Damos las gracias a Hanna Warner por su contribución a los datos de la Figura 3 y el Prof. Jonas Bergquist para sus valiosos comentarios. El Consejo Sueco de Investigación (Grant 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA), la Fundación La Åke Wiberg (MA, JH), La Real Academia Sueca de las Ciencias (MA, JH), y el químico sueco Sociedad (JH) se agradece por el apoyo financiero.

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varias ventajas del empleo de la espectrometría de masas MALDI imágenes en el estudio de los neuropéptidos. Un análisis imparcial de los datos de MS puede revelar que los núcleos del cerebro sólo específicos, o como en los resultados presentados aquí, donde sólo la parte dorsolateral del cuerpo estriado se asocia con un estado fisiopatológico determinado. Al retener la información espacial es entonces posible volver a definir regiones de interés para el análisis estadístico con mayor sensibilidad y una menor variabilidad en comparación con el análisis de las secciones de todo el cerebro o utilizando estudios Peptidomics tradicionales en extractos peptídicos. Además, es importante darse cuenta de MALDI IMS fácilmente puede detectar previamente desconocidos modificaciones post-traduccionales, pero los análisis estructurales deben seguir para determinar las posiciones exactas de aminoácidos que están modificados. Errores comunes en la visualización de los datos de MALDI IMS incluyen el mapeo de la intensidad del pico máximo de una escala lineal óptica de blACK (0%) a color (100%) para todos y cada sección de la serie experimental (Figura 3), en lugar de mapear todas las secciones a una escala absoluta común donde 100% es la intensidad del pico máximo de todas las secciones (Figura 5) . Este último método permite la comparación de los datos del grupo y la visualización de las diferencias entre los grupos de tratamiento. Un obstáculo importante en el análisis de MALDI IMS es la asignación de los péptidos a los picos de comunicación específicos. En los tejidos en tándem de espectrometría de masas es a veces posible, pero a menudo resulta muy difícil 13,14. Nos parece que un enfoque más tradicional, incluyendo un fraccionamiento de preparación en la cromatografía de intercambio catiónico fuerte, seguido por LC-MS/MS de fase reversa se puede utilizar para la secuencia con éxito muchos neuropéptidos y péptidos opioides en particular. Todavía no es raro obtener una buena calidad de MS / MS espectros que no coinciden con las entradas de base de datos usando los motores de búsqueda comunes, tales como mascota. En estos casos de novo de secuenciación a mano es la ONLy opción. La última prueba de la identidad de pico se puede obtener por MALDI IMS de las secciones de tejido del ratón knock-out adecuada, pero esto no siempre está disponible o posible. Una alternativa consiste en validar los resultados mediante un método diametralmente distinto, por ejemplo, inmunotransferencia occidental o inmunohistoquímica. A menudo, esto puede incluir la producción de anticuerpos y una cantidad significativa de trabajo la validación de los nuevos anticuerpos. La estrategia general se presenta en este protocolo está optimizado para los experimentos a gran escala neuropéptido MALDI IMS, incluyendo varias secciones y las condiciones experimentales. El protocolo se ha optimizado especialmente para los péptidos opioides y tendrá un gran impacto en futuros estudios, tal como se emplea en diversos campos de investigación, incluyendo el dolor y los mecanismos subyacentes a la respuesta endógena a las drogas de adicción.

1.1 Toma de muestras y preparación <ol><li> El isoflurano (Apoteksbolaget AB, Suecia) </li><li> Instrumentos quirúrgicos, dos pares de tijeras, una gubia, espátula </li><li> De hielo seco finamente trituradas </li><li> Papel de aluminio y bolsas de plástico para el almacenamiento </li><li> Criostato (Microm, Heidelberg, Alemania) </li><li> Indio-estaño (ITO) revestida de diapositivas MALDI (Bruker Daltonics, Alemania) </li><li> de corte óptimo de temperatura media (PTU) (Sakura Finetek Europa, Países Bajos) </li><li> desecador de vacío </li></ol> 1.2 Matriz de la aplicación <ol><li> Acetonitrilo (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) de pro-análisis grado (Merck, Alemania). </li><li> Ácido trifluoroacético (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> El agua se purificó con un sistema de purificación Milli-Q (Millipore, Bedford, MA). </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japón) o Retrato 630 spotter (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1.3 Espectrometría de masas <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> Software de FlexImaging (v 2.0, Bruker Daltonics) </li><li> Péptido o proteína de calibración estándar (Bruker Daltonics) </li></ol> 1.4 Tratamiento de datos <ol><li> Origen v.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab versión 7.9.0.529 (The MathWorks, Natick, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1.5 La neuropéptido <ol><li> La ecografía de ultrasonidos </li><li> 10 kDa de peso molecular de corte de filtro (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C 25 en gel (Sigma, Alemania) </li><li> Hypersil columna (ThermoFisher) </li><li> Piridina, ácido fórmico (AF), acetonitrilo (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) de grado pro-análisis (Merck, Alemania). </li><li> Ácido trifluoroacético (TFA), Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). </li><li> Agilent 1100 LC de nanoflujo, microWPS, columna C18 (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 de Micro-fractioncollector, Prespotted anchorchip tablilla de puntería (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools software (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Bio funciona el software (V.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Mascota de software (v 2.2, MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep base de datos ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

