Biz değerli katkıları için Şekil 3 ve Dr Jonas Bergquist için veri katkıda bulunmak için, Hanna Warner teşekkür ederiz. İsveç Araştırma Konseyi (Hibe 522-2006-6416 (MA) 521-2007-5407 (MA); Åke Wiberg Vakfı (MA, JH), İsveç Kraliyet Bilimler Akademisi (MA, JH) ve İsveç Kimyasal Derneği (JH) minnetle mali destek için kabul edilmiştir.

Protokolü, genellikle birden fazla sıçan beyin kesitleri, 20-30 bölümleri ile MALDI IMS verilerine istatistiksel analiz amaç için ayarlanabilir ve doku hazırlanması oluşan beş farklı adımlardan oluşur, matris uygulaması, MALDI-TOF MS analizleri, veri değerlendirme, ve nöropeptid tanımlama. Prosedürler özetlenen ve aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir: 1. Doku hazırlık Bu prosedür, ilgili doku örneklerinin toplanması gibi doku IMS analizi için kesit içerir. Proteolitik degradasyona önlemek için belirli bir amacı, bir protein ve peptid analizi. Bu nedenle doku diseksiyonu sırasında hızlı ve gayretli çalışmak esastır. <ol><li> Dekapitasyon yoluyla sıçan (genellikle 250-300 g) Kurban, -80 ° C derin dondurucuda aktarmadan önce toz kuru buz &lt;30&#39;lu ve dondurma maksimum post-mortem bir süre içinde sıçan beyin kaldırın. Sıvı azot kullanarak daha hızlı dondurulmasımatriks kristalizasyon olumsuz etkileyecektir beyin dokusu, microtears riskini artırabilir ve böylece MS kalitesini düşürür (Şekil 2D). Tüm beyinler MS sinyal kalitesi kaybı olmadan kesit önce birkaç yıl boyunca saklanabilir. </li><li> 12 mikron dilimleri ve çözülme-mount doku kesitlerinde iletken MALDI cam slaytlar (indiyum kalay oksit kaplı slaytlar Bruker Daltonics,) ya da MALDI hedef (Şekil 2A-C) bir kriyostat mikrotom dondurulmuş doku kesin. </li><li> -80 Vakum altında 15 dakika ve mağaza slaytlar Kuru bölümleri ° C daha sonra kullanmak kadar. -80 De bile saklanan doku kesitleri, kesit sonra mümkün olan en kısa süre içerisinde analiz edilmelidir ° C Biz MS sinyal kalitesini belirgin bir yıl depolamadan sonra azalacaktır bulabilirsiniz. Proteinler ve peptitler oksidasyon azaltmak amacıyla, depolama konteyner içindeki havanın, inert bir gaz (örneğin argon veya nitrojen) ile ikame edilebilir. </li></ol> 2. Matrix uygulama Matris uygulamasıadım, spektrum kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ve doku tür yanı sıra ilgi analit bağlı olarak birden fazla parametre optimizasyonu gerektirir. Bu faktörler, matris tür bir matris konsantrasyonu, pH, doku yıkama ve organik değiştiriciler aletsel ayarları depozitosu hacmi, 10 depolanmalar yanal çözünürlük ve sayısını (Şek. 2B) dahil olmak üzere yanı sıra gibi kimyasal parametreleri içerir. Büyük ölçekli deneyler için, örneğin bir gün içinde tüm bölümlerine matris uygulanarak ve aynı operatör tarafından azaltmak için, varyans analizi, büyük önem taşımaktadır. Yüceltme veya spreyi, küçük matris damlacıklarının dizilerin otomatik birikimi, tarafından, büyüklüğü 100-150 picolitre hakkında çeşitli dokularda küçük protein ve nöropeptid analizi için başarıyla kullanılmaktadır matris çözümü uygulamak amacıyla birçok strateji olmasına rağmen , beyin bölümlerde 9, 10,11, 12, 13 dahil olmak üzere. <ol><li> 1 saat için bir desikatöre buzunu kesitlerbizim. </li><li> Deney operatör daha başka bir kişi tarafından kör olduğundan emin olun. Re-etiket örnekleri. </li><li> 10 sn için% 70&#39;lik etanol (EtOH, oda sıcaklığında, RT) bölümleri, yıkayıp 1x ve iki kez% 95 10 sn için EtOH (RT). Büyük deneyler için, yıkama için tüm cam gerçekleştirmek varyasyon en aza indirmek için bir küvet kullanılarak bir araya kayarak. </li><li> 10 dk için bir desikatöre bölümlerde kurutun. </li><li> Doku kesitleri mikroskop altında değerlendirilmesi ve, MALDI MS kalitesi (Şekil 2D) bozacağına doku bozulma, microtears ve küçük çatlaklar olup olmadığını kontrol edin. </li><li> % 50 metanol, 10% 150mm, amonyum asetat (AMAC) ve suda% 0.3 triflüoroasetik asit (TFA) içinde 50 mg / mL DHB içeren taze matris çözeltisi hazırlayın. </li><li> Matrix uygulama kimyasal bir mürekkep püskürtmeli yazıcı kullanarak bir dikdörtgen desen (CHIP, Shimadzu) kesikli damlacık birikimi ile yapılır. Birinci adım, deneysel matris uygulama parametreleri analizi includi nöropeptid için optimize etmek içinng sayısını geçişte başına damlacıkların geçer. Bu deney, her dizi gibi korpus kallosum, korteks ve striatum gibi benzer beyin bölgeleri kapsayan emin yaparken, aynı doku bölümünde farklı bir uygulama