) <ol><li> Görüntüleme set-up <ol><li> Şekil 1&#39;de açıklanan set-up ile TIRF görüntüleme gerçekleştirin. Bu ters bir motorlu içermektedirmikroskop (Şekil 1, ek A), lazer kaynağı (Şekil 1, ek B) ve TIRF-kaymak (Şekil 1, ek C). Bir yüksek sayısal açıklık (NA 1.45 Alpha Planı-Fluar) 100X yağı, daldırma hedefi ile TIRFM aydınlatma ulaşır. </li><li> TIRFM aydınlatma için, bir çok çizgi (458/488/514 nm) 100 mW argon-iyon lazeri kullanır. Bir tek modlu optik fiber kullanılarak, TIRF kaydırıcı yoluyla, ışın yoluna doğrusal polarize ışığı lazer tanıtmak. Yansıyan ışık huzmesi yolunun aydınlık alan diyafram düzlemine TIRF sürgüsünü yerleştirin. <ol><li> Geniş alan aydınlatma için, geleneksel cıva kısa ark lambası HBO beyaz ışığa mikroskop bağlayabilirsiniz. Sürgünün bir kutuplaşma-muhafaza, çift prizma TIRF aydınlatma ve beyaz ışığın eşzamanlı kombinasyonunu sağlar. </li></ol></li><li> Bir uyarım filtre (genişlik 488/10 nm) lazer ışığı filtre lazer yoluna yerleştirilen bir filtre tekerleği üzerine monte edilmiştir. Kullanmakyüksek hız, program kontrollü, kapak, lazer aydınlatma hızlı şekilde kontrol etmek için. PHluorin analizi için, bir grup 525/50 nm emisyon filtresi geçmek monte. Görüntü ProPlus yazılımı ile soğutulmuş Hızlı CCD kamera dijital fotoğraf (512 x 512 piksel) yakalayın. </li></ol></li><li> TIRF aydınlatma sağlanması (Şekil 2) <ol><li> Lazerler, bilgisayar, kamera, filtre tekerleği, ve deklanşör kontrolörleri açın; Daha sonra, lazerler ısınmak ve stabilize etmek gerekiyor gibi deney başlamadan önce 20 dakika bekleyin. </li><li> Görüntüleme önce, aşağıdaki çözümlerden elverişli hacmi oluşturmak. <ol><li> 1.2 mM KH 2 PO 4, 25 mM 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) (tamponlanmış 125 mM NaCI, 5 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, Krebs (KRH) çözeltisi 50 ml yapmak pH 7.4), 2 mM CaCl2 ve 6 mM glükoz. </li><li> 80 mM NaCI, 50 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH 2 PO 4&#39;te KCI-KRH çözeltisi (pH 7.4), 10 ml yapmak25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 ve 6 mM glukoz (pH 7.4&#39;e tamponlanmış). </li></ol></li><li> Transfekte hücreler cam kapağını çıkarın ve uygun görüntüleme odasının takın. Odasına monte ve cam merkezinde KRH çözeltisi 500 ul ekleyin. </li><li> Amaç üzerinde yağ ekleyin. Mikroskop sahnede görüntüleme odasına yerleştirin ve cam lamel altında hedefi yerleştirin. Numune üzerinde güvenli kapağı yerleştirin. </li><li> Epifloresans modunda, lamel (üst yüzey) üzerinde durulacak ve oda merkezinde yer transfekte hücreleri seçin. Olan flüoresan sinyal açıkça 80 msn altında bir pozlama süresi ile kaydedilebilir hücreleri seçin. </li><li> Yazılım kontrolü altında, canlı modda TIRF aydınlatma geçiş. </li><li> TIRF yapılandırmasını ayarlamak için, numune kapağı (Şekil 2B) hakkında, objektif dışarı çıkar ışınının konumunu kontrol edin. Kiriş t merkezinde konumlandırılmış zamanO objektif lens (sol Şekil 2A), bir nokta (sol, Şekil 2B) TIRF örnek kapağının ortasında görünür ve hücre Epifloresans modunda görüntülü (birkaç odak düzlemleri, yüksek eşiğe Şekil 2C, sol) . </li><li> Kritik açı ulaşmak için, Y yönünde odaklı noktaya taşımak (ileri veya geri Şekil 2B, merkezi) TIRF kaymak (Şekil 1C) üzerindeki açı ayar vidası kullanarak. Kiriş (sağ Şekil 2A) kritik açıdan daha büyük bir açıyla örnek uçakta yakınsar zaman, nokta kaybolur ve düz, ince, odaklı çizgi (sağ Şekil 2B) örnek kapak ortasında açıktır. </li><li> Ince ayar yapmak için TIRF açısı hücre örneği (Şekil 2C) kullanın. Bu aşamada, bir Epifloresans-benzeri görüntü hala görülebilir, video floresan görüntü izleyin. Yavaşça, TIRF con kadar vidayı hareketkoşul elde edilir: hücrenin, sadece tek bir optik odak düzlemi (yani, kapak astar ile temas halinde, plazma zarı), bu (sağ, Şekil 2C), yüksek kontrastlı bir düz görüntü ile sonuçlanan bulunmaktadır. </li></ol></li><li> Örnek görüntüleme <ol><li> Tek kanallı time-lapse deney ayarlayın. Photobleaching en aza indirmek için, düşük pozlama süresi ve yüksek kazanç kullanarak görüntüyü yakalamak. 