GFP-β-aktin plazmid cömertçe Dr. Wayne Orr LSUHSC-S Patoloji Bölümü tarafından sağlanan ve LSUHSC-NO Farmakoloji Bölümü Dr. Becky Worthylake, laboratuvar amplifiye edildi. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (P20 RR-018.766) ve Amerikan Kalp Derneği (05835386N) hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability.">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li><li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability.">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li><li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability.">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li><li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier.">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li><li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W., Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculatory+Exchange+Function.">Microcirculatory Exchange Function.</a> Handbook of Physiology: Microcirculation. , 81-124 (2008).</li><li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells.">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li><li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+ruffles+in+cell+migration:+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization.">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li><li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells.">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li><li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibres.">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li><li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li><li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells.">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li><li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction.">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li><li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability:+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases.">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li><li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension.">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li><li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeletal+dynamics+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 184-204 (2005).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 101-126 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Canlı endotel hücreleri GFP-aktin görüntüleme inflamatuar uyaranlara yanıt aktin hücre iskeletinin dinamiklerini ayrıntılı bir analiz sağlar. Bu yöntem ayrıca, kayma gerilmesi 11 gibi fiziksel güçlerine yanıt olarak hücre iskeletinin yeniden şekillenme gösteren önceki bulgularla üzerine inşa etmek için yararlı olabilir . Buna ek olarak, bu yöntem, göç, mitoz, hücrelerarası kavşaklar ve junctional olgunlaşma oluşumu ve bariyer fonksiyonu bakım dahil olmak üzere çeşitli endotel hücre faaliyetleri, aktin hücre iskeleti dinamiklerinin katkısı ayrıntılı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Gösterilen veriler, trombin ile tedavi öncesi ve sonrası endotel aktin hücre iskeletinin davranışı görülebilir. Endotelyal hücrelerin kenarlarında Yerel lamellipodia oluşturan ve hem nonconfluent ve konfluent hücre mono tabakaları zamanla gerileyebilen gözlendi. Trombin ile tedavisi kısaca lamellipodia formu kesilditirme ve ciro. Trombin, ayrıca endotel hücreleri 12-14 trombin aktin stres lifli yapısı ve artan merkezcil gerginlik geliştirme neden olduğu daha önceki raporlarda ile anlaşma hücreleri, biraz sözleşme neden oldu . Ancak, bu gibi canlı hücre görüntüleme çalışmaları, stres liflerin kökeni artık tespit edilebilir. HUVEC, stres liflerinin çoğu hücre çevre kaynaklı ve hücreleri 8, 9 göç enine yay liflerin benzeyebilir. Sabit hücreleri kullanarak üzerinde bu yöntemi başka bir gücü, deneysel gruplar arasında seçim yanlılığı ortadan kaldırarak, stres liflerin sayısı, trombin tedavi öncesi ve sonrasında tek tek hücrelerin sayısal olabilir ki. Bu protokol ile, hücre kenar ve aktin stres lifleri dinamik hareketi değerlendirir. Endotel hücreleri, floresan kurtarma gibi daha gelişmiş teknikleri photobleaching sonra aktin monomeri dinamiklerini anlamak (sıkı bağlamak) veya floresan mikro specklekopyası (FSM) 16, 15 uygulanabilir. Buna ek olarak, çünkü mikrovasküler endotel hücreleri mikrovasküler bariyer fonksiyonunu daha iyi bir modeli, etkin bir şekilde mantıksal bir gelecekteki yönünü temsil mikrovasküler endotel hücrelerinde GFP-aktin ifade etmek transfeksiyon protokolleri optimizasyonu temsil edebilir. Özetle, GFP-aktin ifade canlı endotel hücreleri görüntüleme endotel hücre aktin hücre iskeletinin çeşitli tipte uyaranlara nasıl tepki vereceğini belirlemek için güçlü bir araçtır temsil eder. Sıkı konfluent endotel mono tabakaları kullanılarak yapılan çalışmalar, aktin-zengin lamellipodia ve endotel bariyer fonksiyonu enine yay stres lifleri gibi dinamik yapıların rolleri belirlemek yardımcı olacaktır. Buna ek olarak, GFP-aktin veya diğer hücre içi yapıların görüntülenmesi sağlayan diğer füzyon proteinleri ifade endotel hücreleri canlı hücre görüntüleme, sinyalizasyon ve yapısal mekanizmaları anlamak için gerekli detaylı uzaysal bilgi sağlayacak bu determine bariyer bütünlük.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Zil 5x STOKUN </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Potasyum klorid </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1.75 g </td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1.47 g </td></tr><tr><td> Magnezyum Sülfat </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td colspan="4"> 4 otoklavlanmış mağaza şişe ve içine steril filtre ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. MOPS tampon </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td>Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125.6 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td colspan="4"> 4 otoklavlanmış mağaza şişe ve içine steril filtre ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Albumin Fizyolojik Tuz Çözeltisi (APSS) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Zil stoku (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mops Tampon </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0.168 g </td></tr><tr><td> Sodyum Piruvat &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albümin, Bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td colspan="4"> 37 ° pH 7.4 &#39;e ayarlayın ° C, 4 otoklavlanmış şişe ve depoya sonra steril filtre ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. % 0.9 salin </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td colspan="4"> 4 otoklavlanmış mağaza şişe ve içine steril filtre ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. % 1,5 jelatin Çözüm </td></tr><tr><td> Domuz deri gelen Jelatin </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> % 0.9 salin </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td colspan="4"> 37 çözüm Sıcak ° C yeterince jelatin çözülür. Iken 4 otoklavlanmış şişe ve mağaza hala sıcak, steril filtre ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