parametreleri ile çoklu matris dizileri uygulayarak tarafından yapılır. Farklı beyin yapıları, özel analitler hedefleyen farklı matrisler ve farklı matris solventler spesifik analitlerin çıkarılması için gerekli ise de dahil olmak üzere, her zaman parametreleri değiştirilir aynı deneyi yapılmalıdır </li><li> Tarama doku bölümü ile cam slayt tutucu ve tutucu hizalamak. Doku bölümünde matris uygulaması için dizi tanımlayın ve mesafe nokta uzaysal çözünürlüğü, yani nokta belirtin. Kimyasal mürekkep püskürtmeli yazıcı üzerinde optimize edilmiş protokolü kullanılarak matris uygulayın. Bu deneme için aşağıdaki baskı parametreleri ile peptid görüntüleme için optimize edilmiş bir protokol kullanılır: 10 damla (100 pL / damla), 10 uygulama geçer ve d noktaya bir nokta300 um istance. </li><li> Tarama son matrisi bölümleri tespit ve kayıt için MALDI veri toplama sistemi (3.4 adım) önce resmi kaydedin. </li><li> De kullanıma kadar vakum altında bir desikatöre bölümlerde depolar. </li></ol> 3. MALDI MS veri toplama ve işleme Nöropeptidlerin MS analizi her matriks nokta 14 yazılım destekli veri toplama kullanarak,, MALDI zamanında uçuş aleti (Ultraflex II Bruker Daltonics,., Almanya) reflektör modu faaliyet yapılmaktadır. Bu nedenle doğru mekansal öğretim şarttır. Bu, MALDI optimizasyonu, satın alma ve özellikle hedef kaydı deneyler tercihen deney grupları kör olmalıdır aynı operatör tarafından yapılmaktadır esastır. Birden fazla cam slaytlar ile büyük ölçekli bir deneyde, başka bir kişi kimyasal mürekkep püskürtmeli yazıcı çalışırken MALDI deneyler, bir operatör tarafından yapılmalıdır. <ol><li> Kütle spektrometresi cam slaytlar yükleyin. </li><li> MALDI etme yöntemi, düşük moleküler ağırlıktaki bir standart kalibrasyon karışımı (Bruker Daltonics) kullanılarak kalibrasyon kontrol. </li><li> Satın alma parametrelerini optimize edin. <ol><li> MS sinyal için optimize etmek ve, komşu matris yataklarının matris ablasyonu önlemek için,, doku lazer ve optimum odak boyutu tespit edilmelidir. </li><li> Lazer enerjisi pik çözünürlüğü veya doyurarak dedektör azaltarak, taban yükseltme olmadan mümkün olduğunca çok sayıda matris mevduat olarak maksimum MS kalitesini sağlamak ayarlanır. </li><li> Sadece gürültü tespit edilir kadar matris noktaya başına çekim maksimum sayısını değerlendirmek, genellikle 1000-2000 çekim. Birikmiş olmalı ve bir spot içinde lazer pozisyonundan önce satın çekim numarasını değiştirmek gerekir çekim sayısını tahmin. Her matris nokta eşit örneklemek için, bir ran kullanarak 24 basamaklı olmak üzere toplam 25 atış adımda 600 çekim birikirhareket özgürlüğü desen, her matriks birikimi. </li></ol></li><li> Kayıt, MALDI aşamasında motor FlexImaging kullanarak koordinatları (v.2.0) 10 tüm lekeli bölümden tarama ve veri toplama AutoXexuteBatchRunner.exe yazılım toplu modunda gerçekleştirmek. </li><li> Bazal çıkarma (Konveks gövde V3), yumuşatma ve bir ASCII dosyası (*. Dat, *. Txt veya *. Csv formatında) ihracat takip harici kalibrasyon (isteğe bağlı) sayesinde, tek tek her spektrumları işleyin. 15 </li></ol> 4. Verilerin değerlendirilmesinde Final veri değerlendirme, sadece zirve bilgi, istatistiksel analiz takip odaklanmak sonrası kısıtlı veri işleme ve veri azaltma oluşmaktadır. <ol><li> Bir ilk adım olarak, MALDI IMS bölümleri overnormalization etkileri değerlendirildi. Bu veri görselleştirme, böyle FlexImaging (Bruker Daltonics) veya BioMap (Novartis) gibi araçlar kullanılarak kolaylıkla elde edilebilir. Bir ilk adım olarak toplam iyon görüntüleri evatoplam iyon akımı (EFT) normalleştirme önce luated, çeşitli önde gelen peptid zirveleri tek iyon dağıtım görüntüleri elle muayene ile takip etti. Karakteristik tepe yoğunluğu dağıtımları için bak ve kalite veya normalleşme etkiler (Şekil 3) lekelenme, doku özellikleri (tazminat) ilgili. </li><li> Histolojik özellikleri göre çıkarlarının bölgelerde (striatum örneğin) tasvir ve ASCII dosya biçiminde karşılık gelen spektrumları ihracat. Tercihen, bu aşamada,, toplam iyon akımı (TIC) spektrumları normale yapılabilir. </li><li> Böyle bir Menşei olarak veri işleme yazılımı (v.8.1 Originlab), MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ABD) veya R 16 ASCII dosyalarına alma. Tepe tespiti örneğin Köken ya da Matlab &quot;mspeaks&quot; &quot;zirve analizi&quot; için yazılıma dahil tepe bulma araçları kullanılarak yapılabilir. Tek bir sekme ayrılmış metin dosyası