<p class="jove_content"&gt; Biz anlayışlı tartışma DD Zhang teşekkür ve cömertçe reaktiflerin sağlanması. MJ NIH Kardiyovasküler Eğitim Bursu, Arizona Teknoloji Araştırma Girişimi Fonu, ve Koleji Bilim adamları Başarı Ödül tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma NIH Müdürü Yeni Yenilikçisi Ödülü (1DP2OD007161 01), Ulusal Bilim Vakfı (0.855.890) ve James S. McDonnell Vakfı tarafından desteklenmektedir.</p

1. Desenlendirme için kullanılan kalıpların oluşturulması <ol><li> Kavramsal tasarım desen. Desenler, cep telefonu şebekelerini kontrol hücre temas kurma hücrelerin izole, doğal yapıları taklit ya da başka hücre adezyon ve yerleştirme kılavuzu hizmet hangi oluşturulur. </li><li> Bilgisayar destekli, desen ve photomask oluşturulması tasarım veya CAD tabanlı oluşturma. Istenilen desen CAD yazılımı, AutoCAD gibi tasarlanmış olup, sonra bir photomask üretmek için dışarıdan bir şirkete gönderilir. </li><li> Ana desen üretmek için Fotolitografi. Cam slaytları ya karşı ince bir olumlu ya da kalın oluşturulan yapının büyüklüğüne bağlı olarak karşı bir negatif desenli. Cam slaytlar silikon gofret daha güçlü düşük maliyetli ve kırıldığı zaman kadar çok toz üreten kendi yararları için kullanılır. Alternatif olarak, kırınım ızgaralar gibi diğer kullanışlı yapılar ana desen olarak kullanılabilir. </li><li> Desenli slayt slaytlar desenli edilmiş bir yığına eklenir. Tüm adımları toz en aza indirmek için temiz bir akış kaput içinde yapılır. </li><li> Ana kalıpların oluşturulması. Kalay slayt yığınını biraz daha büyük bir konteyner sonra ilk bir kalıp oluşturmak için photolithographically desenli yüzey üzerine dökülür polidimetilsiloksan 30 g (PDMS) tutmak için oluşturulur. PDMS gazlar ve 1-2 gün boyunca tedavi etmek için izin verilir. </li><li> Kürünü PDMS ana desen sıyrılır ve bir sonraki adım için bir kalıp oluşturur. </li><li> 6 g 2 bileşenli epoksi (Devcon # 14310 (6 g) 1 dakika karıştırılır ve sonra gazlar, ana kalıp içine dökülür ve kuruması. Epoksi döngülerini kırarak birçok kabarcık kullanarak hızlı bir şekilde yapılmalıdır (8 dk) Gaz Giderme ve daha önce sadece ince bir tabaka kullanılarak epoksi setleri ve kabarcık kaldırma kabarcıklarını çıkarmak için imkansız hale gelir. kullanılan 6 g hızlı kabarcık çıkarılmasına olanak ince bir tabaka oluşturur. </li><li> Bir saat sonra, 2 bileşenli epoksi kısmen tedavi edilebilir ve daha fazla epoksi sonraki adımları ele easer kalın bir yapı üretmek için gaz alma üstüne eklenebilir. Epoksi sonra 1-2 gün boyunca tedavi etmek için izin verilir. </li><li> Sertleştikten sonra, epoksi PDMS ana kalıp çıkarılır ve bant epoksi kalıp bir kap formu sarılı. Bir çalışma kalıp sonra, epoksi kalıp üzerine PDMS dökme gaz alma PDMS, 1-2 gün boyunca kür tarafından oluşturulur. </li><li> Kürünü çalışma kalıp epoksi sıyrılır ve temizliğini korumak için saklanır. </li></ol> 2. Hücre rehberlik için kalıp yüzeyleri, Desenlendirme <ol><li> Çalışma kalıp Küçük bölümleri kesip ve polistiren Petri kabı üzerine yerleştirilir. Bu kalıp bölümlerinin yerleri etiketlenir. </li><li> Bir tripod, küçük bölümler ve konformal çalışma kalıp ve Petri kabı yüzeyi arasında temas sağlamak için ağırlıklı oluşur. İyi yerleştirme çanak alt bakarak görülebilir. </li><li> Montaj, plazma odasına yerleştirilir. Plazma tedavisi hava plazma ile 10 dakika 29.6 W (maksimum güç) 150 Pa başlatılan ve devam edilir. </li><li> Plazma tedaviden sonra, kalıp ve ağırlık arraignment kaldırılır. </li><li> Petri kabı biyogüvenlik kabini içinde 10 dakika sterilizasyon