Este trabalho foi suportado pelo financiamento do National Institutes of Health (R21 NS45037 subsídios e R01 ES014901).

1. Preparação de meio de cultura (meio de C2) <ol><li> Adicionar o seguinte, na ordem listada, para um estéril, 500 ml descartável Erlenmeyer: <table border="1"><tbody><tr><td> Quantidade </td><td> Componente </td><td> Concentração Final </td></tr><tr><td> 190 ml </td><td> DMEM (glicose baixa) </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> de ácido gordo livre de BSA (20mg/ml em DMEM) </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> 2,8 ml </td><td> L-Glutamina </td><td> 1,4 mM </td></tr><tr><td> 4 ml </td><td> insulina / transferrina / selénio (100x) </td><td> 10 ug / ml de insulina 5,5 ug / ml de transferrina 38,7 nM de selénio </td></tr><tr><td> 0,4 ml </td><td> NGF (125 ug / ml) </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 200 ml </td><td> Ham F-12 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table></li><li> Agite suavemente to mix e alíquota de 10 ml por tubo de 17 x 100 tubos estéreis tampa de pressão. </li><li> Armazenar a -80 ° C </li><li> Notas importantes: <ul type="disc"><li> Descongele NGF imediatamente antes do uso. </li><li> Antes de alíquotas da solução de estoque de NGF, pré-revestimento das paredes interiores do pipeta de plástico de cultura de tecidos serológica com a proteína para minimizar aderência de NGF para o plástico. Abordagem mais fácil é a Pipetar a mistura DMEM contendo os tempos de BSA vários. Lavar o tubo de NGF por várias vezes com a mistura de DMEM. </li><li> Adicionar F-12 passado porque cisteína livre pode desestabilizar ligações dissulfureto na insulina. </li><li> Não congelar em volumes superiores a 10 ml por CaPO4 cristais podem formar </li><li> Não congelar e descongelar C2 médio mais de 2 vezes. </li></ul></li></ol> 2. Preparação de lamínulas <ol><li> Descobrimos que só finas lamínulas alemães trabalhar de forma consistente neste protocolo (ver Tabela 1 para fonte recomendada e número de catálogo). </li><li> Adicionar 75-100 ml de 70% de ácido nítrico a 300 ml de garrafas de vidro de amostras de politetrafluoroetileno (PTFE forros ou Teflon) da tampa (Fisher # catálogo 09-911-765). </li><li> O uso de luvas, gota lamelas uma por uma, para a solução de ácido nítrico. Adicionar lamelas suficientes para fazer uma camada de não mais do que 2-3 lamelas de espessura no fundo do frasco. </li><li> Agitar suavemente os recipientes com as lamelas durante 6-8 horas à temperatura ambiente em um conjunto agitador orbital durante não mais do que 185 rpm. </li><li> Trabalhando em um exaustor, decantar cuidadosamente o ácido e eliminar de acordo com os regulamentos locais. Lavar as lamínulas uma vez com ultra-pura cultura de tecidos de água-grade, em seguida, adicionar 75-100 ml de água para o recipiente. Lamelas podem ser lavados várias vezes se a água ficar turva. Agitar suavemente à temperatura ambiente durante a noite sobre um conjunto agitador orbital durante não mais de 185 rpm. </li><li> Repita a sequência acima de ácido nítrico / água de grau de cultura de tecido por dia para um total de 3 dias. </li><li> Decantar a finalgrau de cultura de tecido de água e adicionar acetona o suficiente para conseguir cobrir as lamelas. </li><li> Decantar este acetona e dispor adequadamente. </li><li> Transferir para um lamelas 150 milímetros prato de vidro de Petri. Adicionar acetona o suficiente para conseguir cobrir as lamelas. Garantir as lamelas são em uma única camada no prato. </li><li> Permitir que a acetona evapore durante a noite em um exaustor. </li><li> Lamelas assar em um forno de secagem a 180 ° C durante 1,5 horas para esterilizar. </li></ol> 3. Preparação de Lamelas para a Cultura <ol><li> Um dia antes da dissecção, adicionar uma vidro lamela (preparado tal como descrito acima) a cada poço de uma placa de cultura de 24 poços de tecido usando uma técnica estéril. Adicionar 200 uL de solução de poli-D-lisina estéril (100 mg / ml em 0,5 M de tampão Tris, pH 8) a cada poço e armazenar a placa a 4 ° C durante a noite. </li><li> O dia da dissecção, e idealmente, antes de iniciar a dissecção, aspirar a solução de poli-D-lisina de cada poço e lavar cada cavidade 5 vezescom água de grau estéril de cultura de tecidos. </li><li> Adicionar 200 uL de