olarak dışa aktarın. Tüm spektrumu peaklists de </li><li> Tespit peptid bin sınırları belirlemek amacıylazirveleri, binning analizi uygun yazılım araçları kullanılarak (örn. pbin 17) ya da in-house MATLAB veya R için komut dosyası yazılı tüm pik içeren tek bir metin dosyası veri aldı yazılımı yüklenir ve pik sınır belirlenmesi için bir parametre belirtilmemişse deney için ilgili olduğu için bir zirve spektrumları mevcuttur ne sıklıkta olmalıdır gibi. Örneğin, deneyi, hayvanların 2 grupları, (5) her gruptaki hayvanların, ve her bir hayvan ve ilgi bölgenin toplanan 100 spektrası içerir. Hayvanların bir grup, (3/5) ve bu hayvanlarda spektrumları (3x50 = 150 spectra) en az yarısı, en azından büyük çoğunluğu mevcut ise, potansiyel olarak ilginç bir tepe varsayınız, toplam yüzdesi verecek için% 15, toplam 1000 (2x5x100) spektrumları 150 olumlu spektrumları dışarı. Pbin aracını kullanarak, bu adımı, bin genişlikleri elde edilen verilerin belirlenen tüm içeren tek bir binrange dosya verir. O bin sınırları doğrulamak içinuygun olan, bunun özgün spektrası izleri ile birlikte konteynerleri görselleştirmenizi Origin kolaydır. </li><li> Pik alan entegrasyonu, istatistiksel analiz için önemlidir varyans azaltabilir. 4. adımda belirlenen pik sınırları arasında eğri altında kalan alanı hesaplamak için bir in-house yazılmış betiklerin R için kullanın. Entegre pik alanları 18 yapılır SAM aracını kullanarak non-parametrik eşleştirilmemiş test yoluyla MS excel (v.2007) ve istatistiksel analiz alınır. </li></ol> 5.. Peptid tanımlama Gözlenen peptid kimliklerin Sıra doğrulama biyolojik alaka sonuçlandırmak için son derece önemlidir. Yüksek peptid konsantrasyonları 12,13 analizi bu tür için gerekli olmasına rağmen, en doğru yaklaşım, doğrudan tandem kütle spektrometresi (MS / MS) vasıtasıyla peptid parçalanma kullanarak doku kapalı gerçek yukarıdan aşağıya belirlenmesini de içerir. Düşük, clos ile bol peptid veya birden peptidler içinem / z değerleri (±% 0.5), doku analizi bozulur ve kapalı bir doku analizi bir peptidomic stratejisi kullanılarak, ekstraksiyon, ayrılması ve endojen nöropeptidlerin MS bazlı tanımlama içerir kullanılmaktadır. Burada sunulan deneme için, merkezi odak opioid peptid tespiti, bu peptidler spektrumu diğer nöropeptitlerin ile karşılaştırıldığında bol oldukça düşük olduğundan, belirli bir sorundur. Ayrıca, ortak peptid ekstraksiyonu ve ayırma teknikleri ile korumak için onları oldukça hidrofilik ve zor kılan bu peptidler yerine polar .. Bu nedenle biz, peptid kimlik 9,19 dayanarak standart LC-MS/MS birlikte doku ekstraksiyonu ve opioid peptid prefractionation için önceden bildirilen protokolü uyguladık. <ol><li> Ilgi hedef yapılara (kaudat putamen, CPU çekirdeği akumbens, NAC) koronal kesitler toplayın. Bir kriyostat mikrotom Mount donmuş sıçan beyin ve çevreleyen beyin malzeme çıkarmak (kortex, bir neşter ile septum, korpus kallosum). Disseke NAC CPU ve çözülme NAC ve farklı cam slaytlar bölümden CPU parçalar monte; bölümler (n = 50 30 mikron) toplayın. </li><li> Iki dakika inkübe 100 mcL% 5 ACN/0.1% TFA ekleyerek doku kapalı peptidler ayıkla ve eppendorf düşük protein bağlayıcı tüpler içinde toplamak. Bu adım iki kez tekrarlayın. </li><li> Peptid prefractionation güçlü katyon değişim kromatografisi vasıtasıyla, artan iyonik kuvveti 19 stepwise (n = 4), elüsyon kullanılarak gerçekleştirir. Vakum altında bir speedvac konsantratörü kullanan numuneler kurulayın. </li><li> Nanoflow C18 ters faz sıvı kromatografisi, elektrosprey tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) arabirim sayesinde (1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) tarafından peptid fraksiyonları analiz edin. MS deneyler, lineer iontrap / Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans (FTICR) melez bir cihaz (LTQ FT 7T, Thermo Scientific, Waltham, MA) Peptid fulscan spektrumu (m / z 150 tarihinde yapıldı-2000), Müteakip, çarpışma endüklenen, ayrışma (CID) 9 yoluyla iontrap 5 en yoğun bir peptid zirveleri fragmentasyonu tarafından takip yüksek kütle çözünürlüğü (100,000) FTICR analizörü ile elde edilmiştir. </li><li> Peptide sekansı tanımlama veri tabanında eşleme tarafından gerçekleştirilir ve de novo dizi analizi ile tamamlanır edilebilir. Veritabanı arama için, piyasada bulunan arama motorları (Mascot, XTandem veya Protein fırsatçı) 20 istihdam edilmektedir. Aramalar genellikle bilinen veya tahmin nöropeptid ve nöropeptid habercisi proteinlerinin 21 dizileri dizileri içeren veritabanlarına karşı yapılmaktadır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Burada tarif edilen protokol, tekabül eden yaklaşık 300 Monoizotopik molekül türü (gösterilen ortalama spektrası için 1.000 &#39;den daha fazla zirveleri tespiti ile sonuçlanmıştır göre hazırlanan striatal doku bölümlerini MALDI görüntüleme kitle spektrometrisiŞek. 