için UV ışığı altında yerleştirilir ve hücreleri ile seribaşı kadar orada saklanır. </li></ol> 3. Hücreleri ile yüzeyler Seeding <ol><li> SH-SY5Y CRL-2266 İnsan Nöroblastom veya diğer hücreleri hücre tipi için standart protokolleri kullanarak kültür. </li><li> SH-SY5Y izdiham CRL-2266 İnsan Nöroblastom hücreleri desenli yüzeye ekim önce görsel olarak ölçülür. </li><li> Standart hücre bölünmesi, kendi Petri çanak yüzeyinden hücreleri çıkarmak için yapılmaktadır. </li><li> Hücreleri, bir kez serbest dalgalı desenli yüzey üzerine yerleştirildiği zaman istenilen izdiham ulaşmak için seyreltilmiş sonra desenli Petri kabı yüzeyine numaralı seribaşı. </li><li> Hücrelerini yerleşmek ve yüzey eklemek için izin verilir. </li><li> Hücreleri, plazma tarafından oluşturulan desen üzerine monte ederken desenli Petri kabı birkaç gün birkaç saat inkübe edilir. </li><li> Kültür nöroblastoma hücreleri, retinoik asit (10 mcM), bir nöron gibi devlet içine ayırt etmek için hücre ikna etmek amacıyla günlük olarak eklenir. Retinoik asit Ayrıca karanlıkta yapılır. </li><li> Retinoik asit, farklılaşma gözlemlenebilir bundan sonra, birkaç gün boyunca her gün eklenir. </li><li> Medya, her 3-4 günde bir değiştirilir. </li></ol> 4. Gözlem ve Analiz <ol><li> Canlı hücreleri veya videolar Periyodik görüntüleri zaman içinde hücre davranışı gözlemlemek için alınır. Canlı görüntüler için, hücreler 37 ° C,% 100 nem ve% 5 CO 2 hücreleri tutan bir mikroskop aşamasında üst inkübatör yerleştirilir. Hücreler aynı zamanda floresan altında gözlem için sabit ve lekeli olmak </li><li&gt; yakalanan hücreleri görüntüleri ve videoları bir görüntü analiz sistemi ithal ve ölçümler büyüme oranı, hücre boyutu, göç hızı, farklılaşma, hizalama, spesifik proteinlerin yeri, ve diğerleri de dahil olmak üzere yapılmaktadır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Plazma litografi tekniği uygulayan tipik bir sonucu bazı keyfi veya doğal yapısı benzeyen hücreler bir desen oluşumu. Bu nöronların hatları ve şebekeleri oluşturulmuştur Şekil 1a-b görülür. Diğer hücre tiplerinin yanı sıra İnsan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) ve ızgaraları oluşturan C2C12 iskelet kas hücreleri gösteren Şekil 1c-d &#39;de görüldüğü gibi kullanılabilir. Ayrıca, poli-L-lisin gibi malzemeler, bazı hücre tiplerinin ve diğer kullanımlar için takılmasını kolaylaştıracak şekilde, Şekil 1e desenli olabilir . Nöronların gösterildiği durumda, bunlar arasındaki bağlantıları hücre ağları oluşturuldu. Bu nöronlar, beynin işleyişini etkileyen komşu hücreler arasında ayrık bağlantıları var beyin doğal olarak gerçekleşir ne çoğaltır. Laboratuvar böyle bir yapının oluşturulması ile, sayı, konum, sıklık ve bağlantıların diğer faktörlerin sistematik olarak kontrol edilebilir. Bu arraignments sonucu görsel olarak ölçülebilir ve kimyasal veya elektriksel stimülasyon gibi ek girdiler ağ davranış prob için uygulanabilir. Negatif bir sonuç, aşırı büyümüş ya da eksik desen veya kontamine örnek olacaktır. Bir eksik veya büyümüş desen desen ideal miktarda hücre kaynağı olmaz ya çok az ya da çok fazla hücre yüzey ekim neden olacaktır. Ayrıca, desen doğru değilse (örneğin, çok dar) hücreleri eklemek ve başarılı bir şekilde büyümek mümkün olmaz. Plazma desenlendirme de yüzey sterilize gerçeği nedeniyle uygun hücre kültürü protokolü bu nadir olmasına rağmen, kirlenmiş bir örnek durumda, uygun temizlik adımlardan biri sırasında muhafaza edilmiş olmaz. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 hücreleri ve protein Desenlendirme.

