Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institutes of Health (borse NS45037 R21 e R01 ES014901).

1. Preparazione del terreno di coltura (media C2) <ol><li> Aggiungere la seguente, nell&#39;ordine elencato, ad una sterile, monouso beuta da 500 ml Erlenmeyer: <table border="1"><tbody><tr><td> Quantità </td><td> Componente </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> 190 ml </td><td> DMEM (glucosio basso) </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> acidi grassi liberi BSA (20mg/ml in DMEM) </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> 2,8 ml </td><td> L-Glutammina </td><td> 1,4 mm </td></tr><tr><td> 4 ml </td><td> insulina / transferrina / selenio (100x) </td><td> 10 pg / ml di insulina 5,5 ug / ml di transferrina 38,7 nM selenio </td></tr><tr><td> 0,4 ml </td><td> NGF (125 ug / ml) </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 200 ml </td><td> Ham F-12 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table></li><li> Agitare delicatamente to mix e aliquota 10 ml per tubo in 17 x 100 provette sterili tappo a scatto. </li><li> Conservare a -80 ° C </li><li> Note importanti: <ul type="disc"><li> Scongelare NGF immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Prima aliquotando la soluzione NGF stock, prerivestimento le pareti interne della pipetta coltura dei tessuti in plastica sierologico con proteine ​​per ridurre l&#39;appiccicosità del NGF alla plastica. Approccio più semplice è Pipettare la miscela DMEM contenente i tempi di BSA diverse. Risciacquare il tubo NGF più volte con la miscela DMEM. </li><li> Aggiungi F-12 scorso a causa cisteina libera può destabilizzare i legami disolfuro nel insulina. </li><li> Non congelare in volumi superiore a 10 ml, perché Capo 4 possono formarsi dei cristalli </li><li> Non congelare e scongelare mezzo di C2 più di 2 volte. </li></ul></li></ol> 2. Preparazione di vetrini <ol><li> Abbiamo trovato che solo belle vetrini tedeschi funziona in modo coerente in questo protocollo (vedi Tabella 1 per l&#39;origine raccomandata e numero di catalogo). </li><li> Aggiungere 75-100 ml di acido nitrico 70% di bottiglie di vetro 300 ml campione con politetrafluoroetilene (PTFE o Teflon) rivestimenti coperchio (Catalogo Fisher # 09-911-765). </li><li> Indossare guanti, goccia coprioggetto uno ad uno nella soluzione di acido nitrico. Aggiungi coprioggetti abbastanza per fare uno strato non più di 2-3 coprioggetto di spessore sul fondo del vaso. </li><li> Scuotere i contenitori con i coprioggetti per 6-8 ore a temperatura ambiente su un set agitatore orbitale per non più di 185 rpm. </li><li> Lavorare in una cappa aspirante, con attenzione decantare l&#39;acido e smaltire secondo le normative locali. Sciacquare coprioggetti una volta con ultra-pura coltura di tessuti-grade acqua, poi aggiungere 75-100 ml di acqua nel contenitore. Vetrini coprioggetto può essere sciacquato più volte se l&#39;acqua diventa torbida. Scuotere a temperatura ambiente per una notte su un set agitatore orbitale per non più di 185 giri al minuto. </li><li> Ripetere la sequenza sopra di acido nitrico / coltura tissutale acqua di grado al giorno per un totale di 3 giorni. </li><li> Decantare la finaledi coltura di tessuti-grade acqua e aggiungere acetone sufficiente a coprire a malapena i coprioggetti. </li><li> Decantare questa acetone e smaltire correttamente. </li><li> Trasferimento coprioggetti ad un piatto di vetro 150 millimetri Petri. Aggiungi acetone sufficiente a coprire a malapena i coprioggetti. Assicurarsi che i coprioggetti sono in un unico strato nel piatto. </li><li> Lasciare evaporare l&#39;acetone durante la notte in una cappa aspirante. </li><li> Coprioggetti Cuocere in forno a 180 ° C per 1,5 ore per sterilizzare. </li></ol> 3. Preparazione di Coprivetrini per la Cultura <ol><li> Il giorno prima della dissezione, aggiungere 1 vetrino coprioggetto (preparato come descritto sopra) a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti coltura tissutale utilizzando una tecnica sterile. Aggiungere 200 pl di sterile poli-D-lisina soluzione (100 mg / ml in 0,5 M tampone Tris, pH 8) a ciascun pozzetto e conservare la piastra a 4 ° C per una