80 msn - Uygun pozlama süreleri 40 arasındadır. 2 Hz örnekleme frekansında - 1 görüntüleri edinin. Vesikül kinetik yüksek frekansta (10 Hz) daha iyi takdir örnekleme olabilir. gözlem düzenli süresi genellikle 2 dakika olduğunu. </li><li> TIRFM modunda KRH çözümü ve kayıt hücrelerinin 500 ul ekleyin. Bu dinlenme durumdur. Zaman sıralı görüntüleri kaydedin. </li><li> Dinlenme aynı koşullar (lazer gücü, zaman pozlama, çerçeve sayısı) altında aynı hücrede ve kayıt odaklanın. Beş kare sonra, KCl-KRH çözeltisi 500 ul ekleyin ve odasında KCI tutun.Bu uyarılmış bir durumdur; Zaman sıralı görüntüleri kaydetmek. </li></ol></li></ol> 3. Görüntü Analizi ve Veri İşleme NOT: görüntüleri analiz etmek, makro görüntü analiz yazılımı mevcut fonksiyonlarına göre, laboratuvarda geliştirilmiştir; benzer makro çevrimiçi (Malzeme ve Ekipmanları Tablo sağlanan URL) bulunmaktadır. <ol><li> Floresans yoğunluğu ölçümü <ol><li> Film boyunca, görüntünün ilgi (ROI) bir bölgede floresan yoğunluğu ölçümü için bir &quot;Dizi floresan yoğunluğu&quot; makro kullanın. </li><li> Zaman sıralı görüntüleri açın. Makro menüsüne gidin ve &#39;Sıra floresan yoğunluğu&#39; seçeneğini seçin. &#39;Analiz&#39; penceresinde &quot;yatırım getirisi seçin&quot; görünür. </li><li> Yatırım getirisi oluşturmak için menüden seçim araçlarından birini seçin. Noktalar (arka plan ROI) olmadan hücre zarının bölgelerde 3 ROI&#39;leri yerleştirin. Thi İstihdams &quot;arka plan ROI&quot; photobleaching değerlendirmek ve füzyon olay analizi (Şekil 3A) eşiğini ayarlamak için. </li></ol></li><li> Photobleaching düzeltme ve eşik tayini (Şekil 3B) <ol><li> Photobleaching değerlendirmek için, floresan yoğunluğu satırları &quot;arka plan ROI&quot;, (Şekil 3BA) açın. İlk yoğunluk değerine (F0) (F / F0) (Şekil 3BB) her çerçeve içinde floresan yoğunluğu değerleri Normale. Değerlerinin ortalamasını alın. </li><li> Ortalama verileri vurgulayın ve grafik menü seçeneklerini kullanarak bir çizgi grafiği oluşturmak. </li><li> Veri analizi menüsünden, arsa analizi iletişim kutusunu açmak için &quot;eğilim çizgisi&quot; seçeneğini seçin. Regresyon türünü seçin. Set &quot;üstel&quot; regresyon. Sonra &quot;grafik ekran denklemi&quot; seçeneğini seçin. Grafik penceresinde, üstel denklem görünür ve parametre değerleri otomatik, (Şekil 3BC atanır </strong&gt;). </li><li> Aşağıdaki gibi her çerçeve içinde yoğunluk değerlerine üstel düzeltme uygulayın: Fn (düzeltilmiş) Fn / exp = (-n * a) Fn = çerçeve n ölçülen deneysel floresan yoğunluğu; n = kare sayısı; nedeniyle photobleaching için yoğunluk kaybı oranını ifade eden = ağartma faktörü (sabit; &#160; Şekil 3BD). </li><li> Eşiğini ayarlamak için, bir normalize ve düzeltilmiş &quot;arka plan yatırım getirisi&quot; açmak ortalama floresan sinyali ve standart sapma (SD) hesaplayın. 