maldi imaging mass spectrometry of neuropeptides in parkinson's disease

MALDI imágenes de espectrometría de masas (IMS) es un enfoque poderoso que facilita el análisis espacial de las especies moleculares en muestras de tejidos biológicos 2 (Fig. 1). Una sección 12 micras tejido delgado está cubierta con una matriz de MALDI, lo que facilita la desorción y la ionización de péptidos y proteínas intactas que pueden ser detectadas con un analizador de masa, típicamente usando una TOF MALDI / espectrómetro TOF. Por lo general cientos de picos se puede evaluar en una sección de tejido cerebral de rata sola. En contraste con las técnicas de imagen comúnmente utilizados, este enfoque no requiere conocimiento previo de las moléculas de interés y permite el análisis no supervisado y completa de múltiples especies moleculares mientras se mantiene una alta especificidad y sensibilidad molecular 2. Aquí se describe un método MALDI basada en IMS a fin de elucidar los perfiles específicos de la región de distribución de neuropéptidos en el cerebro de la rata de la enfermedad de un modelo animal de Parkinson (EP). Enfermedad de Parkinson es una enfermedad común neurodegenerativa con una prevalencia del 1% para las personas mayores de 65 años de edad 3,4. El tratamiento sintomático más común se basa en la sustitución de la dopamina mediante L-DOPA 5. Sin embargo, esto se acompaña de efectos secundarios graves, incluyendo movimientos involuntarios anormales, llamados L-DOPA discinesias inducidas (LID) 1,3,6. Uno de los cambios moleculares más destacado en la tapa es una regulación del ARNm precursor de prodinorfina opioides 7. Los péptidos dinorfina modular la neurotransmisión en áreas del cerebro que están esencialmente involucrados en el control de movimiento de 7,8. Sin embargo, hasta la fecha los péptidos opioides exactas que se originan en el procesamiento del precursor neuropéptido no se han caracterizado. Por lo tanto, hemos utilizado MALDI IMS en un modelo animal experimental de la enfermedad de Parkinson y la L-DOPA discinesia inducida. MALDI imágenes espectrometría de masas demostrado ser particularmente ventajoso con respecto a neuropéptido caracterizaciónción, ya que los enfoques basados ​​en anticuerpos de uso común dirigido a las secuencias de péptidos conocidos y previamente observados modificaciones post-traduccionales. Por el contrario MALDI IMS puede desvelar nuevos productos de procesamiento de péptidos y así revelar nuevos mecanismos moleculares de la modulación de neuropéptido de la transmisión neuronal. Mientras que la cantidad absoluta de los neuropéptidos no se puede determinar por MALDI IMS, la abundancia relativa de los iones de péptidos se pueden delinear a partir de los espectros de masas, ofrecerá una visión de cambio en los niveles de salud y la enfermedad. En los ejemplos que aquí se presentan, las intensidades máximas de dinorfina B, alfa neoendorphin y la sustancia P se encontró que se incrementó significativamente en el dorso-lateral, pero no el cuerpo estriado dorsomedial, de los animales con discinesia grave en el tronco facial, y los músculos orolingual (Fig. 5). Por otra parte, MALDI IMS reveló una correlación entre la severidad de la discinesia y los niveles de des-tirosina alfa-neoendorphin, lo que representa un mecanismo previamente desconocido de la inactivación funcionalvación de dinorfinas en el cuerpo estriado como la eliminación de la N-terminal de la tirosina reduce la dinorfina de los receptores opiáceos capacidad de unión 9. Este es el primer estudio sobre la caracterización de neuropéptido Y en tapa con MALDI IMS y los resultados destacan el potencial de la técnica para su aplicación en todos los ámbitos de la investigación biomédica.

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MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Farmacoterapia de reemplazo de dopamina mediante L-DOPA es el tratamiento más comúnmente utilizado sintomático de la enfermedad de Parkinson, pero se acompaña de efectos secundarios como movimientos involuntarios anormales, discinesia denomina<sup&gt; 1</sup&gt;. En este caso, un protocolo para la espectrometría de masas MALDI imagen se presenta que detecta cambios en los niveles de rata neuropéptidos cerebrales relacionadas con la discinesia.

Imagen de Espectrometría de Masas MALDI de neuropéptidos en la enfermedad de Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

25.8K vistas.  Uppsala University. Farmacoterapia de reemplazo de dopamina mediante L-DOPA es el tratamiento más comúnmente utilizado sintomático de la enfermedad de Parkinson, pero se acompaña de efectos secundarios como movimientos involuntarios anormales, discinesia denomina 1. En este caso, un protocolo para la espectrometría de masas MALDI imagen se presenta que detecta cambios en los niveles de rata neuropéptidos cerebrales relacionadas con la discinesia.