notte. </li><li> Il giorno della dissezione, e idealmente prima di iniziare la dissezione, aspirare il poli-D-lisina soluzione da ciascun pozzetto e lavare i pozzetti 5 voltecon tessuto sterile cultura dell&#39;acqua grado. </li><li> Aggiungere 200 ul low-glucosio DMEM ad ogni piatto e conservare nel 37 ° C incubatore. Circa 1 ora prima della placcatura cellule, rimuovere DMEM low-glucosio e aggiungere 250 microlitri medie C2 per bene. Conservare le piastre a 37 ° C inferiore al 5% di CO 2 fino a quando le cellule sono pronte per essere placcato. </li></ol> 4. Dissezione e isolamento del ganglio cervicale superiore <ol><li> Dissociate culture di neuroni simpatici sono di solito preparate dissociazione di gangli cervicali superiore (SCG) raccolti da prenatale (giorni embrionali 19-21) cuccioli di ratto perché ci sono meno cellule gliali. Tuttavia, questo stesso protocollo può essere utilizzato con successo con i primi post-natale (da 1 a 3 giorni) cuccioli di ratto o di cuccioli di topo perinatali. </li><li> Euthanize ratti femmina in gravidanza tramite CO 2 per inalazione. Shave l&#39;addome e lavare la pelle con il 70% di etanolo. Rimuovere le corna uterine in condizioni sterili e mettere le corna uterine in uno sterile 150 millimetri capsula Petri. Evitaredanneggiare l&#39;intestino o altri organi interni della diga durante la dissezione. </li><li> Porre la capsula Petri con i cuccioli su un pan di ghiaccio per anestetizzare i cuccioli embrionali. Staccare gli embrioni liberi della tromba uterina e delle membrane amniotiche. Tagliare il midollo spinale di ogni cucciolo lungo la linea mediana sotto la spalla per l&#39;eutanasia dei cuccioli. Questo taglia anche la vena cava, che riduce sanguinamento dalla carotide durante la dissezione del SCG. Una volta sezionato libera del corno uterino, embrioni posto in una sterile Leibovitz L-15 (o qualsiasi mezzo tamponato aria) addizionato con penicillina e streptomicina. </li><li> Mettere gli embrioni sulla schiena su un piatto da 150 millimetri Petri piena a metà di Sylgard. Utilizzando sterili aghi calibro 20, pin il torace e la testa, con delicatezza iperestensione del collo, che facilita la dissezione del SCG. </li><li> Effettuare una incisione mediana lungo il collo a livello delle clavicole per rivelare le ghiandole sottomandibolari. Rimuovere le ghiandole con pinza sottile (no. 4 o no. 5 Dumont) per esporre lo strato muscolare. </li><li> Utilizzare le pinze sottili per tagliare il muscolo sternocleidomastoideo vicino alla clavicola. Poi sollevare delicatamente e incidere il muscolo omo-ioideo accanto alla trachea. Questo muscolo è molto sottile, in modo da evitare di tagliare troppo in profondità per evitare di strappare l&#39;arteria carotide sottostante e SCG. Una volta che questi strati muscolari vengono rimossi, l&#39;arteria carotide e il nervo vago deve essere chiaramente visibile. </li><li> Il SCG si trova appena sotto la biforcazione della carotide. Uso pinza sottile (n. 4 o no. 5), smussare sezionare il tessuto lontano da entrambi i lati della carotide per esporre il ganglio. Utilizzo di 2 pinza sottile, afferrare la carotide appena sopra e sotto le estremità rostrale e caudale di SCG, rispettivamente, per rimuovere la sezione della carotide sovrastante il SCG così come la stessa SCG. È probabile che il ganglio nodoso, che si trova a fianco della SCG in questa fase di sviluppo, verrà rimosso anche in questa fase. I gangli nodoso può essere identified per la sua forma rotonda e il nervo vago grande sporgente da esso. Questo si trova lungo uno dei rami della carotide. Al contrario, il SCG è a mandorla e si trova direttamente sotto la biforcazione della carotide. Posizionare il tessuto sezionato in una piastra da 35 mm sterile coltura contenente L-15 e antibiotici. Rimuovere il SCG da tutti i cuccioli prima di passare alle fasi successive. </li><li> Utilizzando una pinza sottile per separare delicatamente il SCG dalla carotide e gli eventuali altri tessuti rimossi durante la dissezione (in particolare il nervo vago e ganglio nodoso). Utilizzare una pinza sottile per rimuovere la capsula dal gangli. Questo riduce notevolmente il numero di cellule non neuronali in