3 SD artı ortalama değer eşiği (Şekil 3BE) temsil eder. Veri analizi için bu eşiği kullanın. </li></ol></li><li> Yarı otomatik bir prosedür kullanılarak füzyon etkinlikleri seçimi <ol><li> Görüntü analiz yazılımı ile zaman-ardışık görüntüleri açın. Aktif görüntü dizisine bir Gauss filtre uygulayın. </li><li> Seçim yapmanızı sağlar aracı &quot;nesneleri saymak&quot; veya makro kullanarak görüntüleri analizolan piksel bir tanımlanmış aralık içinde ortalama floresan yoğunluğu sahip bir nesne. Elle, eşik işlevini kullanarak aralığı yoğunluğunu ayarlayın (bar menüsüne gidin, set ölçü → eşik ilgi alanı vurgulamak için). Yeterli eşik yerel floresan arka plan sinyali üzerinde% 30. </li><li> Bir makro aşağıdaki kriterleri karşılayan tek nesneleri seçmek için &quot;nesneleri Filtreler&quot; Uygula: <ol><li> Yönü için aralıkları seçeneğini (min ve max dahil) uygulayın. Aspect ana eksene ve nesneye elips eşdeğer küçük ekseni arasındaki oranı bildirir. Aspect her zaman ≥1. Yeterli değerler dk = 1, max = 3 bulunmaktadır. </li><li> Çapı aralıkları uygulayın. Çapı iki derecelik aralıklarla iki anahat noktaları birleştirme ve nesnenin sentroidinden geçerek ölçülen çap ortalama uzunluğu bildirir. Piksel aralığı ayarlayın (veya mikron, bir kalibre sistemi kullanıyorsanız). </li><li> Başlangıçtaki optimal aralık tanımlali deneyler: manuel ilgi noktalar seçin ve ardından arsa profil işlevini kullanarak kendi çapını ölçün. </li></ol></li><li> &quot;Görüntüleme nesnelerini&quot; seçiniz: Seçilen nesneleri TIRFM görüntü (Şekil 4B) üst üste görünür. </li><li> Analizinde yalnızca kısa (1-3 kare) göstermek noktalar hemen sinyali (geçici noktalar) belirgin bir kayıp tarafından takip floresan yoğunluğunda geçici artış, ekleyin. Seçilen vezikül / noktalar (deneysel ROI) etrafında yaklaşık bir-nokta çapı radyal bir yatırım getirisi oluşturmak için dairesel bir seçim İstihdam. Bu adımı el gerçekleştirin. </li><li> ROI&#39;ları seçili, film boyunca her ROI ortalama floresan yoğunluğu hesaplayın. </li></ol></li><li> Veri analizi (Şekil 3C-D) <ol><li> Bir e-tabloya her &quot;deneysel ROI&quot; ölçülen floresan değişikliklerin zaman seyrini İhracat; (Şekil 3DA). İlk floresan yoğunluğu (F / F0), (Şekil 3dB) her çerçeve içinde yoğunluk değerini Normale. </li><li> Adım 3.2.4 (Şekil 3Dc) bildirildiği gibi, her karede yoğunluk değerlerine üstel düzeltme uygulayın. </li><li> Füzyon toplam olay sayısı (pik sayısı), her füzyon meydana zamanı (tepe genişliği) ve floresan tepe (pik yüksekliği ve AUC) genlik hesaplamak için elektronik tablo veya matematik paketleri kullanarak mantıksal fonksiyonlar uygulanır. Mantıksal formüller kullanılarak füzyon olayı analizinin bir örneği Şekil 3DD ve 3DE bildirilmiştir. </li><li> Plazma zarı vezikül füzyon olarak eşiğini (3SD ± ortalama arka plan floresan yoğunluğu) aşan floresan yoğunluğu artışı ve bir füzyon olayı olarak ortaya çıkan zirve varsayalım. </li><li> Son ve her tepe ilk x değeri arasındaki fark olarak pik genişliği hesaplayın. 1 / (örnekleme frekansı) için bu değer çarpın. Bu değer a düşününvezikül yeniden asitlenme ve geri dönüşüm (Şekil 3DD) önce plazma membran vezikül füzyon ve yapışma zamanı. </li><li> Eşiğin üzerinde değerler toplamı olarak bütün hücre AUC hesaplayın. Nedeniyle spontan (dinlenme) kayıt süresince net floresan değişikliği veya uyarılmış (uyarılmış) sinaptik aktivite olarak bu değeri düşünün. </li><li> Her tepe ve eşik maksimum y değeri arasındaki fark olarak pik yüksekliği hesaplayın. Füzyon türü (genel ort tek eşzamanlı / sıralı füzyon veya geçici vs tam füzyon) bu değeri olarak gösterge düşünün. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle.">The synaptic vesicle cycle.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).</li><li>Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+deep-layer+cortical+pyramidal+neurons.">In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+non+bioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).