1). Önde gelen moleküler iyon pikleri için veri görselleştirme Flex Görüntüleme yazılımı kullanarak elde etti ve anatomik özellikleri (Şekil 3) ile uyumlu iyi karakteristik pik şiddetlerinin dağılımı gösterdi. MALDI IMS bir diğer özelliği de görece iyi tekrarlanabilirlik. Bu deney,% 30 tepe noktası tespit edilen tüm molekül türü yoğunlukları için, varyans genel katsayısı, ama birçok zirveleri çok düşük bir varyasyon ve tedavi grupları (Şek. 4) içinde yüksek tekrarlanabilirlik görüntülenir. Ilgi hem lezyonlu ve sağlam striata dorsolateral ve dorsomedial bir bölümü dahil olmak üzere dört farklı bölgede, relatif zirve yoğunluğu verileri istatistiksel analize tabi tutuldu. Aynı anda çoklu karşılaştırmalar için ayarlamak için, istatistiksel analiz, 18 SAM aracı kullanarak parametrik olmayan test yoluyla yapıldı. En belirgin değişiklikler, dopamin Denerve, parkinson striatum dorsolateral parçası bulundu. İşte si<html> , dynorphin B ve alfa-neoendorphin (Şekil 5); farklı tedavi grupları arasında orada önemli değişiklikler iki dynorphin peptidler için gözlenmiştir. Ayrıntılı olarak, hem dynorphin pik şiddetleri% 50-60 oranında göreceli bir artış, düşük, diskinetik hayvanlar ve lezyon denetimleri (karşılaştırıldığında yüksek diskinetik hayvanlarda gözlendi p &lt;0.05, F (2, 15) = 12.8 DynB, F = 5.7 aNeo; Şekil 5). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig1.jpg" /> Kaudat putamen (CPU) ve nükleus akumbens (NAC); Şekil 1 Ortalama MS iki striatum yakından ilişkilidir bölgelerden elde izler. Iki bölgede benzersiz bir bölgede ifade bazı moleküler türleri ile farklı MS profillerin görüntülemek veya farklı tepe yoğunluğu seviyelerde (insert, m / z 2028). Her tepe mekansal dağılım deseni, özel bir görüntüleme yazılımı (alt panel) kullanılarak görüntülenebilir. &quot;2.jpg /&gt; Şekil 2 (A), beyin, bir gömme medya (OTC; ok) kullanılarak bir kriyostat chuck üzerine monte edilir., Tezgah üstü beynin kesitli, peptidlerin OTC nedeni iyon supresyon yana olmak alanında kontamine gelmez özen. (B, C) İnce bölümler (≈ 12 mikron kalınlığında) çıplak gözle tespit etmek zor olabilir, MALDI uyumlu cam Slaytlarınıza çözülme monte ve C. (D) Microtears görüldüğü gibi, donma hasarı önlemek için birkaç saniye için kurutuldu ama MALDI matris kristalizasyon bozan ve MALDI MS sinyal yoketmek. , Cresyl menekşe ile boyanarak aynı bölümde microtears ve çatlaklar (sağ alt fotomikrografıdır) ortaya koymaktadır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig3.jpg" /> Şekil 3 Verilerin değerlendirilmesinde ilk adım (AI) analiz kütle aralığı boyunca birkaç farklı zirveleri görselleştirmek için. Burada, 9 farelerin striatal bölümlerde, MALDI MS ile görüntülendi. Ortalama toplam Görselleştirme imevcut alanlarda göze çarpan yüksek veya düşük iyon yoğunlukları (oklar) ortaya çıkaracaktır. Bu alanlar üzerinde veya altında normalleşme etkileri ve sonuçları ödün deforme veri analizi tarafından etkilenebilir. Kötü anatomik pik dağılımları tanımı I. aracılığıyla, örneğin bölüm 3 ve 9, genellikle düşük tepe sinyal-gürültü ile zirveleri F bölümleri ortaya <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig4.jpg" /> Şekil 4 tedavi grupları arasında MS tekrarlanabilirlik ortalama MS iz ve her m / z değeri (ekler, m / z 722 ve 1749) için standart hata hesaplanırken değerlendirilebilir. İyi tekrarlanabilirlik geçerli istatistiksel analiz sağlar. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3445/3445fig5_lg.jpg"><img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3445/3445fig5.jpg" /></a> Şekil 5 dynorphin B ve, alfa neoendorphin pik şiddetlerini, 6-OHDA, önemli ölçüde artmıştırLezyonlu, parkinsona, yüksek-diskinetik hayvanların striatum (HD; oklar), düşük-diskinezi (LD) ve lezyon kontrol grubuna (LC) için karşılaştırılmıştır. Peptid pik şiddetlerini, sağlam tarafın ortalama kat-değişim ± SEM (intakt / lezyon tarafı) olarak ifade edilir. * P &lt;0.05; cx korteks; cc korpus kallosum. Ölçek çubuğu 5 mm.

