Nous remercions Hanna Warner pour contribuer les données de la figure 3 et le professeur Jonas Bergquist pour une contribution précieuse. Le Conseil de recherche suédois (Grant 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA); Fondation Le Wiberg Åke (MA, JH), L&#39;Académie royale suédoise des sciences (MA, JH), et des produits chimiques suédoise Société (JH) sont remerciées pour le soutien financier.

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. 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L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. 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O., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).</li><li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis.">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li><li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics.">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li><li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response.">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li><li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P.">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. 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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Il ya plusieurs avantages à l&#39;emploi de la spectrométrie de masse MALDI imagerie dans l&#39;étude des neuropeptides. Une analyse impartiale des données MS peut révéler que les noyaux du cerveau seulement spécifique, ou, comme dans les résultats présentés ici où seule la partie dorsolatérale du striatum est associée à une certaine condition physiopathologique. En conservant l&#39;information spatiale, il est alors possible de redéfinir les régions présentant un intérêt pour effectuer des analyses statistiques avec une plus grande sensibilité et une plus faible variabilité par rapport à l&#39;analyse de coupes de cerveau entier ou en utilisant les études traditionnelles sur Peptidomics extraits peptidiques. En outre, il est important de réaliser MALDI IMS permet de détecter facilement jusque-là inconnues modifications post-traductionnelles, mais les analyses structurelles doivent suivre pour déterminer les positions exactes des acides aminés qui sont modifiés. Pièges les plus courants dans la visualisation des données MALDI IMS comprennent la cartographie, l&#39;intensité du pic maximum à une échelle linéaire optique de black (0%) à la couleur (100%) pour chacune des sections de la série expérimentale (Figure 3), au lieu de mapper toutes les sections à une échelle commune absolue, où 100% est le pic d&#39;intensité maximale de toutes les sections (Figure 5) . Cette dernière méthode permet une comparaison des données du groupe et la visualisation des différences entre les groupes de traitement. Un obstacle majeur à l&#39;analyse MALDI IMS est la cession de peptides à des pics de masse spécifiques. Sur des tissus en tandem de spectrométrie de masse est parfois possible, mais se révèle souvent très difficile 13,14. Nous constatons que l&#39;approche plus traditionnelle comprenant un fractionnement préparatif sur une forte chromatographie par échange cationique, suivi par LC-MS/MS en phase inverse peut être utilisé pour de nombreux neuropeptides séquence avec succès et en particulier des peptides opioïdes. Il est encore pas rare d&#39;obtenir une bonne qualité de spectres MS / MS qui ne correspond pas à toutes les entrées de bases de données en utilisant les moteurs de recherche communs, tels que MASCOT. Dans ces cas de novo-séquençage à la main est l&#39;ONLl&#39;option y. La preuve ultime de l&#39;identité de pointe peuvent être obtenus par MALDI IMS des coupes de tissus de la souris knock-out appropriée, mais ce n&#39;est pas toujours disponible ou possible. Une alternative consiste à valider les résultats par une méthode diamétralement différente, par exemple par immunoblot de l&#39;Ouest ou immunohistochimie. Cela peut souvent inclure des anticorps et une quantité importante de travail de la validation des nouveaux anticorps. La stratégie générale présentée dans le présent protocole est optimisé pour les grandes expériences à l&#39;échelle du neuropeptide IMS MALDI, y compris plusieurs sections et des conditions expérimentales. Le protocole a été spécialement optimisé pour les peptides opioïdes et auront un impact important dans les études futures, tel qu&#39;il est employé dans divers domaines de recherche, y compris la douleur mécanismes sous-jacents et la réponse endogène à la drogue de dépendance.

1.1 Le prélèvement d&#39;échantillons et de préparation <ol><li> L&#39;isoflurane (Apoteksbolaget AB, Suède) </li><li> Des outils chirurgicaux, deux paires de ciseaux, une pince-gouge, spatule </li><li> Finement broyées de la glace sèche </li><li> Le papier d&#39;aluminium et des sacs en plastique pour le stockage </li><li> Cryostat (Microm, Heidelberg, Allemagne) </li><li> D&#39;indium-étain (ITO)-lames recouvertes de MALDI (Bruker Daltonics, Allemagne) </li><li> optimale à température moyenne de coupe (PTOM) (Sakura Finetek l&#39;Europe, Pays-Bas) </li><li> dessiccateur à vide </li></ol> 1.2 Domaine d&#39;application Matrice <ol><li> Acétonitrile (ACN), du méthanol (MeOH), l&#39;éthanol (EtOH) de pro-analyse de qualité (Merck, Allemagne). </li><li> L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> L&#39;eau a été purifiée par un système de purification Milli-Q (Millipore, Bedford, MA). </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japon) ou Portrait 630 spotter (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1.3 La spectrométrie de masse <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> Logiciel FlexImaging (v 2.0, Bruker Daltonics) </li><li> Calibration peptide ou une protéine standard (Bruker Daltonics) </li></ol> 1.4 Le traitement des données <ol><li> Origine v.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab Version 7.9.0.529 (The MathWorks, Cambridge, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1.5 Identification des neuropeptides <ol><li> Sonicateur ultrasons </li><li> 10 kDa de poids moléculaire de coupure du filtre (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C 25 gel (Sigma, Allemagne) </li><li> Colonne Hypersil (ThermoFisher) </li><li> Pyridine, l&#39;acide formique (FA), l&#39;acétonitrile (ACN), du méthanol (MeOH), l&#39;éthanol (EtOH) de pro-analyse de qualité (Merck, Allemagne). </li><li> L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, Etats-Unis). </li><li> Agilent 1100 nanodébit LC, microWPS, colonne C18 (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 Micro-fractioncollector, plaque Prespotted cible anchorchip (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools logiciel (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Bio Travaux logiciel (V.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Logiciel Mascot (v 2.2, MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep base de données ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