<ol>
	<li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography.">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li><li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography.">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li><li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation-induced+assembly+of+biomimetic+polypeptides.">Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides.</a> Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).</li><li>Langowski, B. A., Uhrich, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+Plasma-Initiated+Patterning+(&#956;PIP).">Microscale Plasma-Initiated Patterning (&#956;PIP).</a> Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).</li><li>Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterns+of+Chemisorbed+Cell+Adhesion-Repellent+Films+Using+Oxygen+Plasma+Etching+and+Elastomeric+Masks.">Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks.</a> Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li><li>Johansson, B. -. L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Air+Plasma-Treated+Polymer+Surfaces+by+ESCA+and+Contact+Angle+Measurements+for+Optimization+of+Surface+Stability+and+Cell+Growth.">Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth.</a> Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).</li><li>Murakami, T., Kuroda, S. -. i., Osawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Polymeric+Solid+Surfaces+Treated+with+Oxygen+Plasma:+Effect+of+Aging+Media+after+Plasma+Treatment.">Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).</li><li>Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion. , (1994).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).</li><li>Song, M., Uhrich, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Micropattern+Dimensions+Enhance+Neurite+Outgrowth+Rates,+Lengths,+and+Orientations.">Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).</li><li>Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+neuronal+cell+differentiation.">Nrf2 promotes neuronal cell differentiation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).</li><li>Ohl, A., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-induced+chemical+micropatterning+for+cell+culturing+applications:+a+brief+review.">Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review.</a> Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).</li><li>van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-treated+polystyrene+surfaces:+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions.">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li><li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Sch&#246;n, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion.">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li></ol>

