Wir bedanken uns bei Hanna Warner für einen Beitrag die Daten für die Abbildung 3 und Prof. Jonas Bergquist für wertvolle Anregungen. Schwedischer Forschungsrat (Grant 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA); der AKE Wiberg Stiftung (MA, JH), Die Königlich Schwedische Akademie der Wissenschaften (MA, JH), und die schwedische Chemical Society (JH) sind dankbar für finanzielle Unterstützung.

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere Vorteile des Einsatzes von MALDI-Massenspektrometrie Bildgebung in der Studie von Neuropeptiden. Eine unvoreingenommene Analyse der MS-Daten können zeigen, dass nur bestimmte Gehirnkernen oder wie in den Ergebnissen hier, wo nur in den dorsolateralen Teil des Striatums mit einer bestimmten pathophysiologischen Zustands zugeordnet ist dargestellt. Durch die Beibehaltung des räumlichen Informationen ist es dann möglich, Regions of Interest neu zu definieren, um statistische Analysen mit höherer Empfindlichkeit und geringere Variabilität im Vergleich mit der Analyse des gesamten Gehirns Teile oder mit traditionellen Peptidomics Studien über Peptid-Extrakte durchzuführen. Darüber hinaus ist es wichtig zu erkennen, MALDI IMS ohne weiteres bisher unbekannte post-translationale Modifikationen erkennen, aber Strukturanalysen folgen, um die genauen Aminosäurepositionen, die sich ändern zu bestimmen. Häufige Probleme bei der Visualisierung der MALDI IMS-Daten umfassen Abbilden der maximale Peak-Intensität zu einer linearen optischen Skala von black (0%) der Farbe (100%) für jeden Abschnitt in der Versuchsreihe (3) anstelle des Abbildens alle auf eine gemeinsame Absolutskala wobei 100% die maximale Peak-Intensität aller Abschnitte (5) . Die letztere Methode erlaubt den Vergleich der Gruppe Daten und die Visualisierung der Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen. Ein großes Hindernis bei der MALDI-IMS-Analyse ist die Zuordnung von Peptiden auf bestimmte Massenpeaks. On-Gewebe-Tandem-Massenspektrometrie ist es manchmal möglich, aber erweist sich oft als recht schwierig 13,14. Wir finden, dass eine herkömmliche Ansatz mit einer präparativen Fraktionierung auf einer starken Kationenaustauschchromatographie, durch Umkehrphasen-LC-MS/MS gefolgt erfolgreich Sequenz vielen Neuropeptiden und insbesondere Opioid Peptide können verwendet werden. Es ist noch nicht ungewöhnlich, dass gute Qualität MS / MS-Spektren, die nicht übereinstimmen alle Datenbankeinträge mit gängigen Suchmaschinen wie MASCOT zu erhalten. In diesen Fällen De-novo-Sequenzierung von Hand ist die ONLy-Option. Der endgültige Beweis für Peak Identität kann durch MALDI IMS von Gewebeschnitten aus der entsprechenden Knockout-Maus erhalten werden, aber dies ist nicht immer verfügbar oder möglich ist. Eine Alternative ist, um die Ergebnisse durch eine diametral andere Methode zu validieren, zum Beispiel durch Western Immunoblotting oder Immunhistochemie. Diese können oft von Antikörpern und eine erhebliche Menge an Arbeit Validierung der neuen Antikörper. Die allgemeine Strategie in diesem Protokoll vorgestellt wird, für groß angelegte Neuropeptid MALDI IMS Experimente, darunter mehrere Abschnitte und experimentellen Bedingungen optimiert. Das Protokoll wurde speziell für Opioidpeptide optimiert worden und wird große Auswirkungen in zukünftigen Studien haben, wie es in den unterschiedlichsten Bereichen der Forschung, einschließlich der Mechanismen, die Schmerzen und die körpereigene Reaktion auf Medikamente von Sucht beschäftigt.

1,1 Probengewinnung und-vorbereitung <ol><li> Isofluran (Apoteksbolaget AB, Schweden) </li><li> Chirurgische Instrumente; zwei Scheren, ein Rongeur, Spachtel </li><li> Fein gemahlen Trockeneis </li><li> Alufolie und Plastiktüten für die Lagerung </li><li> Kryostaten (Microm, Heidelberg, Deutschland) </li><li> Indium-Zinnoxid (ITO) beschichteten Folien MALDI (Bruker Daltonics, Deutschland) </li><li> optimale Schnittleistung Temperatur Medium (Oktober) (Sakura Finetek Europa, Niederlande) </li><li> Vakuumexsikkator </li></ol> 1,2 Matrix-Anwendung <ol><li> Acetonitril (ACN), Methanol (MeOH), Ethanol (EtOH) von pro-Analysen Sorte (Merck, Deutschland). </li><li> Trifluoressigsäure (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> Wasser wurde mit einem Milli-Q-Reinigungssystem (Millipore, Bedford, MA) gereinigt. </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japan) oder Portrait 630 Spotter (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1,3 Massenspektrometrie <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> FlexImaging Software (v 2.0, Bruker Daltonics) </li><li> Peptid oder Protein Kalibrier-Standard (Bruker Daltonics) </li></ol> 1,4 Datenverarbeitung <ol><li> Origin V.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab Version 7.9.0.529 (MathWorks, Natick, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1,5 Neuropeptid-Identifikation <ol><li> Ultraschall Ultraschallgerät </li><li> 10 kDa Molekulargewicht-Cut-Off-Filter (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C 25-Gel (Sigma, Deutschland) </li><li> Hypersil Spalte (ThermoFisher) </li><li> Pyridin, Ameisensäure (FA), Acetonitril (ACN), Methanol (MeOH), Ethanol (EtOH) von pro-Analyse Grad (Merck, Deutschland). </li><li> Trifluoressigsäure (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). </li><li> Agilent 1100 LC Nanoflow, microWPS, C18-Säule (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 Micro-fractioncollector, Prespotted anchorchip Zieltafel (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools Software (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Bio Works-Software (v.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Mascot Software (v 2.2, MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep Datenbank ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