glucose-baixo DMEM a cada placa e armazenar em 37 ° C incubadora. Aproximadamente 1 hora antes de as células em placas, remover-glucose baixo DMEM e adicionar 250 meio C2 uL por poço. Placas de armazenar a 37 ° C sob 5% de CO 2 até que as células estão prontas para ser revestido. </li></ol> 4. Dissecção e isolamento do gânglio cervical superior <ol><li> Culturas dissociadas de neurónios simpáticos são geralmente preparadas por dissociação de gânglios cervicais superiores (SCG), colhidas a partir de pré-natal (dia embrionário 19-21) crias de rato, porque há menos células gliais. No entanto, este mesmo protocolo pode ser utilizado com sucesso com iniciais pós-natais filhotes (1 a 3 dias de idade) de ratos ou crias de rato perinatal. </li><li> Euthanize rato grávida via inalação de CO 2. Raspar o abdômen e lavar a pele com etanol 70%. Remover os cornos uterinos sob condições estéreis e colocar os cornos uterinos em 150 milímetros uma placa de Petri estéril. Evitardanificar os intestinos ou outros órgãos internos da barragem durante a dissecção. </li><li> Coloque a placa de Petri com os filhotes em uma bandeja de gelo para anestesiar os filhotes embrionárias. Dissecar os embriões livres do corno uterino e da membrana amniótica. Cortar o cordão espinhal de cada filhote ao longo da linha média sob o ombro para sacrificá os filhotes. Isto também corta a veia cava, o que reduz o sangramento da artéria carótida durante a dissecção do SCG. Uma vez dissecada livre da trompa uterina, os embriões colocar num estéril de Leibovitz meio L-15 (ou qualquer meio de ar tamponada) suplementado com penicilina e estreptomicina. </li><li> Colocar os embriões de costas sobre uma placa de Petri 150 milímetros meio-cheio com Sylgard. Usando estéreis 20 agulhas de calibre, prender o tórax ea cabeça, delicadamente a hiperextensão do pescoço, o que facilita a dissecção da SCG. </li><li> Faça uma incisão na linha média ao longo do pescoço ao nível das clavículas para revelar as glândulas submandibulares. Remover as glândulas utilizando fórceps finos (nó. 4 ou não. 5 Dumont) para expor a camada muscular. </li><li> Use a pinça fina para cortar o músculo esternocleidomastóideo perto da clavícula. Em seguida, levante com cuidado e incisão no músculo omo-hióideo ao lado da traquéia. Este músculo é muito fina, por isso evite cortar demasiado profundamente para evitar rasgar a artéria carótida subjacente e SCG. Uma vez que estas camadas musculares são removidos, a artéria carótida e no nervo vago deve ser claramente visíveis. </li><li> A SCG fica logo abaixo da bifurcação da artéria carótida. Usando fórceps finos (No. 4 ou não. 5), sem corte dissecar tecido afastado de ambos os lados da artéria carótida para expor o gânglio. Usando 2 fórceps finos, agarrar a artéria carótida logo acima e abaixo das extremidades rostral e caudal da SCG, respectivamente, para remover a secção da artéria carótida deitado acima do SCG, bem como a SCG si. É provável que o gânglio nodoso, que se encontra ao lado da SCG, nesta fase do desenvolvimento, também irá ser removido neste passo. Os gânglios nodosos pode ser identified pela sua forma redonda e do nervo vagai grande projecta a partir dele. Este encontra-se junto a um dos ramos da artéria carótida. Em contraste, a SCG é amendoada e encontra-se directamente sob a bifurcação da artéria carótida. Colocar o tecido dissecado em um prato de cultura estéril 35 milímetros contendo L-15 de médio e antibióticos. Retire a SCG de todos os filhotes antes de avançar para as próximas etapas. </li><li> Usando fórceps finos, suavemente separar o SCG a partir da artéria carótida e quaisquer outros tecidos removidos durante a dissecção (particularmente o nervo vago e gânglio nodoso). Use fórceps finos para remover a cápsula a partir de gânglios. Isto reduz grandemente o número de células não neuronais em cultura. Transferir a gânglios para outro prato milímetros estéril contendo 35 L-15 médio. </li><li> Para dissociar a SCG, remover o meio de L-15 e substituir com 2 ml de colagenase (concentração final 1 mg / ml) / dispase (concentração final de 5 mg / ml) em cálcio e magnésio livre de Hank solução de sal equilibrada. Incubaçãote a 37 ° C durante 40 minutos. </li><li> Transferir a SCG para um tubo de 15 ml estéril centrífuga cónica e levar o volume