Burada sunulan hücre soruşturma yöntemi karmaşık desenleri gibi biyolojik yapıları taklit çok hücreli ağlarının oluşturulması, sonra gruplandırılmış hücre davranış ve çevresel faktörler tek hücre yanıtlarını soruşturma kolaylaştırır doğa Subselüler. Uyaranlara üretmek için bir yöntem sağlar sağlar. Bu yöntemin kullanımı hızla hücre kültürü ile aynı laboratuarda düşük maliyetli ekipman ile yapılabilir gibi basit ama güçlü. Bu, aynı zamanda güçlü bir hücre duyarlı ortaya çıkan davranış kolay gözlem sağlar ve uzun süreli hücre davranışının araştırılması, uzun süreler için, kararlı doğası gereğidir. Bu ek olarak, birçok hücre tipleri ile uyumlu ve keyfi desenleri oluşturmak yapılacak deneyler çeşitli sağlar. Tekniğin uzun vadeli istikrar, plazma ile aktarılırdı yüzey işlevsellik yüzey parçası ve kaldırılmış veya bozulmuş olabilir bir kaplama veya diğer katman olmadığı gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Sıvı altında tutulması halinde, bu tür modifikasyon ay boyunca cep rehberlik yeteneğini koruyabilirsiniz. Deney anlamlı sonuçlar sağlanması için gerekli en önemli parçası, sonuçta hücre rehberlik için kullanılacak ana desen yaratma olmasıdır. Bu desen uygun bir şekilde tasarlanmış değilse, hücreler uygun desen yanıt vermiyor ve faydalı bir davranış üretmek olmayabilir. Gibi çizgi genişliği, desen aralığı ve diğerleri gibi parametreler belirli bir deseni ile hücre uyumluluk büyük ölçüde etkileyebilir ve genellikle bir dizi bu parametrelerin en uygun tasarım için ekrana ilk photomask oluşturulabilir. Desenlendirme dışarı taşıma ile ilgili diğer önemli parametreler kalıp oluşturma, tozsuz bir ortamda muhafaza, hücre tohumlama ve hücre kültürü genel kısırlık içerir. Kalıp oluşturma PDMS epoksi kalıp döküm tekrarlanan için izin yapılmaktadır çeşitli transfer adımlarla etkilenmiş olabilir. Tekrarlanan döküm altında küçük, yüksek en-boy oranı yapıları kalıp karşı aynı şekilde kaybetmez, çünkü epoksi kalıp oluşturulur. Transfer kalıplama doğru yapılırsa, boyutları ve verim etkilenebilir ama kötü gaz giderme, eksik kür veya aşırı ısıtma gibi yanlış yapılırsa, bir desen kabarcıklar, pürüzlülük ve deformasyon nihai sonucu etkiler oluşabilir. Tozsuz bir ortamda sürdürülmesi ile ilgili olarak, herhangi bir toz çalışma PDMS kalıp ve yüzey ve böylece uygun plazma koruyucu ve kimyasal desenlendirme arasındaki iletişim ile müdahale gibi kalıpları mümkün olduğunca temiz tutulması gerekir. Hücrelerin ekim yoğunluğu da, ne çok az ya da çok fazla hücre desen alanında yaşayan olmasını sağlamak için optimize olmalıdır ve kısırlık kullanılmakta olan hücreler, bakteri ve diğer kirlenmesini önlemek amacıyla sağlanmalıdır. Teknik Mikroakiskan, Mikroelektronlar ve mekanik problar gibi diğer unsurları da dahil edilebilir. Bu, bu kombinasyonlarının etkilerini inceleyerek odaklanmış daha iyi deneyler ve gelecekteki çalışmaları sırasında çeşitli fizyolojik şartlar çoğaltmak için hücrelere ek uyaranlar sağlar

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Plazma Temizleyici Ve Vakum Odası </td><td> Harrick Plazma </td><td> PDC-001 </td><td></td></tr><tr><td> Ters floresan, faz kontrast mikroskop </td><td> Nikon </td><td> TE2000-U </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop aşamada üst inkübatör </td><td> AmScope </td><td> Model TCS-100 </td><td> Uygun bir atmosfer sağlayan bir muhafaza edilebilir </td></tr><tr><td> Polistiren Petri kabı </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> Polidimetilsiloksan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Epoksi </td><td> Devcon </td><td> 2 ton açık epoksi # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kültürü ortamı </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> Medya hücre tipi için standart formülasyonları aşağıdaki </td></tr><tr><td> Retinoik asit </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithography surface patterning for creation of cell networks

