Agradecemos Hanna Warner para contribuir os dados para a Figura 3 e Jonas Prof Bergquist de valiosa contribuição. O sueco Research Council (Grant 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA); Fundação Wiberg Åke (MA, JH), A Academia Real Sueca de Ciências (MA, JH), eo Chemical sueco Society (JH) são agradecem pelo apoio financeiro.

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. 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L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. 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Os autores não têm nada a revelar.

Existem várias vantagens do emprego de espectrometria de massa MALDI imagem no estudo de neuropeptídeos. Uma análise isenta de dados de MS pode revelar que os núcleos cérebro apenas específico, ou como nos resultados aqui apresentados, onde apenas a parte dorsolateral do estriado é associado com uma determinada condição fisiopatológica. Ao reter a informação espacial é então possível para redefinir regiões de interesse para executar a análise estatística com maior sensibilidade e menor variabilidade em comparação com a análise de secções de cérebro inteiro ou através de estudos de tradicionais peptidomics em extractos de péptidos. Além disso, é importante compreender MALDI IMS prontamente pode detectar anteriormente desconhecidos modificações pós-translacionais, mas análises estruturais devem seguir para determinar as posições de aminoácidos exactas que são modificados. Armadilhas comuns em visualizar os dados MALDI IMS incluem o mapeamento da intensidade do pico máximo de uma escala linear óptico de blACK (0%) para a cor (100%) para todos e cada secção da série experimental (Figura 3), em vez de mapear todas as secções de uma escala comum absoluto onde 100% é a intensidade do pico máximo de todas as secções (Figura 5) . O último método permite a comparação de dados de grupo e visualização das diferenças entre os grupos de tratamento. Um grande obstáculo na análise de MALDI IMS é a atribuição de peptídeos para picos de massa específicos. Em tecido-espectrometria de massa em tandem, às vezes é possível, mas muitas vezes torna-se bastante difícil 13,14. Nós descobrimos que uma abordagem mais tradicional, incluindo um fraccionamento preparativa em cromatografia de permuta catiónica forte, seguido por LC-MS/MS de fase reversa pode ser usado para neuropeptídeos com sucesso de sequência muitos péptidos e especialmente de opióides. Ainda não é incomum para obter boa qualidade espectros MS / MS que não encontrou nenhum entradas de banco de dados usando os motores de busca comuns, tais como mascote. Nestes casos, de novo seqüenciamento-mão é o onlopção y. A prova definitiva da identidade de pico pode ser obtido por MALDI IMS de secções de tecido a partir do rato knockout adequado, mas isto não é sempre disponível ou possível. Uma alternativa é a validar os resultados através de um método diametralmente diferente, por exemplo por imunotransferência Western ou imuno-histoquímica. Isto pode frequentemente incluir o aumento de anticorpos e uma quantidade significativa de trabalho validar os novos anticorpos. A estratégia geral apresentado neste protocolo é otimizado para grandes escalas de neuropeptídeos experimentos MALDI IMS, incluindo várias seções e das condições experimentais. O protocolo foi optimizado especialmente para peptídeos opióides e terá grande impacto em estudos futuros, como empregado em diversas áreas da investigação, incluindo a dor e mecanismos subjacentes a resposta endógena para drogas de vício.

1,1 coleta de amostras e preparação <ol><li> Isoflurano (Apoteksbolaget AB, Suécia) </li><li> Os instrumentos cirúrgicos, dois pares de tesouras, uma Rongeur, espátula </li><li> Finamente trituradas gelo seco </li><li> Folha de alumínio e sacos plásticos para o armazenamento </li><li> Criostato (Microm, Heidelberg, Alemanha) </li><li> Índio-estanho óxido (ITO)-revestidos lâminas MALDI (Bruker Daltonics, Alemanha) </li><li> médio da temperatura ideal de corte (PTU) (Sakura Finetek Europa, Países Baixos) </li><li> exsicador de vácuo </li></ol> 1,2 aplicação Matrix <ol><li> Acetonitrilo (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) de pró-análise grau (Merck, Alemanha). </li><li> Ácido trifluoroacético (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> A água foi purificado com um sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore, Bedford, MA). </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japão) ou Retrato 630 removedor (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1,3 espectrometria de massa <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> O software FlexImaging (v 2,0, Bruker Daltonics) </li><li> Péptido ou proteína padrão de calibração (Bruker Daltonics) </li></ol> 1,4 processamento de dados <ol><li> Origem V.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab versão 7.9.0.529 (MathWorks, Natick, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1,5 identificação Neuropeptídeo <ol><li> Sonicador ultra-som </li><li> 10 kDa de peso molecular de corte de filtro (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C 25 gel (Sigma, Alemanha) </li><li> Hypersil coluna (ThermoFisher) </li><li> Piridina, ácido fórmico (FA), acetonitrilo (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) de pró-análise grau (Merck, Alemanha). </li><li> Ácido trifluoroacético (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). </li><li> Agilent 1100 nanofluxo LC, microWPS, coluna C18 (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 Micro-fractioncollector, placa-alvo Prespotted anchorchip (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools software (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Bio software Works (v.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Software Mascote (v 2.2, MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep banco de dados ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