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li><li>O, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster,+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department,+Ageing+and+Life+Course.">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course.</a> Active Ageing: A Policy framework. , (2002).</li><li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+disorders:+advances+in+cause+and+treatment.">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. , 6-7 (2010).</li><li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson's+disease:+problems+with+the+current+model.">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, S22-S32 (2000).</li><li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA.">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li><li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li><li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry.">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. , (2011).</li><li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+directly+from+tissue:+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry.">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides:+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li><li>Deininger, S. -. O., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).</li><li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis.">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li><li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics.">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li><li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response.">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li><li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P.">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides.">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwePep,+a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry.">SwePep, a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li></ol>

Yazarlar, ifşa etmek için bir şey var.

, Nöropeptidlerin çalışma olarak MALDI görüntüleme kütle spektrometresi istihdam çeşitli avantajları vardır. MS verilerin tarafsız bir analizi sadece belirli beyin çekirdekleri ortaya, ya da, striatum sadece dorsolateral kısmı belirli bir patofizyolojik durum ile ilişkili olduğu, burada sunulan sonuçlar. Mekansal bilgi istinat tarafından ilgi alanları yeniden tanımlamak için tüm beyin bölümlerinin analizi veya peptid ekstraklar geleneksel peptidomics çalışmaları kullanılarak ile karşılaştırıldığında daha yüksek hassasiyet ve daha düşük değişkenliği ile istatistiksel analiz yapmak mümkündür. Buna ek olarak,, MALDI IMS kolayca önceden bilinmeyen post-translasyonel modifikasyonlar tespit gerçekleştirmek için önemlidir, ancak yapısal analizler değiştirilmiş tam amino asit pozisyonları belirlemek için izlemeniz gereken. MALDI IMS veri görselleştirme ortak tuzaklar, bl doğrusal bir optik ölçekli maksimum tepe yoğunluğu haritalama(% 0) ack renk arasında deneysel serisi yerine ortak bir mutlak ölçek bölümlerden maksimum zirve yoğunluğu% 100 burada tüm bölümlerde eşleyerek ve her bölümü (Şekil 3), (% 100) (Şekil 5) . Ikinci yöntem grubu verileri ile karşılaştırılması ve tedavi grupları arasında farklılıklar görselleştirme sağlar. , MALDI IMS analizinde önemli bir engel belirli kitle doruklarına peptidlerin atama. Doku tandem-kütle spektrometresi bazen mümkün olabilir, ama genellikle 13,14 oldukça zor oluyor. Izledi güçlü katyon değişim kromatografisi, ters çevrilir faz LC-MS/MS tarafından bir preparatif fraksiyonasyon da dahil olmak üzere, geleneksel bir yaklaşım, başarıyla sekansı birçok nöropeptidler ve opioid peptidler, özellikle de kullanılabilir. MASCOT gibi sık kullanılan arama motorlarını kullanarak herhangi bir veritabanı girdilerinin eşleşmiyor kaliteli MS / MS spektrumları elde etmek için yine de nadir değildir. Bu durumlarda el ile de novo-sıralama only seçeneği. MALDI uygun tırnakları fare doku bölümleri IMS tarafından, pik kimlik nihai kanıtı elde edilebilir, ancak bu her zaman mümkün değildir. Bir alternatif diametrik farklı bir yöntem, örneğin, batı immunoblotting veya imünohistokimya ile doğrulamak için. Bu, genellikle yükselterek antikorlar ve eser yeni antikorlar doğrulanması önemli bir miktarını içerir. Bu protokol sunulan genel stratejisi, çeşitli bölümler ve deneysel koşullar da dahil olmak üzere büyük ölçekli nöropeptid MALDI IMS deneyleri için optimize edilmiştir. Altta yatan mekanizmalar ağrı ve uyuşturucu bağımlılığı endojen yanıt dahil olmak üzere araştırma farklı alanlarda istihdam protokolü, özellikle opioid peptidler için optimize edilmiş ve gelecekteki çalışmalarda büyük etkisi olacaktır.