</li><li>Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurements+of+activity-dependent+membrane+recycling+in+motor+nerve+terminals+of+mammalian+skeletal+muscle.">Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle.</a> Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).</li><li>Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+transmission,+vesicle+dynamics,+and+transmitter+release+machinery+at+NCAM-deficient+neuromuscular+junctions.">Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions.</a> Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).</li><li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+with+FM+dyes.">Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity.">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Wyatt, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balice-Gordon+R.J.+Heterogeneity+in+Synaptic+Vesicle+Release+at+Neuromuscular+Synapses+of+Mice+Expressing+SynaptopHluorin.">Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin.</a> J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+&#34;kiss-and-run&#34;+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy.">Multiple forms of &#34;kiss-and-run&#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13, 563-567 (2003).</li><li>Miloso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid-Induced+Neuritogenesis+of+Human+Neuroblastoma+SH-SY5Y+Cells+Is+ERK+Independent+and+PKC+Dependent.">Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent.</a> J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+Membrane+Drift+Recruits+AMPA+Receptors+to+Dendritic+Spines.">Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines.</a> J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).</li><li>Treccani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+corticosterone+rapidly+increase+the+readily+releasable+pool+of+glutamate+vesicles+in+synaptic+terminals+of+prefrontal+and+frontal+cortex.">Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex.</a> Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).</li><li>D'Amico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+density+of+the+glutamate+transporter+EAAC1+is+controlled+by+interactions+with+PDZK1+and+AP2+adaptor+complexes.">The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes.</a> Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).</li><li>Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosteroid+allopregnanolone+regulates+EAAC1-mediated+glutamate+uptake+and+triggers+actin+changes+in+Schwann+cells.">Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells.</a> J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).</li><li>Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic-like+microvesicles+exocytosis+of+B-cells+using+a+live+imaging+technique.">Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique.</a> PlosOne. 9, e87758 (2014).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+SH-Sy5Y+cells+with+retinoic+acid+and+brain-derived+neurotrophic+factor+gives+rise+to+fully+differentiated,+neutrophic+factor-dependent,+human+neuron-like+cells.">Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells.</a> J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu kağıt görüntüye bir protokol sunar ve floresan cDNA-kodlanmış vektörler ve TIRFM kullanarak, salgılayan hücrelerde veziküller dinamiklerini analiz. TIRFM başarılı görüntüleme anahtar unsurları vezikül serbest bırakılması ve geri dönüşüm genetik olarak kodlanmış optik göstergelerle hücresel modeli ve hücre transfeksiyon seçim vardır. TIRFM ideal bir cam kapak yapışık büyüyen ve membran ve füzyon etkinlikleri sabit görüntülenmesine olanak vermek üz...

