The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Hattı Üretimi <ol><li> İki farklı yapıları oluşturmak. İlk yapıda, RpL10A cDNA&#39;sı (ribozomal protein alt-birim L10a) pUASP-PL-GFP-nter plazmidi içine GFP alt klonlanır (32&#39;den versiyonu değiştirilmiş). Bir germ promoterinin kullanılması transgenik hattı daha polivalan tüketimine olanak sağlar. Not: pPTGAL4 plasmidi kullanılarak GAL4 (TF) yukarı sarkma geninin doku spesifik ifade sürüş düzenleyici sekansı klonlanmasıyla ikinci yapı elde edilir. </li><li> 1118 sinekler w içine ayrı ayrı plazmidler enjekte edilir ve 33 (standart prosedüre göre) P-eleman yerleştirilmesi ile sinek genomuna yapıları yerleştirin. </li><li> Sırayla seçin transformants iki farklı kromozomlar üzerinde yapılarla sinek hatlarını kurtarmak için. Nihai TRAP satır bir çift transgenik istikrarlı bir çizgi elde etmek için bu iki satır (genetik haçlar) birleştirilerek oluşturulur. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6BX w; cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Devasa bu çizgiyi yükseltmek ve istenen aşamalı embriyolar toplamak. </li></ol> 2. Embriyo Koleksiyon <ol><li> Kafes başına genç sineklerin yaklaşık 40 gr içeren 8 büyük silindirik nüfus kafesleri hazırlayın (180,000 sinekler / kafes civarında). </li><li> Sinekler onların yumurta kanalına gelişmekte embriyolar temizlemek için izin sözde öncesi duracak şekilde devam edin. Bunun için, katılaşmış agar ve üzüm suyu bir karışımını içeren iki 11 cm-çapında petri çanakları üzerine, 1 saat boyunca sinekler koymak ve taze yapılmış maya hamurlu yüzeyinin ⅓ kapsamaktadır. Üzüm 3 borsalarında sonra suyu plakalar benzer taze yapılmış plakalar üzerinde gerçek embriyolar toplamak. NOT: İnkübasyon süresi çalışılan gelişimsel zaman pencereye göre değişecektir. </li><li> Kafeslerden plakaları çıkarın ve addit (ör: Yumurtlama 3 saat + 10 saat, doğru gelişim aşamasını elde etmek için gerekli süre aynı sıcaklıkta onları terkional inkübasyon 10-13 saat yumurtlama (AEL)) sonra sahneye gelen embriyolar verir. Bir fırça kullanarak 50 ml su ile plaka içeriği (embriyolar, maya salçası, ölü sinekler) süspanse edin. </li><li> Ölü sinek embriyolar ve kalan vücut parçaları ayırmak ve daha küçük çaplı elek üzerinde kalan embriyolar toplamak, daha sonra deiyonize su kısaca yıkamak için elekler (700 mikron, 355 mikron, 112 um) bir dizi üzerinden gidin. Bu elekler yapışmasına neden olabilir olarak koleksiyon başına en fazla 18 plakları kullanmayın. </li><li> Deiyonize su içinde% 4.5 çamaşır suyu Dechorionate embriyolar, 2 dakika ve 30-60 saniye boyunca iyonu giderilmiş su ile iyice yıkayın. Çalkalama altında oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca PBS% 0.01 Tween 20, 100 ug / ml sikloheksimid embriyolar inkübe edin. </li><li> Selüloz emici yaprak Kuru embriyolar ve mikrosantrifüj tüpler aktarabilirsiniz. Tüpleri tartılır ve sıvı azot içine daldırma ile embriyolar flaş dondurma. Bu aşamada, kurutuldu, embriyolar, -80 ° C&#39;de birkaç ay boyunca saklanabilir. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. GFP Antikor için Coupled Manyetik Boncuk hazırlanması <ol><li> İyice hafif çalkalama orijinal şişesinde protein G manyetik boncuklar tekrar süspansiyon. </li><li> Transferi 90 bir RNaz ücretsiz tüp boncuk ul ve bir mıknatıs (30-60 saniye) onları toplamak. Boncukların 90 ul 60-80 mg / ml proteinlerini içeren lizat 1 ml immünopresipitasyon (İP) gerçekleştirmek için gereklidir. Boncuk doygunluğu önlemek için oranları uyun. Protein miktarına göre birkaç tüpleri kullanın. </li><li> Mıknatıs üzerinde Wash 1 × PBS% 0.01 Tween 20 (500 ul) ile boncuk ve boncuk toplamak süpernatant atmak için. Tanelere PBS% 0.01 Tween 20 350 ul GFP antikorun 30 ug ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karıştırma sonunda boyunca yavaş ucu ile inkübe edin. </li><li> Mıknatısın (30-60 saniye) ile ilgili boncuk toplayın süpernatan atılır ve polisom ekstraksiyon tampon 500 ul yıkayın (Hepes, 10 mM, KCI, 150 mM, MgCI2, 5 mM DTT, 0.5 mM, Triton% 1, Sikloheksimit 100 ug / ml , Protease 1 x inhibitörü, RNaz inhibitör 100 U). </li><li> Mıknatıs üzerine boncuk toplayın ve engelleme tampon 500 ul ekleyin (BSA 0.1 ug / ul, maya tRNA 0.1 ug / ul, Polizom ekstraksiyon tamponu içinde 0.1 ug / ul glikojen). </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe ve taze bloke edici tampon ile bir kez bu adımı tekrarlanır. </li><li> Daha sonra boncuk hatırlamak ve immünolojik saflaştırma adım (bölüm 6) hemen geçin, mıknatıs üzerinde boncuk toplayın ve Polizom ekstraksiyon tamponu 500 ul durulayın. </li></ol> 4. Lizat Hazırlama <ol><li> Başlamadan önce, çok yönlü hızlı hızlı boncuk değirmeni programı kurmak: 2 × 10 sn rpm 5.000, 15 saniye duraklama. 15 ml tüpler transfer kurutuldu embriyolar (1.5 g) polisom ekstraksiyon tamponu ihtiva eden buzda önceden soğutulmuş ve hemen homojen hale getirilir. Polizom ekstraksiyon tamponu 4 ml embriyoların 1,5 g örnek. </li><li> Iki Yayılması homojenize embriyolar 2 ml tüpler önceden soğutulmuş ve Embry öğütmekhomojenleştirici programını çalıştırarak os. Buz üzerinde taze önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpleri içine lizat aktarın ve 2000 g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj ile Postnükleer süpernatant hazırlar. </li><li> Buz üzerinde taze önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın süpernatant (son konsantrasyon =% 0.1)% 10 Nonidet P-40 1/100 numune hacmi ekleyin ve tüp tersini hafifçe karıştırın. </li><li> Darbe santrifüj minifuge örnek tüpün altındaki sıvıyı toplamak 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DHPC) (nihai konsantrasyon 1/9 numune hacmi = 30 mM eklemek )), tüp tersini hafifçe karıştırın ve inkübasyon sırasında birkaç kez tersini (5 dakika karışımı buz karışımı kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 20.000 g&#39;de 10 dakika süre ile 4 ° C&#39;de santrifüj ile sonrası mitokondriyal süpernatant hazırlayın. Bradford metodu ile protein konsantrasyonu ölçülür: lizat konsantrasyonu 60-80 mg / ml arasında olması gerekir. Tyepyeni bir önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp süpernatantı ake ve ön emilim aşamasında (bölüm 5) hemen geçin. </li></ol> 5. Ön emilim <ol><li> İyice hafif çalkalama ile manyetik boncuklar tekrar süspansiyon ve oda sıcaklığında, bir mikrosantrifüj tüpüne (boncuk / 1 mi, embriyonik lizat 30 ul) boncuk 30 ul transfer. </li><li> Süpernatant kapalı, mıknatıs üzerinde pipet boncuk toplayın ve Polizom ekstraksiyon tamponu (500 ul) boncuklar tekrar süspansiyon. Mıknatısa boncuk toplayın embriyonik lizat ekleyin ve bir döndürücüde 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. <ol><li> Boncuk çıkarın ve immünolojik saflaştırma adımı için buz üzerinde supernatant tutun. Immün-önce, örneğin, RT-qPCR immün-sonra