1.1 örnek toplama ve hazırlama <ol><li> İsofluranın (Apoteksbolaget AB, İsveç) </li><li> Cerrahi aletler; iki çift makas, bir rongeur, spatula </li><li> İnce ezilmiş kuru buz </li><li> Alüminyum folyo ve depolama için plastik torbalar </li><li> Kriyostat (Microm, Heidelberg, Almanya) </li><li> Indiyum kalay oksit (ITO) kaplı MALDI slaytlar (Bruker Daltonics, Almanya) </li><li> optimum kesim sıcaklığı orta (OCT) (, Sakura Finetek Avrupa, Hollanda) </li><li> vakum desikatöre </li></ol> 1.2 Matrix uygulama <ol><li> Asetonitril (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) pro-analizi dereceli (Merck, Almanya). </li><li> Trifloroasetik asit (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> Su bir Milli-Q saflaştırma sistemi (Millipore, Bedford, MA) ile saflaştırılmıştır. </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japonya) veya Dikey 630 gözcü (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1.3 Kütle spektrometrisi <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> FlexImaging yazılımı (v 2.0 Bruker Daltonics,) </li><li> Peptid veya protein Kalibrasyon Standart (Bruker Daltonics) </li></ol> 1.4 Veri işleme <ol><li> Kökeni v.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab sürümü 7.9.0.529 (MathWorks, Natick, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1.5 Nöropeptit tanımlama <ol><li> Ultrason sonikatör </li><li> 10 kDa moleküler ağırlık cut-off filtresinden (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C&#39;de 25 jel (Sigma, Almanya) </li><li> Hypersil sütun (ThermoFisher) </li><li> Piridin, formik asit, pro-analizi dereceli (FA) Asetonitril (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) (Merck, Almanya). </li><li> Trifloroasetik asit (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). </li><li> Agilent 1100 nanoflow LC, microWPS, C18 kolon (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 Mikro-fractioncollector, Prespotted anchorchip hedef plakası (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools yazılımı (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Biyografi Eserleri yazılım (v.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Maskot yazılımı (v 2.2, MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep veritabanı ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

maldi imaging mass spectrometry of neuropeptides in parkinson's disease

MALDI görüntüleme kütle spektrometresi (IMS) moleküler türlerin biyolojik doku örnekleri 2 (Şekil 1) mekansal analiz kolaylaştıran güçlü bir yaklaşım. 12 mikron ince bir doku bölümünde tipik bir MALDI TOF / TOF kütle spektrometresi kullanarak, sağlam bir kitle analizi ile tespit edilebilir peptitler ve proteinlerin desorpsiyon ve iyonizasyon kolaylaştıran bir matris, MALDI ile kaplıdır. Genellikle tek bir fare beyin dokusunda bölümünde zirveleri yüzlerce değerlendirilebilir. Yaygın olarak kullanılan görüntüleme tekniklerinin aksine, bu yaklaşım ilgi moleküllerin ön bilgi gerektirmeyen ve yüksek molekül özgüllüğü ve duyarlılığı 2 korurken, birden fazla moleküler türlerin denetimsiz ve kapsamlı bir analiz sağlar. Burada bir hayvan modeli Parkinson hastalığı (PH) sıçan beyinde ortaya çıkması için, nöropeptidlerin bölgeye özgü dağıtım profilleri MALDI IMS tabanlı yaklaşımı açıklar. PD prevalansı% 1 3,4 yaş 65 yaş üstü insanlar için ortak bir nörodejeneratif bir hastalıktır. En yaygın semptomatik tedavi dopamin replasman 5 L-DOPA ile dayanmaktadır. Ancak bunun yanında şiddetli yan etkilere istemsiz olarak adlandırılan, L-DOPA ile endüklenen diskinezilerinin (KAPAKLI) 1,3,6, anormal hareketleri, eşlik etmektedir. KAPAKLI en önde gelen moleküler değişim Bir upregülasyonu, mRNA 7 opioid habercisi prodynorphin bir. Dynorphin peptidler hareketi kontrolü 7,8 esas alan beyin alanlarında nörotransmisyonu modüle. Ancak,, nöropeptid habercisi işleme menşei tam opioid peptidler, bugüne kadar henüz tanımlanmamıştır. Bu nedenle, deneysel Parkinson hastalığı ve L-DOPA bağlı diskinezi bir hayvan modeli MALDI IMS kullandı. MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi nöropeptid Örneklerin açısından özellikle avantajlıdır olduğu kanıtlanmıştırTION, yaygın olarak kullanılan antikor temelli yaklaşımlar beri bilinen peptit dizileri ve daha önce gözlenen post-translasyonel modifikasyonlar hedefliyor. MALDI IMS aksine yeni peptid işleme ürünleri çözmeye ve böylece yeni moleküler nöronal iletim nöropeptit modülasyonu mekanizmaları ortaya koymaktadır. Nöropeptidlerin mutlak miktarı, MALDI IMS tarafından belirlenir mümkün olmasa bile,, peptit iyonların göreceli bolluk, sağlık ve hastalık düzeyleri değiştirme hakkında anlayışlar veren kitle spektrumu tarif edilebilir. Burada sunulan örnekler, dynorphin B, alfa-neoendorphin ve P maddesi pik şiddetlerini dorsolateral önemli ölçüde artmış olarak bulundu, ancak ciddi diskinezi ile, hayvanların dorsomedial, striatum (Şekil yüz, gövde ve orolingual kasları içermeyen 5). Ayrıca, MALDI IMS, fonksiyonel inacti daha önceden bilinmeyen bir mekanizma temsil eden,, diskinezi şiddeti ve alfa-neoendorphin des-tirozin düzeyleri arasında bir ilişkiyi ortaya, N-terminal tirozin çıkarılması gibi striatum içinde dynorphins vation dynorphin, opioid-reseptör bağlanma kapasitesi 9 azaltır. Bu, MALDI IMS ve sonuçları biyomedikal araştırmanın bütün alanlarında uygulama için teknik potansiyeli vurgulamak kullanarak KAPAKLI nöropeptit karakterizasyonu üzerine ilk çalışmadır.