Nöronlar arasındaki sinaptik iletim Kimyasal sinir sisteminde iletişimin önemli bir mekanizmadır. Bu presinaptik yerinde vezikül füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca nörotransmitterlerin salınımı üzerine dayanır. Vezikül dinamikleri katılan proteinlerin çoğu tespit edilmiştir; Ancak, fenomen kendi özel katkısı 1 netleştirilmelidir. Bizim anlayış kısmen egzo / endositoz için en yaygın kullanılan testler her zaman en uygun olmadığı gerçeği ile sınırlıdır. Çeşitli vezikül füzyon ile ilgili çalışmalar ve dinamikleri elektrofizyolojik teknikler güveniyor. Bu teknik, optimum zamansal çözünürlük sağlar ve plazma membran veziküller ilk füzyon araştırmak için mükemmel ama presinaptik işlevini destekleyen yatan moleküler olayların birçok algılayamıyor. Elektron mikroskobu, diğer tarafta, en iyi morphologica sağlarNumuneler analiz edilmek üzere tespit edilmelidir, çünkü her tekil adım, ancak olayın dinamik yönü l açıklama yakalanan edilemez. floresan moleküler sondalar geliştirme 4-6 gelişmeler ile birlikte yeni optik kayıt teknikleri 2,3, gelişi, böylece sinaptik yapısı ve işlevi hakkında bilgi yeni seviyeleri sağlayan, canlı hücrelerde ekzositik süreçlerin görselleştirme sağlar. İlk çalışmalar sömürülen aktivite bağımlı stiril boyalar (FM1-43 ve ilgili organik boyalar) 7,8. Devlet-sanat görüntüleme teknikleri lümen veziküller proteinler 9 gergin Yeşil Floresan Protein (GFP) (pHluorin) pH-duyarlı varyantlarını kullanır. Bu sondalar, normalde düşük olması nedeniyle lümen pH veziküllerde mevcut olduğunda kapatılır. Plazma membranı ile füzyon sonra, kese iç nötr hücre dışı alanı, pH maruz<html> aniden artar pHluorin proton-bağımlı söndürme rahatlatır ve floresan sinyal hızla görünür. PHluorin değişim floresan artar izleyerek, füzyon olayı daha hızlı olduğu için, membran vezikül füzyon ölçülerek analiz edilebilir. Yüzey pHluorin-etiketli moleküller endocytosed olduğundan, floresans sinyali, daha sonra, bu nedenle, aynı yapı vezikül 9 dönüştürülmesi izlemek için de kullanılabilir, bazal seviyeye döner. Vezikül etiketli pH sensörü sadece gerçekten plazma zarı ile sigorta bu keseciklerin görselleştirme sağlarken, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte görüntüleme ayrıntıları egzo / endositik süreçlerinde adımları açıklamak için gereklidir. Gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan optik bir tekniktir toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM), floresan mikroskobu 10 bir uygulamadır. &quot;&gt; Toplam iç yansıma ışık yolu kritik açıdan daha büyük bir olay açısı ile cam kapak-kayma ulaşır cam kapak-slip ve örnek. Arasındaki arayüzde meydana, uyarma ışık numune içine iletilir ama değil Tamamen geri yansıtılır. Bu koşullar altında, ara yüzeyde genliği azalan bir ışık dalga formları altında ve kaybolan alan yoğunluğunun bir penetrasyon derinliği ile (arabiriminden mesafe ile katlanarak çürürken. daha az bir optik yoğunluk (örnek) ile ortam içinde ilerleyen daha uzakta sınırından bu GFP yapılar ile transfekte edilen hücrelerde. değil iken, yaklaşık 100 nm) kapak-slip en yakın olan sadece flüoroforlar uyarılırken, bu derinlik, plazma zarı üzerinde ifade edilen proteinlerin veya veziküler yapılarda tekabül Hücre iç flüoroforlar heyecanlı