toplanan RNA numunesinin, küresel RNA örneği karşılaştırma süpernatan 100 ul (giriş) tutun. </li></ol></li></ol> 6. immün- <ol><li> Ve (60-80 mg / ml protein tekabül eder) 1 mi eklemeGFP antikora bağlanmış bloke boncukların 90 ul ihtiva eden bir RNaz içermeyen tüpe lizat önceden absorbe edildi. Tüp rotator nazik ucu-üzerinde uç karıştırma ile 2 saat süre ile 4 ° C&#39;de inkübe edin. Alternatif olarak, 4 ° C &#39;de inkübasyon O / N gerçekleştirin. </li><li> Kuluçkadan sonra, mıknatıs üzerinde boncuk toplamak. Daha sonra 0.5 mM, sikloheksimid 100 ug / ml, RNaz inhibitör 100 U yıkama tamponu 500 ul (Hepes, 10 mM, KCl 350 mm, MgCI2, 5 mM, Nonidet P-40,% 1 DTT bunları tekrar süspansiyon boncuk aşağı döndürmek için bir minifuge kullanın ) ve mıknatıs bunları toplamak. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Yeni önceden soğutulmuş RNaz ücretsiz tüp boncuk değiştirin ve iki kez yıkayın. Boncukların bir mıknatıs üzerinde toplayın ve boncuk TRIZOL doğrudan 1 ml ekleyerek RNA ekstraksiyon geçin ve üreticinin talimatlarına uyun. </li></ol> 7. RNA Temizlik-up ve Kalite Değerlendirmesi <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre bir RNeasy Micro Kiti kullanın. Tamamlandığında, elut(x) ul RNaz içermeyen su ile e RNA. 2 60 ° C&#39;de dakikada, ve mağaza sıcak hızlı bir şekilde dondurulup örnekleri -80 ° C&#39;de. Bioanalyzer kullanarak RNA kalitesini kontrol edin (üreticinin talimatlarına uyun). </li><li> Traped RNA özgüllüğünü test etmek için, üreticinin talimatlarına (üstsimge III) &#39;e göre, saflaştırılmış RNA (giriş ve IP) 3 ng ters transkripsiyon gerçekleştirmek. Gene-özgü primer setleri kullanılarak qPCR cDNA kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li><li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+view+of+cell+fate+specification:+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors.">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li><li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network.">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li><li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses:+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity.">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).</li><li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster.">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, &amp; development. 21, 436-449 (2007).</li><li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo.">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li><li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDfly+v3.0:+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila.">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types.">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li><li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells.">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li><li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression.">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605 (2011).</li><li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo.">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965 (2012).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system.">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina.">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li><li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control.">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419 (2010).