Mikrovasküler endotele çözünen sıvıları ve seçici geçirgen bir bariyer olarak önemli bir rol oynar. Endotel hücreleri arasındaki yapışkan kavşak endotel geçirgenliği düzenleyen ve birçok çalışmalar junctional bütünlüğünü belirleyen 1-5 aktin hücre iskeletinin önemli bir katkı koymuştur. Kortikal aktin kemeri istikrarlı kavşaklar 1, 2, 4, 5, bakım için önemli olduğu düşünülmektedir. Buna karşılık, aktin stres lifler kavşaklar 2-5 zayıflatır endotel hücreleri içinde merkezcil gerginlik oluşturmak için düşünülmektedir. Bu teorinin endotel hücreleri, endotel geçirgenliği arttırdığı bilinen inflamatuvar mediatörlerin tedavi ve sonra hücrelerin mikroskobik gözlem için sabitleme ve F-aktin etiketleme olduğu çalışmalar esas almıştır. Ancak, sabit hücrelerin görüntüler sadece anlık görüntü sağlar, çünkü bu çalışmalar aktin hücre iskeletinin rolü çok sınırlı bir anlayış sağlamakaktin yapılar 5 dinamikleri hakkında hiçbir bilgiye sahip. Canlı hücre görüntüleme endotel bariyer bütünlüğünü belirleyen mekanizmaların çalışmalar içine aktin hücre iskeletinin dinamik yapısı dahil sağlar. Bu yöntemin en büyük avantajı, önce canlı hücreler aynı set ve tedaviden sonra değerlendirilir sabit örneklerinde gözlemleyerek oluşabilecek olası önyargı kaldırarak, endotel hücreleri aktin yapılar üzerinde çeşitli inflamatuvar uyaranların etkisi olabilir ki. İnsan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) plazmid GFP-β-aktin ile transfekte ve cam lamelleri izdiham büyüdü. Ayrıca endotel bariyer bütünlük içinde zamana bağlı değişimlere sebep inflamatuvar mediatörlerin önce ve sonra, GFP-aktin konfluent HUVEC Time-lapse görüntüleri yakalanır. Bu çalışmalar endotelin katkıda aktin hücre iskeletinin değişiklikleri sıvı sıra görsel gözlem sağlarl bariyer bozulması ve restorasyon. Bizim sonuçlarımız, endotel hücreleri yerel, aktin-zengin lamellipodia oluşumu ve ciro sürekli göstermektedir. Aktin stres liflerinin oluşumu ve hareketi de görülebilir. Inflamatuar uyaranlara ile tedavi öncesi ve sonrası, yerel lamellipodia oluşumu ve ciro sıklığını bir analiz, kymograph analizleri ile belgelenmiştir. Bu çalışmalar endotel bariyer bütünlüğünün sürdürülmesi için önemli, önceden tanımlanmamış moleküler mekanizmalarını keşfetmek için kullanılabilir endotel hücreleri aktin hücre iskeletinin dinamik yapısı hakkında önemli bilgiler sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

GFP-aktin ifade canlı endotel hücreleri mikroskobik görüntüleme iskelet yapıları dinamik değişimlere karakterizasyonu sağlar. Sabit örneklerinde kullanan teknolojilerden farklı olarak, bu yöntem önce aynı hücrelerde aktin hücre iskeletinin temporal değişikliklerin ayrıntılı bir değerlendirme sırasında, çeşitli fiziksel, farmakolojik veya inflamatuvar uyaranlara sonra sağlar.

GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

study-actin-cytoskeleton-live-endothelial-cells-expressing-gfp

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

26.9K Görüntüleme.  Louisiana State University Health Sciences Center. GFP-aktin ifade canlı endotel hücreleri mikroskobik görüntüleme iskelet yapıları dinamik değişimlere karakterizasyonu sağlar. Sabit örneklerinde kullanan teknolojilerden farklı olarak, bu yöntem önce aynı hücrelerde aktin hücre iskeletinin temporal değişikliklerin ayrıntılı bir değerlendirme sırasında, çeşitli fiziksel, farmakolojik veya inflamatuvar uyaranlara sonra sağlar.