coltura. Trasferire la gangli all&#39;altro sterile piastra da 35 mm contenente L-15. </li><li> Per dissociare il SCG, rimuovere il mezzo L-15 e sostituirlo con 2 Collagenasi ml (concentrazione finale 1 mg / ml) / dispasi (concentrazione finale 5 mg / ml) di calcio e magnesio privo di Hank soluzione salina bilanciata. IncubaTE a 37 ° C per 40 minuti. </li><li> Trasferire il SCG ad un tubo da centrifuga sterile 15 ml e portare il volume fino a 10 ml con L-15 integrato con BSA (concentrazione finale 1-2 mg / ml). Centrifugare a 200 X g a temperatura ambiente per 5 minuti. Eliminare il surnatante e lavare ancora una volta con L-15 integrato con BSA. </li><li> Dopo il secondo lavaggio, rimuovere tutti L-15 e risospendere il gangli in ~ 2 ml di terreno C2. Triturare le cellule utilizzando un incendio lucidato piegato punta della pipetta, assicurarsi che la pipetta è rivestita con BSA/L15 prima di triturazione per ridurre al minimo delle cellule attaccare al vetro. Triturare 3-4 volte delicatamente. Lasciate che i grandi ciuffi decantare per circa 1 minuto e trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 15 ml. Aggiungere altri supporti C2 alla SCG rimanente e triturare. Dopo aver lasciato le macchie risolvere, trasferire la sospensione cellulare dalla triturazione secondo che ha raccolto dopo la prima triturazione. Ripetere questa operazione più volte fino a quando i gangli sono per lo più dissociati. Discard eventuali grumi rimasti dopo la triturazione quarto. </li><li> Per cellule dissociate da un disordine dei cuccioli di ratto (tipicamente 12-16 cuccioli), portare il volume totale del mezzo in sospensione cellulare di 8-10 ml aggiungendo ulteriore mezzo C2. Risospendere delicatamente le cellule usando una pipetta e rimuovere una piccola aliquota per determinare la densità cellulare. Regolare il volume della sospensione cellulare per ottenere 2X la densità cellulare desiderata nella coltura, e quindi, avendo cura di mantenere le cellule in sospensione, aliquota 250 ml di sospensione cellulare per pozzetto. Per gli studi morfometrici della crescita dendritica, di solito le cellule della piastra a bassa densità (~ 5 x 10 4 cellule per pozzetto) in piastre da 24 pozzetti. </li><li> Il nostro laboratorio incuba culture SCG in essiccatori di vetro piuttosto che direttamente in un incubatore CO 2. Lo facciamo perché neuroni simpatici coltivate in terreno privo di siero prestazioni migliori con un po &#39;più alta concentrazione di CO 2 (circa il 6,5%). Inoltre non usare gli antibiotici in omezzi ur quanto inibisce la crescita dei neuriti e le culture mantenendo nelle essiccatori sembra ridurre al minimo la diffusione della contaminazione se si sviluppa in un sottoinsieme di culture. Utilizzando questo sistema, si mantengono normalmente culture SCG per un massimo di 8 settimane. Una volta dorati, culture SCG sono immessi sul piatto di porcellana in essiccatore essiccatori di vetro contenenti acqua sterile sul fondo. Circa 120 ml di CO 2 viene iniettato nel essiccatore prima di sigillare la chiuse e ponendo l&#39;essiccatore intero in un incubatore di 35,5 ° C. </li></ol> 5. Alimentazione e manutenzione delle Culture <ol><li> Le culture sono generalmente alimentate 3 volte a settimana, con il primo cambio dei media si verificano 24 ore dopo la placcatura. Utilizzando una sterile piegato punta della pipetta, estrarre delicatamente circa la metà dei mezzi di comunicazione per pozzetto. Utilizzando un pulito sterile piegate punta della pipetta, sostituire il volume di terreno fresco rimosso con C2. </li><li> Per eliminare le cellule non neuronali dalla cultura, l&#39;anti-mitotico agente cytosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, concentrazione finale di 1-2 pM) è tipicamente aggiunto al mezzo di coltura al primo supporto di scambio (ad esempio, 24 ore dopo placcatura) per 48 ore. Questa concentrazione di ARA-C è generalmente sufficiente per eliminare tutte le cellule non neuronali. Se, oltre ARA-C è necessario un trattamento, si raccomanda che questi essere fatto ogni poppata altra per minimizzare gli effetti tossici sui neuroni. </li></ol> 6. Induzione della crescita dendritica con Matrigel o BMP-7 <ol><li> Per