Mikro ve nano ölçekli çözünürlüğe sahip bir hücre mikroçevresinin Sistematik manipülasyonu genellikle çeşitli hücresel ve moleküler olaylar deşifreleme için gereklidir. Bu gereksinimi karşılamak için, biz, 100 nm milimetre arasında değişen özelliği boyutları ile desenli bir yüzey oluşturarak hücresel mikroçevresinin işlemek için bir plazma litografi tekniği geliştirdik. Bu tekniğin amacı, kontrollü bir şekilde çalışma yapabilmek için, tek tek hücrelerin davranışları yanı sıra, hücreler ve onların etkileşimleri grupları. Bu plazma litografi yöntemi, yüzey kimyası, fiziksel bir kalıp ile düşük ısılı plazma temas koruyucu yoluyla bir substrat üzerindeki seçici değişiklik dayanmaktadır. Bu seçici koruyucu hücre eki ve hareket kılavuzu kimyasal bir desen bırakır. Bu desen veya yüzey şablon, daha sonra yapısı, doğada bulunan taklit ve deneysel araştırmalar için kontrollü bir ortamda üreten hücreleri ağları oluşturmak için kullanılan olabilir. Biyouyumlu bir şekilde şeffaf polimer yüzeylerde sabit bir yüzey desenleri tekniği de biyolojik bir fenomen eğitim için uygundur. Haftalar veya aylar için son ve yüzey desenleri, böylece hücreleri, farklılaşma ve adaptasyon gibi hücresel süreçleri, uzun vadeli çalışma kolaylaştırır uzun süreler için etkileşim rehberlik eder. Yüzeye değişiklik doğa öncelikle kimyasal ve böylece sonuçların yorumlanması için topografik ya da fiziksel bir girişim tanıtmak değildir. Ayrıca desenlendirme elde etmek için herhangi bir sert veya toksik maddeler içerir ve doku kültürü ile uyumlu değildir. Ayrıca, çeşitli türleri için idealdir ve yeteneği kendi özellikleri ayarlamak için nedeniyle biyolojik uygulamalarında yaygın olarak kullanılan polimerik malzeme, değiştirmek için uygulanabilir. , Göç, yapışma, ve ciltleme gibi belirli süreçleri yalıtılmış, tek ve çok hücreli seviyesine ayrık, açık gözlemler sağlar ulaşılabilir çözünürlük, aynı zamanda faydalıdır. Bu yöntem, göç, sinyalizasyon, doku oluşumu ve nöron davranış ve etkileşimleri bir ağ içinde çıkarılmalıdır ilgili araştırmalar için farklı hücre tipleri farklı ağları oluşturmak için istihdam edilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks at JoVE.com

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Çok yönlü bir plazma litografi tekniği hücresel eklenti rehberlik için sabit bir yüzey desenleri oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu teknik, doğal dokuları taklit eden ve birçok farklı hücre tiplerinde eğitim için kullanılır olmuştur da dahil olmak üzere hücre ağları oluşturmak için uygulanabilir.

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

plasma-lithography-surface-patterning-for-creation-of-cell-networks

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K Görüntüleme.  University of Arizona. Çok yönlü bir plazma litografi tekniği hücresel eklenti rehberlik için sabit bir yüzey desenleri oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu teknik, doğal dokuları taklit eden ve birçok farklı hücre tiplerinde eğitim için kullanılır olmuştur da dahil olmak üzere hücre ağları oluşturmak için uygulanabilir.

Video: Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Biyomühendislik

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Photolithographically Tanımlı Parylene-C hücre Desenlendirme: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Yüzeyleri

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3D Kağıt mikroakışkan Cihazlar Construct Yapışkan Desenlendirme kullanma

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

mikroakışkan Probe ile Canlı Hücre Katmanlar hızlı Subtractive Desenlendirme

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&amp;#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Tek hücreli Seviyesinde Kavitasyon Kabarcık (ler) -Hücre Etkileşim ve Sonuç biyoetkiler incelenmesi için yüzey Desenlendirme ile mikroakışkan Sistemi

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving (SSLE) of Glass Crystals

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data sets of patient or specimen anatomy in clinical or preclinical settings. However, the use of a virtual, on-screen display limits the ability of these tomographic images to fully convey the anatomical information embedded within. One solution is to interface a biomedical imaging data set with 3D printing technology to generate a physical replica. Here we detail a complementary method to visualize tomographic imaging data with a hand-held model: Sub Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. SSLE offers several unique benefits including: the facile ability to include anatomical labels, as well as a scale bar; streamlined multipart assembly of complex structures in one medium; high resolution in the X, Y, and Z planes; and semi-transparent shells for visualization of internal anatomical substructures. Here we demonstrate the process of SSLE with CT data sets derived from pre-clinical and clinical sources. This protocol will serve as a powerful and inexpensive new tool with which to visualize complex anatomical structures for scientists and students in a number of educational and research settings.

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving SSLE of Glass Crystals

A methodology is described herein for representing anatomical imaging data within crystals. We create scaled three-dimensional models of biomedical imaging data for use in Sub-Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. This tool offers a useful complement to computational display or three-dimensionally printed models used within clinical or educational settings.

Cam Kristallerin sonraki Alt yüzeye Lazer Gravür (SSLE) için Ölçekli Anatomik Model Biyomedikal Tıbbi Görüntüleme Verilerin oluşturulması ve İlişkili Etiketleri

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...