Watch this Scientific Journal Video about MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease at JoVE.com

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

Dopamin değiştirme farmakoterapi L-DOPA ile Parkinson hastalığının en yaygın olarak kullanılan semptomatik tedavi, anormal istemsiz hareketleri olarak adlandırılan diskinezi dahil olmak üzere, yan etkileri ile birlikte<sup&gt; 1</sup&gt;. Burada,, MALDI görüntü kütle spektrometresi için bir protokol, diskinezi ilgili sıçan beyin nöropeptid düzeyleri değişiklikleri algılar sunulmaktadır.

Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

maldi-imaging-mass-spectrometry-neuropeptides-parkinson-s

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

25.9K Görüntüleme.  Uppsala University. Dopamin değiştirme farmakoterapi L-DOPA ile Parkinson hastalığının en yaygın olarak kullanılan semptomatik tedavi, anormal istemsiz hareketleri olarak adlandırılan diskinezi dahil olmak üzere, yan etkileri ile birlikte 1. Burada,, MALDI görüntü kütle spektrometresi için bir protokol, diskinezi ilgili sıçan beyin nöropeptid düzeyleri değişiklikleri algılar sunulmaktadır.

Video: MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our understanding of the mechanisms underlying parkinsonian symptoms, since it recapitulates the changes in basal ganglia circuitry and pharmacology observed in parkinsonian patients1-4. However, the precise cellular and molecular changes occurring at cortico-striatal synapses of the output pathways within the striatum, which is the major input region of the basal ganglia remain elusive, and this is believed to be site where pathological abnormalities underlying parkinsonian symptoms arise3,5.
In PD, understanding the mechanisms underlying changes in basal ganglia circuitry following degeneration of the nigro-striatal pathway has been greatly advanced by the development of bacterial artificial chromosome (BAC) mice over-expressing green fluorescent proteins driven by promoters specific for the two striatal output pathways (direct pathway: eGFP-D1; indirect pathway: eGFP-D2 and eGFP-A2a)8, allowing them to be studied in isolation. For example, recent studies have suggested that there are pathological changes in synaptic plasticity in parkinsonian mice9,10. However, these studies utilised juvenile mice and acute models of parkinsonism. It is unclear whether the changes described in adult rats with stable 6-OHDA lesions also occur in these models. Other groups have attempted to generate a stable unilaterally-lesioned 6-OHDA adult mouse model of PD by lesioning the medial forebrain bundle (MFB), unfortunately, the mortality rate in this study was extremely high, with only 14% surviving the surgery for 21 days or longer11. More recent studies have generated intra-nigral lesions with both a low mortality rate &gt;80% loss of dopaminergic neurons, however expression of L-DOPA induced dyskinesia11,12,13,14 was variable in these studies. Another well established mouse model of PD is the MPTP-lesioned mouse15. Whilst this model has proven useful in the assessment of potential neuroprotective agents16, it is less suitable for understanding mechanisms underlying symptoms of PD, as this model often fails to induce motor deficits, and shows a wide variability in the extent of lesion17, 18.
Here we have developed a stable unilateral 6-OHDA-lesioned mouse model of PD by direct administration of 6-OHDA into the MFB, which consistently causes &gt;95% loss of striatal dopamine (as measured by HPLC), as well as producing the behavioural imbalances observed in the well characterised unilateral 6-OHDA-lesioned rat model of PD. This newly developed mouse model of PD will prove a valuable tool in understanding the mechanisms underlying generation of parkinsonian symptoms.

A protocol for performing unilateral 6-OHDA lesions of the medial forebrain bundle in mice is described. This method has a low mortality rate (13.3 %) with 89% of the surviving animals showing &#62;95% loss of striatal dopamine and 90.63&#177;-4.02 % ipsiversive rotational bias towards the side of the lesion.