até 10 ml com L-15 suplementado com BSA (concentração final de 1-2 mg / ml). Centrifugar a 200 X g à temperatura ambiente durante 5 minutos. Descartar o sobrenadante e lava-se mais uma vez com L-15 suplementado com BSA. </li><li> Após a segunda lavagem, remover toda a L-15 e ressuspender o gânglios em ~ 2 ml de meio de C2. Tritura-se as células utilizando um incêndio-polido pipeta dobrado ponta, certificar-se a pipeta é revestida com BSA/L15 antes trituração para minimizar aderência de células para o vidro. Tritura-se suavemente vezes 3-4. Deixe as grandes aglomerações repousar cerca de 1 minuto e transferir a suspensão de células para um tubo cónico de 15 ml. Adicionar mais mídia C2 para o restante SCG e triturar. Depois de deixar assentar os aglomerados, transferir a suspensão de células a partir da trituração segundo para que recolhidas após a trituração em primeiro lugar. Repetir este processo várias vezes até que o são na maior parte dos gânglios dissociados. Discard quaisquer aglomerados restantes após a trituração quarto. </li><li> Para as células dissociadas de uma ninhada de crias de rato (tipicamente 12-16 filhotes) e levar o volume total do meio no suspensão de células para 8-10 ml por adição de meio C2 adicional. Suavemente ressuspender as células utilizando uma pipeta e remover uma pequena alíquota para determinar a densidade de células. Ajustar o volume da suspensão de células para conseguir 2X a densidade celular desejada na cultura e, em seguida, sendo certo para manter as células em suspensão, alíquota de 250 ml de suspensão de células por poço. Para estudos morfométricos do crescimento dendrítico, nós, células tipicamente em placas a baixa densidade (~ 5 x 10 células por poço 4) em placas de 24 poços. </li><li> Nosso laboratório incuba culturas Scg em dessecadores de vidro ao invés de diretamente em uma incubadora de CO 2. Fazemos isso porque neurónios simpáticos cultivadas em meio livre de soro um melhor desempenho com um pouco maior concentração de CO 2 (cerca de 6,5%). Além disso, não usamos antibióticos em omeios ur, uma vez que inibe o crescimento de neurites e culturas mantendo no dessecadores parece minimizar a propagação da contaminação se desenvolve em um subconjunto das culturas. Usando este sistema, é rotineiramente manter culturas SCG até 8 semanas. Uma vez revestidos, culturas SCG são colocados sobre a placa de porcelana exsicador em dessecadores de vidro que contêm água estéril no fundo. Aproximadamente 120 ml de CO 2 é injectada no exsicador antes da selagem-la fechada e colocando o exsicador inteiro em um conjunto incubadora para 35,5 ° C. </li></ol> 5. Alimentação e manutenção de culturas <ol><li> As culturas são geralmente alimentados 3 vezes por semana, com a troca meios primeira ocorrendo 24 horas após o plaqueamento. Usando uma pipeta de ponta dobrada estéril, suavemente retirar cerca de metade dos meios de comunicação por poço. Usando uma pipeta limpa dobrada ponta estéril, substituir o volume do meio removido com C2 fresco. </li><li> Para eliminar células não-neuronais a partir da cultura, o agente anti-mitótico cytosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, concentração final 1-2 uM) é tipicamente adicionada ao meio de cultura no primeiro meios de troca (eg, 24 horas após o plaqueamento) durante 48 horas. Esta concentração de ARA-C é geralmente suficiente para remover todas as células não neuronais. Se o tratamento ARA-C adicional é necessária, recomenda-se que estes ser feito a cada alimentação outro para minimizar os efeitos tóxicos sobre os neurónios. </li></ol> 6. Induzir o crescimento dendrítico com Matrigel ou BMP-7 <ol><li> Para induzir o crescimento dendrítico, Matrigel ou BMP-7 é adicionada às culturas após células não-neuronais foram eliminados e os níveis de ARA-C nas culturas são significativamente reduzidos. Tipicamente, adiciona Matrigel ou BMP-7 para o meio no dia 5, in vitro, mas o crescimento dendrítica pode ser induzida por Matrigel ou BMP-7 adicionado em qualquer ponto de tempo in vitro. Matrigel ou BMP-7 é adicionado ao meio de C2 e as culturas são alimentados como descrito acima. </li><li> Matrigel e BMP-induzida crescimento dendrítico é o tempoe dependente da concentração. Para os efeitos máximos, Matrigel é adicionado a C2 a uma concentração