</li><li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila.">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276 (2012).</li><li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles.">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity.">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li><li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos:+application+to+gene+expression+analysis.">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li><li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity.">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li><li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4+in+the+Drosophila+female+germline.">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda Drosophila embriyolar nadir hücre popülasyonlarının araştırmaya adanmış bir modifiye Tercüme Ribozom Affinity Arıtma protokolü (dublaj &#39;TRAP-rc&#39;) da açıklamaktadır. Bilgi mikrodizi ya da RNA seq analizi, embriyo lizizi ve polisom çıkarılması için, yani, 1) gerekli olan biyolojik maddenin miktarı ve optimize edilmiş prosedür için uygun olan bir verim ile spesifik RNA izolasyonu için başarılı bir şekilde önemli adımlar sağlanır; 2) Taneler, / antikor-to-lisat uygun immüno-çökeltilmesi oranları; Yüksek özgüllük ve duyarlılık ile TUZAK-rc deneyler çalıştırmak üzere 3) yıkama tamponu kompozisyonu da dahil olmak üzere arka azaltılması izin yineleyin. Bu protokol, hali hazırda herhangi bir başka hücre türlerine de uygulanabilir hale tekrarlanabilir verileri elde edilir. Bu teknik, aktif-çeviri mRNA düzeyinde farklı gen ekspresyonunu analiz etmek ve böylece spec protein ifadesini anlamak için yolunu açmak için mümkün kılar<html> Belirli bir zaman penceresinde IFIC hücre tipi. Protein bolluk çeviri ve bozunma süreçlerinin hızına bağlıdır olacağı unutulmamalıdır. TRAP yöntemin önemli bir sınırlama, doğru bir kantitatif olarak protein içeriğini ölçmek ya da çeviri sonrası bir modifikasyonu algılamak için yetersizliğidir. Bir hücre tipi özel bir şekilde, bu sayede, mRNA gövdesi boyunca ribozom yoğunluğunun ölçülmesiyle miktarının iyileştirilmesi ve ribozom çok güçlü bir araçtır içi izi ile birlikte TRAP yapabilir. Yeni bir kağıt 34, bu kombine, insan embriyonik böbrek 293 hücreleri içinde yapıldı. Yazarlar, streptavidin boncuk kullanılarak RpL10A bir uyarılabilir biyotinilat edilmiş form biçiminde afinite saflaştırma ile nükleaz ayak izi bitti. Bu sınırlama amaç için gerekli biyolojik malzeme miktarı olan belirli bir hücre tipi hedefleme yaparken bütün organizmanın ribozom footprinting gerçekleştirmek mümkün olduğu ilkesine bir kanıtıdır. &quot;&gt; Küresel transkriptomik analizler paralel TUZAK deneyler yapılması mümkün yeni transkripsiyonu ve RNA tercüme de aktif. Bu özel gelişimsel bağlamlarda veya belirli hücre popülasyonlarının yer alan potansiyel transkripsiyon sonrası mekanizmalar derinden bilgilendirici olacak arasındaki oranlar izlemek yapacak Örneğin tarafından- mikroRNAlar. Sonuç olarak, TRAP hücreye özel bir şekilde aktif-çeviri ribozom bağlı RNA belirlenmesi için yüksek verimli, spesifik ve hassas bir yöntem olup. Bu yöntem, organizmalar ve doku tiplerinin geniş bir yelpazede kullanılabilir. Burada tarif edilen yeni TRAP-rc protokolü nadir bir hücre popülasyonlarının (toplam hücre sayısının% 1&#39;den daha az) ve tam genom düzeyinde daha sonraki analizler