maldi imaging mass spectrometry of neuropeptides in parkinson's disease

Imagerie MALDI spectrométrie de masse (IMS) est une approche puissante qui facilite l&#39;analyse spatiale des espèces moléculaires dans des échantillons de tissus biologiques 2 (Fig.1). Une coupe de 12 um de tissu mince est recouverte d&#39;une matrice MALDI, ce qui facilite la désorption et l&#39;ionisation des peptides et des protéines intactes qui peuvent être détectés avec un analyseur de masse, typiquement en utilisant une TOF MALDI / spectromètre de masse TOF. Généralement des centaines de pics peuvent être évalués dans une coupe de tissu de cerveau de rat unique. Contrairement aux techniques d&#39;imagerie utilisées couramment, cette approche ne nécessite pas de connaissance préalable des molécules d&#39;intérêt et permet d&#39;analyser non supervisée et complète de plusieurs espèces moléculaires tout en conservant sa spécificité moléculaire et de la sensibilité 2. Nous décrivons ici une approche basée sur IMS MALDI pour élucider les profils de distribution spécifiques à la région de neuropeptides dans le cerveau de rat de la maladie d&#39;un animal modèle de la maladie de Parkinson (PD). PD est une maladie neurodégénérative fréquente avec une prévalence de 1% pour les personnes de plus de 65 ans de 3,4. Le traitement le plus commun des symptômes est basée sur remplacement de la dopamine en utilisant la L-DOPA 5. Cependant ceci est accompagné par des effets secondaires graves, y compris des mouvements anormaux involontaires, appelés L-DOPA dyskinésies induites (LID) 1,3,6. Un des changements les plus important moléculaire dans LID est une régulation positive de l&#39;ARNm prodynorphine précurseur opioïde 7. Les peptides dynorphine moduler la neurotransmission dans les zones du cerveau qui sont essentiellement impliqués dans le contrôle des mouvements 7,8. Toutefois, à ce jour les peptides opioïdes exactes qui proviennent de la transformation du précurseur neuropeptide n&#39;ont pas été caractérisé. Par conséquent, nous avons utilisé MALDI IMS dans un modèle animal de la maladie de Parkinson expérimentale et la L-DOPA dyskinésie induite. Imagerie MALDI spectrométrie de masse s&#39;est avérée particulièrement avantageuse par rapport à la caractérisation neuropeptidetion, car les approches d&#39;anticorps couramment utilisés cibles basées sur des séquences peptidiques connues et observées auparavant modifications post-traductionnelles. En revanche MALDI IMS peut démêler nouveaux produits de traitement de peptides et de révéler ainsi de nouveaux mécanismes moléculaires de la modulation de la transmission neuronale neuropeptide. Bien que le montant absolu des neuropeptides ne peut pas être déterminée par MALDI IMS, l&#39;abondance relative des ions peptidiques peuvent être délimitées à partir des spectres de masse, donnant un aperçu sur l&#39;évolution des niveaux de santé et la maladie. Dans les exemples présentés ici, les intensités des pics de la dynorphine B, alpha-neoendorphin et la substance P ont été trouvés à être significativement augmentée dans le dorsolatéral, mais pas le dorsomédial, le striatum des animaux avec des dyskinésies sévères impliquant visage, le tronc et les muscles orolingual (Fig. 5). En outre, MALDI IMS a révélé une corrélation entre la sévérité de la dyskinésie et les niveaux de des-tyrosine alpha-neoendorphin, ce qui représente un mécanisme jusqu&#39;alors inconnu de la fonctionnelle inactivationvation de dynorphines dans le striatum que la suppression de la N-terminal tyrosine réduit des récepteurs opioïdes du dynorphine de la capacité de liaison 9. Il s&#39;agit de la première étude sur la caractérisation neuropeptide dans couvercle à l&#39;aide MALDI IMS et les résultats mettent en évidence le potentiel de la technique pour l&#39;application dans tous les domaines de la recherche biomédicale.

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MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Pharmacothérapie remplacement de la dopamine en utilisant la L-DOPA est le traitement le plus couramment utilisé symptomatique de la maladie de Parkinson, mais il est accompagné par des effets secondaires, y compris des mouvements anormaux involontaires, dyskinésie appelé<sup&gt; 1</sup&gt;. Ici, un protocole pour l&#39;imagerie par spectrométrie de masse MALDI est présenté qui détecte les changements dans les niveaux de cerveau de rat neuropeptide liés à une dyskinésie.

Spectrométrie de masse MALDI Imaging des neuropeptides dans la maladie de Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

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Research

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Medicine

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

25.8K vues.  Uppsala University. Pharmacothérapie remplacement de la dopamine en utilisant la L-DOPA est le traitement le plus couramment utilisé symptomatique de la maladie de Parkinson, mais il est accompagné par des effets secondaires, y compris des mouvements anormaux involontaires, dyskinésie appelé 1. Ici, un protocole pour l'imagerie par spectrométrie de masse MALDI est présenté qui détecte les changements dans les niveaux de cerveau de rat neuropeptide liés à une d...