Bu protokol, tümör mikro ortamını hedeflemek için tasarlanmış yeni nanopartiküllerin taranması için birincil kanser ilişkili fibroblastların murin meme kanserinden başarılı bir şekilde izole edildiğini ve kültürlendiğini mümkün kılar. Primer CAF, tümör stromasının in vitro çalışmaları için en güvenilir ve fizyolojik modeli temsil eder. Bu protokolde, optimum verimin nasıl elde edeceğimizi açıklıyoruz.
Başlamak için, tümör ayrışması için bir sindirim karışımı hazırlayın ve tüpü sıkıca kapattıktan sonra üç ila beş milimetre tümör parçalarını çözeltiye batırın. Tüpü ters çevirin, tüm tümör parçalarının tüpün altında kapağa doğru bunların uzadığını kontrol edin. Daha sonra tüpü uygun gövdedeki mekanik bir dissosiyatere takın ve özellikle sert tümörler için tasarlanmış bir ayrışma programı çalıştırın.
Çalıştırdıktan sonra, tüpü ayırın ve numuneyi hafifçe sallayarak 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırmak için baş aşağı yerleştirin. Daha sonra tüpü uygun gövdedeki dissosiyatere yeniden takın ve sert tümörler için ayrışma programını iki kez çalıştırın, prosedürün sonunda büyük doku parçalarının kalmamasını sağlayın. Numuneyi 50 mililitrelik bir tüpteki 40 mikron hücreli süzgeçten geçirin.
Ardından filtreyi 10 mililitre RPMI 1640 orta ve santrifüj ile yıkayın. Santrifüjlemeden sonra, peleti PBS, %0,5 BSA ve iki milimolar EDTA'dan oluşan PBE arabelleğine yeniden ayırın ve hücreleri Trypan Blue ile sayın. 20X bağlama tampon stok çözeltisini steril çift damıtılmış su ile seyrelterek ölü hücre çıkarma bağlama tamponunu onarın.
Hücreleri beş mililitre 1X bağlama tamponu ve santrifüj ile yıkayın. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 0,1 mililitre ölü hücre çıkarma mikrobu ile yedinci hücrelere kadar 10'a kadar yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, kaputun altına manyetik bir stand hazırlayın ve uçları aşağıyı işaret ederek ferromanyetik ayırma sütunlarını asın.
Sütunları 0,5 mililitre soğuk bağlama arabelleği ile dengele ve çözelti akana kadar bekleyin. Kuluçkadan sonra, boncuk ve hücre süspansiyonu için 400 mikrolitre soğuk bağlayıcı tampon ekleyin. Tüm hacmi sütuna yükleyin ve atıksu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.
Sütunu 0,5 mililitre soğuk bağlama tamponu ile dört kez yıkayın ve toplam atık suyu aynı tüpte toplayın. Kanserle ilişkili olmayan fibroblastların tükenmesi için, PBS ile nemlendirilmiş 70 mikron hücreli bir süzgeç kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin ve hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve peleti 80 mikrolitre soğuk PBE tamponunda yeniden depolayın.
Tümörle ilişkili olmayan 20 mikrolitre fibroblast tükenme kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve numuneyi karanlıkta 15 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Boncuklarla inkübasyon sırasında, manyetik bir stand üzerinde ferromanyetik tükenme sütunları hazırlayın.
Sütunları iki mililitre soğuk PBE arabelleği ile dengele ve çözelti akana kadar bekleyin. Kuluçkadan sonra, boncuk ve hücre süspansiyonu içine 400 mikrolitre tampon ekleyin. Tüm hacmi sütuna yükleyin ve atıksu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.
Sütunu iki mililitre PBE ile iki kez yıkayın. Toplam atık suları aynı tüpe toplayın ve atık suları santrifüj edin. Kanserle ilişkili fibroblastların pozitif seçimi için peleti 80 mikrolitre soğuk PBE tamponunda yeniden depola.