indurre crescita dendritica, Matrigel o BMP-7 è aggiunta a colture dopo cellule non neuronali sono stati eliminati e ARA-C livelli le colture sono significativamente ridotte. Tipicamente, si aggiunge Matrigel o BMP-7 al mezzo giorno 5 in vitro, ma crescita dendritica può essere indotta da Matrigel o BMP-7 aggiunto in qualsiasi punto temporale in vitro. Matrigel o BMP-7 è aggiunto al mezzo C2 e colture sono alimentati come descritto sopra. </li><li> La crescita Matrigel e BMP-indotta dendritica è il tempoe concentrazione-dipendente. Per effetti massimi, Matrigel è aggiunto a C2 ad una concentrazione finale di 50-75 pg / ml; BMP-7 è aggiunto al mezzo C2 ad una concentrazione finale di 50 ng / ml. Matrigel concentrazioni superiori a 100 pg / ml o BMP-7 concentrazioni superiori a 100 ng / ml sono stati notati per causare tossicità neuronale. Processi dendritiche (come determinato da criteri morfologici) risulteranno approssimativamente 48 ore dopo l&#39;esposizione iniziale di Matrigel o BMP-7 a concentrazioni di massima efficacia. Per indurre una robusta crescita dendritica, le culture sono alimentati con BMP-7 contenente il mezzo ad ogni poppata. Risultati equivalenti sono stati ottenuti utilizzando BMP 2, 4, 5 e 6 a concentrazioni paragonabili 20,21. </li></ol> 7. Analisi immunocitochimica di BMP-7-indotta Growth Dendritic <ol><li> Quando il grado desiderato di arborizzazione dendritica è stato raggiunto, colture vengono fissati con paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M. La migliore fissaggio è unchieved mezzo sostituendo il mezzo in pozzo con 4% paraformaldeide e ripetere questo passo 3-5 volte 10-15 minuti. </li><li> Risciacquare culture sostituendo il mezzo paraformaldeide al 4% con tampone fosfato isotonico (PBS) e ripetere questo passo tre volte più di 10 - 15 minuti. </li><li> Rimuovere il PBS e aggiungere 200 pl 0,1% Triton X-100 in PBS ad ogni pozzetto per 5 minuti a temperatura ambiente per permeabile alle cellule. </li><li> Rimuovere soluzione Triton tramite aspirazione e aggiungere 200 pl per pozzetto di soluzione tampone di bloccaggio (PBS supplementato con 3-5% BSA e siero di capra 1%). Incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere l&#39;anticorpo primario, proteina associata ai microtubuli-2 (MAP2) diluito 1:2000 - 1:5000 in tampone di bloccaggio. Incubare colture per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi, lavare le culture con PBS per tre volte nell&#39;arco di 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li>Incubare le colture con l&#39;anticorpo secondario diluito in PBS integrato con 1% BSA per 1-2 ore a temperatura ambiente al buio. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare le culture con PBS tre volte più di 10-15 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Coprioggetti Mount su vetro scivola lato della cella verso il basso in una goccia di mezzo di montaggio acquoso a pH appropriato per il fluorocromo tag per l&#39;anticorpo secondario. Mantenere i vetrini a temperatura ambiente per una notte per permettere al mezzo di montaggio secco. Conservare i vetrini a 4 ° C fino imaging. </li><li> Lasciare i vetrini raggiungano la temperatura ambiente prima di imaging. Acquisire immagini fluorescenti utilizzando un microscopio a contrasto di fase dotato di epifluorescenza. In genere, il pergolato dendritica completo di un singolo neurone può essere catturata usando un obiettivo 20X e di appositi filtri. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Neuroni simpatici dissociati dal SCG di perinatale rats e coltivate in assenza di cellule gliali e siero gangliare non estendere MAP2 processi immunopositive (figura 1), ma piuttosto, in genere si estendono solo un singolo processo assonale 14,15. L&#39;esposizione a BMP-7 (Figura 1) o Matrigel induce la formazione di numerosi processi che soddisfano i criteri morfologici, biochimici e funzionali di dendriti 17,18. Il dendrite-promuovere l&#39;attività di una Matrigel o BMP-7 è la concentrazione e tempo-dipendente 17,18,20. Crescita dendritica massima è osservata usando concentrazioni di Matrigel tra 50 e 75 pg / ml o BMP-7 tra 30 e 100 ng / ml, e metà massimali effetti sono tipicamente