olamaz gibi, arka plan floresan minimize, ve bir görüntü çok yüksek sinyal / arka plan sıçan olduğunu. yaklaşanio 11 oluşturulur. Birkaç özellikler veziküller dinamikleri izlenmesi için seçim TIRFM tekniği yapmak. Mükemmel kontrast ve yüksek sinyal-gürültü oranı tek kesecikler kaynaklanan çok düşük sinyallerin algılanmasını sağlar. Her çerçeve çip tabanlı görüntü elde etme derece dinamik süreçleri tespit etmek için gerekli zamansal çözünürlük sağlar. Son olarak, numune başka düzlemde ışık hücrelerin minimal maruz güçlü fototoksisite azaltır ve uzun ömürlü time-lapse kayıt 12 sağlar. Veri analizi, bu tekniğin en zorlu ve önemli yönü kalır. vezikül füzyon izlemek için en basit yol, zaman 13 üzerine, hücre yüzeyinde raportör flöresan protein birikimini ölçmektir. Yanı sıra füzyon artar, net floresan sinyal arttıkça. Bununla birlikte, bu yöntem özellikle büyük hücreler ve dinlenme koşulları işlemi göz ardı edilebilir,endositoz ve photobleaching süreçleri nedeniyle kese ekzositoz için floresan yoğunluğu artışı telafi çünkü. Alternatif bir yöntem, tek tek her füzyon olayı 14 takip etmektir. Bu ikinci yöntem çok hassastır ve füzyon mekanizmaları hakkında önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Tamamen otomatik prosedürler veziküller takip etmek ve onların floresan sinyallerin dalgalanmasını kayıt her zaman mevcut değildir çünkü Ancak, tek olayların manuel seçimi gerektirir. Vezikül dinamikleri Gözlem yüksek frekansta örnekleme hücreleri gerektirir. Bu pek elle analiz edilebilir veri büyük miktarda üretir. Bu çalışmanın her iki öneri, laboratuarda geliştirilmiş bir işlem verilerini analiz etmek için SH-5YSY nöroblastom hücre çizgisinde taban ve uyarılmış olan nörotransmitter salimim izlenmesi için TIRFM görüntüleme tekniği optimize etmek ve tanımlamak için, adım adım bir Bütün hücre ve tek vezikül seviyelerde aktivite göstermez.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

Sinaptik veziküller füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca kimyasal sinaps nörotransmitterlerin bırakın. Gerçek zamanlı olarak sinaptik aktivite izleme ve tek kese düzeyinde egzo-endositozun farklı adımlar diseksiyon sağlık ve hastalık sinaptik fonksiyonlar anlamak için çok önemlidir. Doğrudan sinaptik veziküllerin ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM) hedeflenen pH duyarlı problar vezikül dinamiklerini takip etmek gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan genetik olarak kodlanmış. toplam iç yansıma tarafından oluşturulan kaybolan alan sadece egzo-endositoz süreçler gerçekleşecek tam olarak nerede, hücreler uygun olan cam kapak üzerinde ince bir tabaka (&lt;150 nm) yerleştirilen fluorophores heyecanlandırmak olabilir. Elde edilen yüksek kontrastlı görüntüler ideal izleme veziküller ve füzyon olayları kantitatif analiz için uygundur. Bu protokolde, SH-SY5Y insan neuroblastoma hücreleri nedeniyle düz yüzeyin, TIRFM ile tek vezikül seviyesinde nörotransmitter salimim çalışmak için değerli bir model ve dağılmış veziküllerin varlığı olarak önerilmektedir. Yapışkan hücreler gibi SH-SY5Y büyüyen ve synapto-pHluorin ile transfekte edilmesine yönelik yöntemler TIRFM ve görüntüleme gerçekleştirmek için teknik olarak, hem de temin edilmiştir. Son