maldi imaging mass spectrometry of neuropeptides in parkinson's disease

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie (IMS) ist eine leistungsfähige Methode, die die räumliche Analyse von Molekülen in biologischen Gewebeproben 2 (Abb. 1) erleichtert. Ein 12 um dünne Gewebeschnitt mit einer MALDI-Matrix die Desorption und Ionisation von intakten Peptiden und Proteinen, die mit einem Massenanalysator detektiert werden, kann typischerweise unter Verwendung eines MALDI-TOF / TOF-Massenspektrometer ermöglicht bedeckt. Im Allgemeinen Hunderte von Peaks in einem einzigen Rattenhirngewebe Abschnitt bewertet werden. Im Gegensatz zu den häufig verwendeten bildgebenden Verfahren geht diese Vorgehensweise nicht erforderlich, eine vorherige Kenntnis der interessierenden Moleküle und erlaubt für den unüberwachten und umfassende Analyse von mehreren molekularen Spezies unter Beibehaltung der hohen molekularen Spezifität und Sensitivität 2. Hier beschreiben wir ein MALDI IMS basierenden Ansatz für die Aufklärung Region-spezifische Verteilung Profile von Neuropeptiden im Gehirn der Ratte von einem Tiermodell der Parkinson-Krankheit (PD). PD ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung mit einer Prävalenz von 1% für Personen über 65 Jahre alt 3,4. Die häufigste symptomatische Behandlung basiert auf Dopamin-Ersatz mit L-DOPA-5 basiert. Dies wird jedoch durch schwere Nebenwirkungen einschließlich der zwangsweisen abnorme Bewegungen, genannt L-DOPA-induzierten Dyskinesien (LID) 1,3,6 begleitet. Einer der prominentesten molekulare Veränderung in LID ist ein Hochregulation der Opioid-Vorläufer Prodynorphin mRNA-7. Die Dynorphin Peptide modulieren Neurotransmission im Gehirn Bereiche, die im Wesentlichen in Bewegungssteuerung 7,8 beteiligt sind. Allerdings sind die genauen Opioid-Peptide, die aus der Verarbeitung von dem Neuropeptid Vorläufer stammen bisher nicht charakterisiert worden. Daher verwendeten wir MALDI IMS in einem Tiermodell experimenteller Parkinson-Krankheit und L-DOPA induzierter Dyskinesie. MALDI-Imaging-Massenspektrometrie erwiesen sich als besonders vorteilhaft im Hinblick auf Neuropeptid Charakterisierungtion, da häufig verwendete Antikörper Ansätze zielt bekannten Peptid-Sequenzen und zuvor beobachtet post-translationale Modifikationen. Im Gegensatz MALDI IMS kann entwirren neuartige Peptid-Processing-Produkten und damit zeigen neue molekulare Mechanismen der Neuropeptid Modulation der neuronalen Übertragung. Während die absolute Höhe der Neuropeptide können nicht durch MALDI IMS, bestimmt die relative Häufigkeit von Peptid-Ionen aus den Massenspektren abgegrenzt werden, geben Einblicke über das Ändern von Ebenen in Gesundheit und Krankheit. In den hier vorgestellten Beispielen wurden die Intensitäten von Dynorphin B, alpha-neoendorphin und Substanz P vor, signifikant in den dorsolateralen erhöht werden, aber nicht die dorsomedialen, Striatum von Tieren mit schwerer Dyskinesie mit Gesichts, des Rumpfes und orolingual Muskeln (Abb. 5). Darüber hinaus ergab MALDI IMS eine Korrelation zwischen Schweregrad und Dyskinesie Ebenen des-Tyrosin-alpha-neoendorphin, was einen bisher unbekannten Mechanismus der funktionellen Inaktivierungvation der Dynorphine im Striatum als die Entfernung von N-terminalen Tyrosin reduziert die Dynorphin der Opioid-Rezeptor-Bindung Kapazität 9. Dies ist die erste Studie über Neuropeptid Charakterisierung mittels MALDI LID in IMS und die Ergebnisse unterstreichen das Potenzial der Technik für die Anwendung in allen Bereichen der biomedizinischen Forschung.

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MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamin-Substitutionstherapie Pharmakotherapie mit L-DOPA ist das am häufigsten verwendete symptomatischen Behandlung der Parkinson-Krankheit, sondern wird durch Nebenwirkungen einschließlich der zwangsweisen abnormen Bewegungen, bezeichnet Dyskinesie begleitet<sup&gt; 1</sup&gt;. Hier wird ein Protokoll für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie vorgestellt, erkennt Änderungen im Rattenhirn Neuropeptid Ebenen in Bezug auf Dyskinesie.

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie von Neuropeptiden bei Parkinsonpatienten

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

25.8K Aufrufe.  Uppsala University. Dopamin-Substitutionstherapie Pharmakotherapie mit L-DOPA ist das am häufigsten verwendete symptomatischen Behandlung der Parkinson-Krankheit, sondern wird durch Nebenwirkungen einschließlich der zwangsweisen abnormen Bewegungen, bezeichnet Dyskinesie begleitet 1. Hier wird ein Protokoll für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie vorgestellt, erkennt Änderungen im Rattenhirn Neuropeptid Ebenen in Bezug auf Dyskinesie.