maldi imaging mass spectrometry of neuropeptides in parkinson's disease

MALDI imagem espectrometria de massa (IMS) é uma abordagem poderosa que facilita a análise espacial das espécies moleculares em amostras de tecidos biológicos 2 (Fig.1). A 12 uM secção de tecido fino é coberto com uma matriz de MALDI, o que facilita a dessorção e ionização de peptídeos e proteínas intactas que podem ser detectadas com um analisador de massa, tipicamente usando um TOF MALDI / TOF espectrómetro de massa. Geralmente centenas de picos podem ser avaliados em uma única secção de tecido de cérebro de rato. Em contraste com as técnicas de imagem comumente utilizados, esta abordagem não requer conhecimento prévio das moléculas de interesse e permite a análise não supervisionada e abrangente de múltiplas espécies moleculares, mantendo a especificidade molecular elevado e sensibilidade 2. Aqui nós descrevemos um método MALDI IMS baseada na elucidação de perfis específicos de cada região de distribuição de neuropeptídeos no cérebro do rato da doença de um modelo animal de Parkinson (DP). PD é uma doença neurodegenerativa com uma prevalência de 1% para pessoas acima de 65 anos de idade 3,4. O tratamento mais comum sintomática baseia-se na reposição de dopamina uso de L-DOPA 5. No entanto, esta é acompanhada de efeitos colaterais graves, incluindo movimentos involuntários anormais, chamadas de L-DOPA induzida discinesias (LID) 1,3,6. Um dos mais proeminente mudança molecular em LID é uma regulação positiva do mRNA opióide precursor prodynorphin 7. Os peptídeos dinorfina modulam a neurotransmissão em áreas do cérebro que são essencialmente envolvidas no movimento de controle 7,8. No entanto, até à data os péptidos opióides exactas que se originam de processamento do precursor de neuropeptídeo não foram caracterizadas. Portanto, utilizamos MALDI IMS em um modelo animal da doença de Parkinson e experimental L-DOPA discinesia induzida. MALDI imagiologia espectrometria de massa mostrou ser particularmente vantajoso em relação à caracterização neuropeptídeoção, uma vez que as abordagens de anticorpos normalmente utilizados baseados alvo sequências peptídicas conhecidas e anteriormente observadas modificações pós-translacionais. Por outro lado MALDI IMS pode desvendar novos produtos de processamento de peptídeos e, assim, revelar novos mecanismos moleculares de modulação neuropeptídeo de transmissão neuronal. Embora a quantidade absoluta de neuropeptídeos não pode ser determinado por MALDI IMS, a abundância relativa dos iões de péptidos pode ser delineada a partir dos espectros de massa, dando cerca de alterar os níveis de conhecimentos na saúde e na doença. Nos exemplos aqui apresentados, as intensidades de pico de dinorfina B, alfa-neoendorphin e substância P foram encontrados para ser significativamente aumentada no dorsolateral, mas não o corpo estriado, dorsomedial de animais com disquinésia grave envolvendo tronco, facial e músculos orolingual (Fig. 5). Além disso, MALDI IMS revelou uma correlação entre a gravidade da discinesia e os níveis de des-tirosina alfa-neoendorphin, representando um mecanismo previamente desconhecido de inactivação funcionalvação de dinorfinas no estriado como a remoção de N-terminal da tirosina reduz a capacidade da dinorfina do receptor opióide ligação 9. Este é o primeiro estudo sobre a caracterização neuropeptídeo em LID utilizando MALDI IMS e os resultados destacam o potencial da técnica para aplicação em todos os campos da pesquisa biomédica.

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MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Farmacoterapia de reposição de dopamina uso de L-DOPA é o tratamento mais comumente utilizado sintomático da doença de Parkinson, mas é acompanhado por efeitos secundários, incluindo movimentos involuntários anormais, discinesia denominado<sup&gt; 1</sup&gt;. Aqui, um protocolo para imagiologia espectrometria de massa MALDI é apresentado que detecta alterações nos níveis de cérebro de rato de neuropeptídeos relacionadas com discinesia.

Espectrometria de Massa MALDI imagem de neuropeptídeos na Doença de Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

maldi-imaging-mass-spectrometry-neuropeptides-parkinson-s

Research

JoVE Journal

Medicine

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

25.8K visualizações.  Uppsala University. Farmacoterapia de reposição de dopamina uso de L-DOPA é o tratamento mais comumente utilizado sintomático da doença de Parkinson, mas é acompanhado por efeitos secundários, incluindo movimentos involuntários anormais, discinesia denominado 1. Aqui, um protocolo para imagiologia espectrometria de massa MALDI é apresentado que detecta alterações nos níveis de cérebro de rato de neuropeptídeos relacionadas com discinesia.