olarak, seçmek saymak ve tam hücre ve tek kese seviyelerinde füzyon olayları analiz etmeyi amaçlayan bir strateji sunulmaktadır. Görüntüleme işlemi ve veri analizi yaklaşımı doğrulamak için, pHluorin-etiketli kesecikler dinamikleri dinlenme altında analiz edilir ve koşulları (potasyum konsantrasyonları depolarizan) uyarılır. Membran depolarizasyon füzyon olgulannın sıklığını arttırır ve bütün hücre kaydedilen net floresans sinyalinin paralel bir zam neden olur. Tek vezikül analizi füzyon olayı davranışı (yüksek tepe yükseklik ve genişlik) değişiklikleri gösterir. Bu veriler inci öneririzpotasyum depolarizasyon bir büyük nörotransmitter salınımını uyarır, aynı zamanda vezikül füzyon ve geri dönüşüm mekanizmasını değiştiren sadece. Uygun floresan prob ile, bu teknik yapıcı ve uyarımlı sekresyon mekanizmaları incelemek için farklı hücresel sistemlerde kullanılabilecektir.

Tarif TIRF görüntüleme ve veri analizi prosedürleri hücresel sistemlerde veziküller dinamikleri üzerinde çalışmak üzere tasarlanmıştır. Bu teknik, füzyon olayları ve nörotransmiter vezikül dinamikleri 17 molekülleri ve uyuşturucu sinyal etkisini belirlemek için de kullanılabilir. GFP etiketli plazma membran proteinleri kullanılarak, TIRFM analizi glial GFP-etiketli glutamat taşıyıcılar ve epitel hücreleri 18,19 kurucu kaçakçılığı karakterize etmek için kullanılm?...

Watch this Scientific Journal Video about TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis at JoVE.com

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Görüntüleme.  Università degli Studi di Milano. This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

Video: TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Nörobilim

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized cells use this process to execute vital body functions such as insulin secretion from &#946; cells and neurotransmitter release from chemical synapses. Owing to its physiological significance, exo-/endocytosis has been one of the most studied topics in cell biology. Many tools have been developed to study this process at the gene and protein level, because of which much is known about the protein machinery participating in this process. However, very few methods have been developed to measure membrane lipid turnover, which is the physical basis of exo-/endocytosis.
This paper introduces a class of new fluorescent lipid analogs exhibiting pH-dependent fluorescence and demonstrates their use to trace lipid recycling between the plasma membrane and the secretory vesicles. Aided by simple pH manipulations, those analogs also allow the quantification of lipid distribution across the surface and the intracellular membrane compartments, as well as the measurement of lipid turnover rate during exo-/endocytosis. These novel lipid reporters will be of great interest to various biological research fields such as cell biology and neuroscience.

This protocol presents a fluorescence imaging method that uses a class of pH-sensitive lipid fluorophores to monitor lipid membrane trafficking during cell exocytosis and the endocytosis cycle.

pH'a duyarlı Floresan Lipid Analog ND6 ile Membran Lipid Devir Hızının Ölçülmesi

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...