final de 50-75 ug / ml; BMP-7 é adicionado ao meio de C2 a uma concentração final de 50 ng / ml. As concentrações de Matrigel maior do que 100 ug / ml ou BMP-7 concentrações superiores a 100 ng / ml foram anotados para causar toxicidade neuronal. Processos dendríticas (como determinada por critérios morfológicos) tornar-se aparente de aproximadamente 48 horas após a exposição inicial de Matrigel ou BMP-7 em concentrações maximamente eficazes. Para induzir o crescimento dendrítico robusto, as culturas são alimentados com BMP-7 contendo o meio em cada alimentação. Resultados equivalentes foram obtidos utilizando BMPs 2, 4, 5 e 6 em concentrações comparáveis ​​20,21. </li></ol> 7. Análise imunocitoquímica da BMP-7-induzida crescimento dendrítico <ol><li> Quando o grau desejado de arborização dendrítica tenha sido alcançado, as culturas são fixadas usando paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M. A melhor fixação é umchieved substituindo metade do meio a no poço com paraformaldeído a 4% e repetindo este passo 3-5 vezes ao longo de 10-15 minutos. </li><li> Enxaguar as culturas, substituindo meia paraformaldeído a 4% com tampão fosfato salino (PBS) e repetindo este passo três vezes ao longo de 10 - 15 minutos. </li><li> Remover todo o PBS e adicionar 200 uL de Triton 0,1% X-100 em PBS a cada poço, durante 5 minutos à temperatura ambiente para permeabilizar as células. </li><li> Remover solução de Triton por aspiração e adicionar 200 uL por poço de solução tampão de bloqueio (PBS suplementado com BSA a 3-5% e soro de cabra a 1%). Incubar durante 20-30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remover o tampão de bloqueio e adicionar o anticorpo primário, microtúbulo proteína associada-2 (MAP2) diluído a 1:2000 - 1:5000 em tampão de bloqueio. Incubar as culturas durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover a solução de anticorpo primário, lavar as culturas com PBS três vezes ao longo de 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li>Incubar as culturas com o anticorpo secundário diluído em PBS suplementado com BSA a 1% durante 1-2 horas à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Remover a solução de anticorpo secundário e lavar as culturas com PBS três vezes ao longo de 10-15 minutos à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lamelas de montagem sobre lâminas lado das células para baixo em uma gota de meio de montagem aquoso com o pH apropriado para o fluorocromo marcado para o anticorpo secundário. Manter as lâminas à temperatura ambiente durante a noite para permitir que o meio de montagem seco. Lâminas Armazenar a 4 ° C até de imagem. </li><li> Permitir que os slides para equilibrar a temperatura ambiente antes de imagem. Aquisição de imagens fluorescentes, usando um microscópio de contraste de fase equipado para epifluorescência. Tipicamente, o mandril dendrítica inteira de um único neurónio pode ser capturada utilizando uma objectiva 20X e filtros adequados. </li></ol> 8. Os resultados representativos Neurônios simpáticos dissociadas do SCG de ra perinatalts e cultivadas na ausência de soro e as células gliais ganglionar falhar para estender MAP2 processos imunopositivas (Figura 1), mas sim, tipicamente se estendem apenas um único processo axonal 14,15. A exposição a BMP-7 (Figura 1) ou Matrigel induz a formação de numerosos processos que satisfazem os critérios morfológicos, bioquímicos e funcionais de dendrites 17,18. A atividade dendrite de promoção de qualquer Matrigel ou BMP-7 é a concentração e tempo-dependente 17,18,20. Crescimento dendrítico máxima é observada utilizando concentrações de Matrigel entre 50 e 75 ug / ml ou BMP-7 entre 30 e 100 ng / ml, e uma meia-máximas efeitos são tipicamente observadas em BMP-7 concentrações de ~ 2 ng / ml. No entanto, alterações significativas no crescimento dendrítica pode ser detectada com BMP-7 concentrações tão baixas como 300 pg / ml. A resposta a qualquer dendrítica Matrigel ou BMP-7 é relativamente lento, com &lt;50% dos neurónios formando um segundo processo dentro de 24 horas após a exposição a qualquer dendrite-p<html> romover agente. No entanto, no prazo de 3 dias após a inicial BMP-7 exposição, praticamente todos os neurónios responder a Matrigel maximamente eficaz ou BMP-7 concentrações. O número de