Parkinson Hastalığının tek taraflı lezyonlanmıştır 6-OHDA Mouse Model Geliştirme

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

Tıp

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Parkinson Hastalığında Maskeyi Düşürme Duyarlılık Mekanizmalarına Gen-Çevre Etkileşim Modelleri

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Controlling Parkinson's Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time according to fluctuating disease and medication state. In the present realization of adaptive DBS we record and stimulate from the DBS electrodes implanted in the subthalamic nucleus of patients with Parkinson&#39;s disease in the early post-operative period. Local field potentials are analogue filtered between 3 and 47 Hz before being passed to a data acquisition unit where they are digitally filtered again around the patient specific beta peak, rectified and smoothed to give an online reading of the beta amplitude. A threshold for beta amplitude is set heuristically, which, if crossed, passes a trigger signal to the stimulator. The stimulator then ramps up stimulation to a pre-determined clinically effective voltage over 250 msec and continues to stimulate until the beta amplitude again falls down below threshold. Stimulation continues in this manner with brief episodes of ramped DBS during periods of heightened beta power.
Clinical efficacy is assessed after a minimum period of stabilization (5 min) through the unblinded and blinded video assessment of motor function using a selection of scores from the Unified Parkinson&#39;s Rating Scale (UPDRS). Recent work has demonstrated a reduction in power consumption with aDBS as well as an improvement in clinical scores compared to conventional DBS. Chronic aDBS could now be trialed in Parkinsonism.

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) is effective for Parkinson&#8217;s disease, improving symptoms and reducing power consumption compared to conventional deep brain stimulation (cDBS). In aDBS we track a local field potential biomarker (beta oscillatory amplitude) in real time and use this to control the timing of stimulation.

Adaptif Derin Beyin Stimülasyonu İle Parkinson Hastalığı kontrol

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

İskelet Kası Hastalığının kantitatif Manyetik Rezonans Görüntüleme

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a specific anatomical region. Within the brain, metals have a highly compartmentalized distribution, depending on the primary function they play within the central nervous system. Imaging the spatial distribution of metals has provided unique insight into the biochemical architecture of the brain, allowing direct correlation between neuroanatomical regions and their known function with regard to metal-dependent processes. In addition, several age-related neurological disorders feature disrupted metal homeostasis, which is often confined to small regions of the brain that are otherwise difficult to analyze. Here, we describe a comprehensive method for quantitatively imaging metals in the mouse brain, using laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) and specially designed image processing software. Focusing on iron, copper and zinc, which are three of the most abundant and disease-relevant metals within the brain, we describe the essential steps in sample preparation, analysis, quantitative measurements and image processing to produce maps of metal distribution within the low micrometer resolution range. This technique, applicable to any cut tissue section, is capable of demonstrating the highly variable distribution of metals within an organ or system, and can be used to identify changes in metal homeostasis and absolute levels within fine anatomical structures.

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Quantitatively mapping metals in tissue by laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) is a sensitive analytical technique that can provide new insight into how metals participate in normal function and disease processes. Here, we describe a protocol for quantitatively imaging metals in thin sections of mouse neurological tissue.

İndaktif Plazma - - Lazer Ablasyon Beyin Dokusu Görüntüleme Metaller Kütle Spektrometresi (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

Whole-brain Segmentation and Change-point Analysis of Anatomical Brain MRI&#8212;Application in Premanifest Huntington's Disease

Recent advances in MRI offer a variety of useful markers to identify neurodegenerative diseases. In Huntington&#39;s disease (HD), regional brain atrophy begins many years prior to the motor onset (during the &#34;premanifest&#34; period), but the spatiotemporal pattern of regional atrophy across the brain has not been fully characterized. Here we demonstrate an online cloud-computing platform, &#34;MRICloud&#34;, which provides atlas-based whole-brain segmentation of T1-weighted images at multiple granularity levels, and thereby, enables us to access the regional features of brain anatomy. We then describe a regression model that detects statistically significant inflection points, at which regional brain atrophy starts to be noticeable, i.e. the &#34;change-point&#34;, with respect to a disease progression index. We used the CAG-age product (CAP) score to index the disease progression in HD patients. Change-point analysis of the volumetric measurements from the segmentation pipeline, therefore, provides important information of the order and pattern of structural atrophy across the brain. The paper illustrates the use of these techniques on T1-weighted MRI data of premanifest HD subjects from a large multicenter PREDICT-HD study. This design potentially has wide applications in a range of neurodegenerative diseases to investigate the dynamic changes of brain anatomy.

This paper describes a statistical model for volumetric MRI data analysis, which identifies the &#34;change-point&#34; when brain atrophy begins in premanifest Huntington&#39;s disease. Whole-brain mapping of the change-points is achieved based on brain volumes obtained using an atlas-based segmentation pipeline of T1-weighted images.

Bütün beyin segmentasyon ve değişim noktası analizi anatomik beyin MR'ı — uygulama Premanifest Huntington hastalığı

Recent advances in MRI offer a variety of useful markers to identify neurodegenerative diseases. In Huntington&#39;s disease (HD), regional brain atrophy ...