Daha sonra 20 mikrolitre tümörle ilişkili fibroblast mikrobeadlarda ve örnekleri karanlıkta 15 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, ferromanyetik ayırma kolonlarını manyetik bir stand üzerinde hazırlayın ve 0,5 mililitre soğuk PBE tamponu ile dengelayın. Kuluçkadan sonra, boncuk ve hücre süspansiyonu içine 400 mikrolitre PBE ekleyin.
Tüm birimi sütuna yükleyin ve etiketlenmemiş hücrelerin 15 mililitrelik bir tüpe akmasına izin verin. Sütunu 0,5 mililitre PBE arabelleği ile üç kez yıkayın ve toplam atık suları aynı tüpte toplayın. Sütunu mıknatıstan çıkarın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.
Sütuna bir mililitre PBE ekleyin ve hücreleri boşaltmak için pistonu hemen sütuna itin. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini uygun bir DMEM hacminde yeniden depolar ve hücreleri bir doku kültürü plakasında tohumlar. Mikroskop altında hücre yoğunluğunu kontrol edin ve hücrelerin yapışmasını ve büyümesini sağlamak için plakayı 37 santigrat dereceye ve% 5 karbondioksite yerleştirin.
Dişi farelerin meme yağ yastığına 4T1 luciferaz hücrelerinin enjekte edilmesi, implantasyondan beş gün sonra tespit edilebilir bir tümör kütlesinin büyümesine yol açtı. CAF izolasyonu için yeterli bir kurban penceresi bulmak için, bir yandan daha yüksek tümör büyüklüğü ve biyolüminesans görüntülemesi ile diğer yandan ortaya çıkan tümör ülserasyon ve nekroz arasında optimal bir uzlaşma arandı. 20. gün, izolasyon işleminden sonra hücre iyileşmesini optimize etmek için zaman noktası olarak ayarlandı.
TOPLANAN canlı hücrelerin panelinden, tümörle ilişkili olmayan fibroblastların tükenmesinden ve tümör ilişkili fibroblastların zenginleştirilmesinden, CAL popülasyonunun izole edilmesi için iki bölüme daha ihtiyaç vardı. CAF hücreleri fibroblastlara özgü büyük iğ şeklinde morfolojiyi ortaya çıkardı ve 4T1 tümör hücrelerinden farklıydı. Beş pasajdan fazla izlenen FAP ifadesi, birincil CAF kültürünün orijinal özelliklerini koruduğunu doğrulamaktadır.
Mikrobeadlarla inkübasyonların süresi ve sıcaklığı korunmadığında, izole kültür arasında farklı morfolojiye sahip klonlar bulundu. Bu kirletici hücreler daha hızlı büyüdü ve birincil CAF kültürüne üstün geldi. İnsan Ferritin Hfn-FAP fonksiyonelleştirilmiş nano ilaç ile bağlayıcı CAL'ler, çıplak HFN'ye kıyasla bire bir ve bire beş antikor parçası konsantrasyonlarını üç kat artırdı.
Aksine, tümör 4T1 hücreleri için çıplak HFN fonksiyonel HFN'den daha yüksek bağlayıcılık gösterdi. İzole CAF'ın verim safsızlığını artırmak için tamponları soğuk tutun, boncuklarla kuluçka süresine saygı gösterin ve son zenginleştirme adımından önce kolon başına dört tümör çekin. İzole EDILMIŞ CAL'ler, preklinik in vivo deneylerine devam etmeden önce bağlama, alma ve farmakolojik etkinlik açısından birkaç aday nano ilacı taramak için kullanılabilir.
CAF izolasyonu, nanopartiküllerin tümör mikroçevrimini hedeflemek için kullanılıp kullanılabileceğini test etmemizi sağladı. Böylece kemoterapi ile sinerji içinde çalışan yeni hedefe dönük tedavilerin yolu açilmiş oldu.