için yeterli bir son malzemenin miktarı için optimize edilmiştir. Bu yöntemin olası bir sınırlama kompozisyonu için yeterli miktarda isim levhası ribozomları üretilmesi için güçlü bir sürücünün bir gerekliliktirHedeflenen hücre tipinde endojen etiketsiz olanlar ile ete. Yeni bir çalışmada 25, yazarlar% 10-30 kadar etiketsiz ribozom karşı etiketlenmiş oranını tahmin. Ölçüde bu dengeyi geliştirmek gerekir UAS-RpL10A EGFP kopya sayısını artırarak bu sorunu aşmak için. Seçenek olarak ise, anlatılan genetik arka plan bir UAS GAL4 transgeni eklenmesi GAL4 proteininin üretimini yükseltmek ve dolaylı RpL10A-EGFP ifadesini arttırır. Bu mRNA üzerinde etiketli ribozomların daha iyi bir doluluk lehine olmalıdır. Bu zaten verimli bir yaklaşım daha güçlü, daha nicel yönünü getirmek veya keşfetmek ve gen ifadesi kontrolü için gerekli olan moleküler mekanizmaları çözülmeye tamamlayıcı yöntemler adapte yapılabilir unutmayın.

Hücreler gelişme sırasında, belirli özellikleri nasıl edindikleri anlama organlarının karmaşıklığı ve patolojik durumların karşı potansiyel evrim takdir etmek için çok önemlidir. Sonuç vermediği genel gen ekspresyon profillerinin hücre özellikleri ve farklılaşmasını altında yatan gen düzenleme ağları deşifre büyük araştırma itekleme mevcuttur, Pol II bağlama durumu, düzenleyici diziler ya da histon post-translasyonel modifikasyonlar transkripsiyon faktörü doluluk. Küresel düzeyde mikrodiziler gen ifadesini değerlendirmek için ve RNA-seq yaklaşımlar kullanılmaktadır. Mikrodiziler RNA seq kodlama dahil mikroRNAlar lncRNAs veya snRNAs gibi RNA&#39;lar kodlamayan RNA&#39;ların farklı türlerde bilgilendirme daha dişli ise, mRNA bolluk algılamasını sağlar. Ancak, bu teknikler aktif-transkripsiyonu ayırt edemez, kararlı hal mRNA, mRNA&#39;nın aktif-çeviri ve mRNA yıkımı sürecinin girerek. Kararlı st ÖlçmemRNA düzeylerini yedi proteome bileşimin 1-3 kötü bir tahmin olarak bilinmektedir. Aksine olarak, mRNA&#39;nın etkin-çeviri tespit protein üretiminin daha doğru bir görüntü sağlar. Bununla birlikte, transkriptomik çalışmaları, asıl olarak doğal tipte bir durumda 07/04 ya da parçalara doku kazancı ya da belirli bir faktör fonksiyon kaybı karşılaştırarak yorumlama geni ekspresyonunun zorlaştırarak tüm organizma seviyesinde neden olmuştur. Hücre hedef araçları, afinite saflaştırma ve hassasiyet gelişmeler son gelişmeler genom çapında canlı bir organizmada, küçük hücre popülasyonlarının ya da hatta tek hücreler üzerinde analiz gerçekleştirmek için izin verir. Drosophila, transgenik hatlarının büyük koleksiyonları hücre fonksiyonu için gerekli olan moleküler mekanizmaların daha doğru kantifikasyon verimli GAL4 / UAS sistemi 8-10 aracılığıyla farklı doku ve hücre alt spesifik zamansal ve mekansal hedefleme sağlar. 11 aktif-çeviri yakalamak için bir yol olarak tarif edilmiştir polisom. Sukroz gradyanlı santrifüjleme temeline dayanan bu yöntem mikrodiziler veya derin dizilemesi ile analiz edildiğinde polisom fraksiyonu ve mRNA tespiti seçimi tüm genom çevrilmiştir sağlar. Polizom yalıtım için işlemi sırasında 12 ribozomlar tarafından korunan RNA fragmanları mukabil ribozomal ayak izleri tespit etmek nükleaz sindiriminden ile akuple edilebilir. Ribozomal footprinting RNA çeviri ve RNA dizisi düzey çözünürlük ve ribozom konumlandırma miktarının doğruluğu, çeviri hızını ölçmek mümkün kılar artar. Bununla birlikte, esas olarak ribozom ayak