osservati a BMP-7 concentrazioni di circa 2 ng / ml. Tuttavia, cambiamenti significativi nella crescita dendritica possono essere rilevate con BMP-7 concentrazioni basse come 300 pg / ml. La risposta a uno dendritico Matrigel o BMP-7 è relativamente lento, con &lt;50% dei neuroni formare un secondo processo entro 24 ore dopo l&#39;esposizione ai dendriti-p<html> ROMUOVERE agente. Tuttavia, entro 3 giorni dopo l&#39;iniziale BMP-7 di esposizione, quasi tutti i neuroni rispondono ad un massimo di efficacia Matrigel o BMP-7 concentrazioni. Il numero di dendriti per neuroni continua ad aumentare con l&#39;esposizione continua a BMP-7, con la maggior parte dei cambiamenti che si verificano durante i primi 10 giorni di trattamento. Dopo 4 settimane, BMP-7-neuroni hanno tipicamente trattati con 6-8 dendriti primari che presentano rami secondari, terziari e anche quaternaria dendritiche 17. Questo aumento arbor dendritica avviene in assenza di qualsiasi variazione significativa crescita assonale, e risposte dendritiche analoghe possono essere provocato usando concentrazioni simili di BMP 2, 4, 5 o 6 20,21. Crescita dendritica può anche essere indotta da co-coltura con neuroni simpatici endogene cellule gliali gangliari 15,22, tuttavia, la risposta dendritica è significativamente più lento in queste condizioni. . Jpg &quot;/&gt; Figura 1. BMP-7 promuove la crescita dendritica in colture di neuroni simpatici. Cellule non neuronali sono stati eliminati dal SCG colture mediante trattamento con anti-mitotico per 48 ore dall&#39;inizio il giorno 2 in vitro. A partire dal giorno 5 in vitro, colture sono stati trattati con mezzo di controllo (A) o medio integrato con BMP-7 a 50 ng / ml (B). Il giorno 11 in vitro (dopo 5 giorni di trattamento BMP), le colture sono state immunomacchiate con mAb contro MAP2, una proteina che si trova principalmente nei dendriti e somata neuronale. Come mostrato in rappresentativi microfotografie fluorescenza, neuroni coltivati ​​in condizioni di controllo mancano dendriti come evidenziato dalla mancanza di MAP-2 dendriti immunopositive processi (A), al contrario, neuroni esposti a BMP-7 (B) hanno tipicamente diverse rastremato MAP-2 immunopositive dendriti.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-5+(BMP-5)+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li><li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+(BMPs)+and+BMP+antagonists.">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I vantaggi di questo modello includono: (a) le colture sono costituiti da una popolazione omogenea di neuroni simpatici privi di altri tipi di cellule 17,23, (b) i requisiti per il fattore di crescita di neuroni simpatici sono ben stabiliti, che consente di utilizzare mezzo definito, e una varietà di supporti definiti, e substrati funzionano bene per la crescita e mantenimento neuroni simpatici 23, (c) neuroni in queste colture rispondono uniformemente alla dendrite-attività di promozione di Matr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Vetrini coprioggetto </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 Turno Coverslip mm # 1 Spessore, vetro tedesco </td></tr><tr><td> Bent punta di pipette </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P0899-100mg </td><td> Soluzione stock 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Belle pinza Dumont no. 4 e 5 </td><td> Strumenti Scienza Belle (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20-gauge aghi </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata (-Ca, Mg-) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM glucosio basso </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Insulina / transferrina / Selenium </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Di acidi grassi liberi BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Harlan Bioproducts </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 medio nutrienti (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Citosina arabinoside </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Evitare ripetuti cicli gelo-disgelo </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc. </td><td> 345-BP BMP7-07H </td><td> BMP 4, 5 e 6 funzionare altrettanto bene come BMP-7 e sono talvolta più facile da ottenere commercialmente </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Pescatore </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Topo anti-ratto MAP2 anticorpo </td><td> Sternberg monoclonali Inc. </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 di capra anti-topo </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Mezzi di montaggio </td><td> Prolungare Probes kit molecolare Antifade </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons

La forma del dendritico pergolato determina l&#39;ingresso totale sinaptica un neurone può ricevere 1-3, e influenza i tipi e la distribuzione di questi ingressi 4-6. Modelli alterati di crescita dendritica e plasticità sono associate con una compromissione della funzione neuro-comportamentale in modelli sperimentali 7, e si pensa di contribuire a sintomi clinici osservati in entrambi i 8-10 disturbi dello sviluppo neurologico e malattie neurodegenerative 11-13. Queste osservazioni sottolineano l&#39;importanza funzionale di regolare con precisione la morfologia dendritica, e suggeriscono che l&#39;individuazione di meccanismi che controllano la crescita dendritica non solo promuovere la comprensione di come è regolata la connettività neuronale durante lo sviluppo normale, ma possono anche fornire indicazioni sulle nuove strategie terapeutiche per diverse patologie neurologiche. Studi meccanicistici di crescita dendritica sarebbe molto facilitato dalla disponibilità ofa modello di sistema che permette ai neuroni di essere sperimentalmente passa da uno stato in cui non si estendono ai dendriti quello in cui elaborare un pergolato dendritico paragonabile a quella del loro controparti in vivo. Colture primarie di neuroni simpatici dissociate dai gangli cervicale superiore (SCG) di roditori perinatali fornire tale modello. Quando coltivate in mezzo definito in assenza di cellule gliali e siero gangliare, neuroni simpatici estendere un unico processo che è assonale, e questo stato unipolare persiste per settimane a mesi in coltura 14,15. Tuttavia, l&#39;aggiunta di una proteina morfogenetica ossea-7 (BMP-7) 16,17 o Matrigel 18 al mezzo di coltura innesca questi neuroni di estendere i processi multipli che soddisfano i criteri morfologici, biochimici e funzionali di dendriti. Neuroni simpatici dissociati dal SCG di roditori perinatali e coltivate in condizioni definite sono una popolazione omogenea di 19 neuroniche rispondono in modo uniforme al dendrite-promuovere l&#39;attività di Matrigel, BMP-7 e BMP altri decapentaplegic (DPP) e 60A sottofamiglie 17,18,20,21. È importante, Matrigel e BMP-indotta la formazione di dendrite si verifica in assenza di variazioni nella sopravvivenza cellulare o crescita assonale 17,18. Qui, descriviamo come impostare dissociate culture di neuroni simpatici derivati ​​dalla SCG di ratti perinatali in modo che siano rispondenti alle selettivo dendrite-promuovere attività di Matrigel o BMP.

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Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Noi descriviamo un protocollo per l&#39;utilizzo di proteine ​​morfogenetiche dell&#39;osso-7 (BMP-7) o Matrigel per indurre selettivamente la crescita dendritica in primarie neuroni simpatici dissociate dai gangli cervicale superiore (SCG) di ratti perinatali.

Indurre crescita dendritica in colture di neuroni simpatici

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

inducing-dendritic-growth-in-cultured-sympathetic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K Views.  University of California, Davis. Noi descriviamo un protocollo per l'utilizzo di proteine ​​morfogenetiche dell'osso-7 (BMP-7) o Matrigel per indurre selettivamente la crescita dendritica in primarie neuroni simpatici dissociate dai gangli cervicale superiore (SCG) di ratti perinatali.

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Ricerca

Neuroscienze

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Un test ottico per riciclo delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni che Overexpressing proteine presinaptiche

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...