izi işleminin sonunda elde edilen RNA verimle güçlü bir azalmaya, translatomes arasında hücreye özel izolasyon uygulanmamıştır bugüne kadar. RNA boyutu seçimi potansiyel yalancı p oluşturabilir göz önüne alındığındaAyrıca, benzer bir şekilde, RNA koruma olabilir, farklı RNP gelen ositives, daha fazla geliştirme ribozomal ayak izi artırmak ve hücreye özel yaklaşımlara uyarlamak için ihtiyaç vardır. Bu yöntemlerden biri, Tercüme ribozom Affinity saflaştırma (TRAP) Heiman ve arkadaşları tarafından, 2008 de tarif edilmiştir olarak adlandırılan. ve farelerde nöronların bir alt gruptan alınan translatome izole etmek için uygulanan. Tarafından, bir hücre türüne özgü bir şekilde, bir ribozomal protein epitopa etiketleme, polisomlann seçici hücre ayrılma ve sıralama zahmetli aşaması olmaksızın saflaştırılabilir. Bu durumda, ribozom yüzeyinde 60S ribozomal protein L10a eGFP 13 ile etiketlendi. 2008 yılından bu yana, çeşitli çalışmalar X&#39;te 14-19 farelerin, farklı türlerde bu yöntemi kullanmış 24 thaliana 20,21, 22,23 ve zebra balığı Arabidopsis laevis. TRAP yöntemi de Drosophila modeli uyarlanmıştır ve arındırma için kullanılmıştırfy hücre türüne özgü nöronal hücrelerin 25 ve astrositlerden 26 den mRNA. Yönlü, ikili GAL4 / UAS sistemi, bir doku-spesifik bir şekilde GFP-etiketli RpL10A ifade etmek için kullanılmıştır. Yetişkin sineklerin Başkanları dizildi (pan-nöral Elav-Gal4 sürücüsü tarafından hedeflenen) nöronal hücrelerin ve izole RNA&#39;lar gelen Polizom seçimini gerçekleştirmek için disseke edildi. Yukarı regüle genlerin sayıda Drosophila embriyolar geliştirilmesinde (az 1 hücrelerinin% &#39;si), bu yaklaşım, iyi bir spesifisiteye belirten ve seyrek hücre popülasyonlarına adapte bize isteyen, sinir sisteminde eksprese edildiği bilinen karşılık gelen . Moleküler aktörler ve morfogenetik hareketler evrimsel korunmuş olarak Drosophila modeli içinde, embriyonik aşama, gelişim süreçleri çalışma için seçim modelidir. Bu modelde, şimdiye kadar yapılan, sadece doku spesifik transkriptomik yaklaşımlar, böylece hücre ya da nükleer kullanılarak gerçekleştirilmiştirrting ve sadece sinek embriyo doku / hücre spesifik translatome profilleme adanmış yöntemlere ihtiyaç yaratarak, kararlı durum transcriptome 27-31 incelemek mümkün olmuştur. Burada Drosophila embriyolar adanmış ilk TRAP protokolü sunduk. Bu yöntem ile, devreye-için mRNA embriyo başına yaklaşık 100 kas hücrelerinin çok kısıtlı bir hücre popülasyonunda başarılı bir şekilde yüksek kalitede ve özgüllük ile izole edilmiştir. İkili GAL4 / UAS sistemi herhangi bir toksisite olmaksızın kasların alt popülasyonunda GFP etiketli RpL10A ifadesini sürmek için kullanılan, hiçbir belirgin fenotipleri veya gelişimsel gecikme önce gösterildiği gibi 25. Drosophila embriyolar kas sebebiyet verecek hemisegment başına 30 kasları sahip larva. Beceriksiz kimlik geninin yakınında keşfedilen bir düzenleyici bölge kullanarak, 30 çoklu çekirdekli kasların: 6 hedeflenir. Bu deneyde, ribozomlar için uzama kullanılarak mRNA üzerinde immobilize edilirsikloheksimid inhibitörü. Sitosolik ekstraktlar daha sonra GFP antikor kaplı manyetik boncuklar ile afinite temizliği için kullanılır. Saflaştınldı RNA kalitesi Bioanalyzer kullanılarak doğrulandı. Kantitatif PCR, ters transkripsiyon (RT-qPCR) özgüllüğü ve mRNA izole duyarlılığını belirlemek için kullanılabilir ve optimum protokolü çok etkili olduğu gösterilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Drosophila Embriyonik somatik kas sistemi hemisegment başına 30 kas oluşmaktadır ve her kas özellikleri belirli bir kümesi vardır: kimlik genleri pozisyon, füzyon olayları, bağlanma siteleri ve innervasyonunu sayısının kodu. Belirli bir kas alt kümesi tercüme mRNA belirlenmesi, bu özel kas özelliklerini oluşturmak için gerekli proteinler hakkında bilgi verecektir. Kimlik geni eksprese eden bir sarkma kaslarının alt-popülasyonundan TRAP göre bir yöntem, RNA kullanılarak (Şekil 1A-B) ile saflaştırılmıştır. Bu yaklaşımın önemli bir endişe izole RNA kalitesi ve özgünlüğü olduğunu. Burada bildirilen optimize protokol Bioanalyzer analizi ile değerlendirildi yüksek kaliteli RNA sistematik iyileşme sağladı. Profil elde gösterileri RNA hiçbir bozulma (Şekil 1C). TRAP yönteminin etrafında geliştirilen diğer çalışmalarda, sorular verilerin özgüllüğü üzerine yetiştirildik. Burada bentanecikler veya tüpler RNA bağlama spesifik olmayan ve yıkama tamponu optimizasyonu ile bağlantılı arka bastırmak için bir yöntem mprove. Arka plan düzeyi ve sarkma-ifade eden hücreleri izole edilmesi etkinliğini değerlendirmek amacıyla, aynı embriyon aşaması 3 kez tekrarlanmış RT-qPCR denemeler olmuştur. 4 farklı genlerin-zenginleşme katlayın (MEF2, sarkıtmak, Prospero&#39;ya soxNeuro) RpL32 geninin (Şekil 1D) karşı giriş ve normalize göre hesaplanmıştır. Bu sonuçlar pan-kas gen MEF2 ve beceriksiz geninin 5.6 kat zenginleşme 2.3 kat zenginleştirme gösterdi. Bunun aksine, sinir sisteminde ifade iki gen tükenmiş girişine karşılaştırıldı. Çok benzer kıvrım değişim değerleri protokol sağlam olduğunu gösteren, 3 biyolojik çoğaltır gözlendi. 150 × 10 ^ 6 pozitif (toplam 100 GFP hücre / embriyoyu ihtiva elde edilmiştir 1.5x10 ^ 6 embriyoların yaklaşık 1.5 g ile başlayan Fötr-Gal4 sürücüsü ile vehücreleri) içerir. TRAP deneyi çalıştırdıktan sonra, verim aşamasında-faiz bağlı belirli RNA civarında 25-45 ng olduğunu. Bu malzeme mikroarray analizi veya bir RNA-seq kitaplığı oluşturmak için bir yükseltme protokolü kullanılarak RNA seq çalıştırmak için yeterlidir. Verimlilik RpL10A-EGFP ifade etmek için kullanılan sürücünün gücüne kuvvetle bağlı olacaktır. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Şekil 1. Kalite ve Fötr-GAL4&gt; UASRpL10A EGFP embriyolar TUZAK izole RNA özgünlüğü değerlendirilmesi. (AB) hemisegment (A) başına altı Fötr kas hücrelerinde, özellikle RpL10A EGFP ifadesini gösteren bir sahne 16 embriyo Konfokal görüntüler. Genel kas işaretleyici Beta3tubulin ile RpL10A-EGFP Co-lokalizasyon birleştirme resim (B) görülmektedir. (C) traped RNA ra kalite kontrolün Bioanalyzer üzerinde rRNA 18S ve 28S mükemmel bütünlüğünü gösteren. (D) RT-qPCR analizi aşaması-16 embriyoların 3 biyolojik çoğaltır üzerinde TUZAK izole mRNA deneylerinin yüksek spesifite gösteren. Fold değişim girişi ve RpL32 genine karşı normalize göre hesaplanır. Tüm kas soy mevcut MEF2 transkript daha kısıtlı sarkma transkript 5.6 kat zenginleştirilmiş iken girişine oranla 2.3 kat zenginleştirilmiş bulunmaktadır. Nöral Prospero ifade hücreleri ve soxN genleri 2.2 kat ve sırasıyla 5.5 kat tükenmiş. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.7K Görüntüleme.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Video: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biyoloji

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...