neurónios por dendritos continua a aumentar com a exposição contínua a BMP-7, com a maioria das alterações que ocorrem durante os primeiros 10 dias de tratamento. Após 4 semanas, BMP-7-tratados neurónios têm tipicamente 6-8 dendritos primários que exibem secundária, terciária e quaternária, mesmo ramos dendríticas 17. Este aumento na mandril dendrítica ocorre na ausência de qualquer alteração significativa no crescimento axonal, e respostas dendríticas comparáveis ​​podem ser atingida utilizando concentrações semelhantes de BMPs 2, 4, 5 ou 6 20,21. Crescimento dendrítico também pode ser provocada por co-cultura de neurónios simpáticos com endógenos ganglionares células gliais 15,22, no entanto, a resposta dendrítica é significativamente mais lenta sob estas condições. . Jpg &quot;/&gt; Figura 1. BMP-7 promove o crescimento dendrítico nas culturas de neurônios simpáticos. Células não-neuronais foram eliminados do SCG culturas por tratamento com anti-mitótico durante 48 hr início no dia 2 in vitro. Começando no dia 5, in vitro, as culturas foram tratadas com meio de controlo (A) ou meio suplementado com BMP-7, 50 ng / ml (B). No dia 11, in vitro (após 5 dias de tratamento BMP), as culturas foram imunocoradas com mAb contra MAP2, uma proteína que se encontra principalmente no dendritos e somata neuronal. Como mostrado na representativos fotomicrografias de fluorescência, os neurónios cultivados sob condições de controlo não têm dendritos como evidenciado pela falta de MAP-2 dendritos imunopositivas processos (A), em contraste, os neurónios expostos a BMP-7 (B) têm tipicamente vários afunilada MAP-2 imunopositivas dendritos.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-5+(BMP-5)+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li><li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+(BMPs)+and+BMP+antagonists.">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As vantagens deste modelo incluem: (a) as culturas são compostos de uma população homogénea de neurónios simpáticos desprovidas de outros tipos de células 17,23; (b) os requisitos do factor de crescimento de neurónios simpáticos estão bem estabelecidos, o que permite o uso de meio definido, e uma variedade de meios definidos, e substratos funcionar bem para crescimento e manutenção de neurónios simpáticos 23, (c) neurónios nestas culturas responder uniformemente para a actividade pro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> Bélico </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 Coverslip Rodada mm # Espessura 1, vidro alemão </td></tr><tr><td> Bent ponta pipetas </td><td> Bélico </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P0899-100mg </td><td> Banco de solução a 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Água destilada </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Multa fórceps Dumont n. 4 e 5 </td><td> Belas Ferramentas Ciência (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> Calibre 20 agulhas </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 de Leibovitz médio </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Solução salina equilibrada de Hank (-Ca,-Mg) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM baixa glicose </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Insulina / Transferrina / Selenium </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> De ácidos gordos livre de BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Bioproducts Harlan </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Ham meio nutriente F-12 (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Citosina arabinósido </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Evite a repetição de ciclos de congelamento e descongelamento </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc. </td><td> 345-BP BMP7-07h </td><td> BMPs 4, 5 e 6 funcionam igualmente bem como BMP-7 e por vezes são mais fáceis de obter comercialmente </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Pescador </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Rato anti-rato MAP2 anticorpo </td><td> Sternberg monoclonais Inc. </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 cabra anti-rato </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Meios de montagem </td><td> Prolongar Sondas kit Antifade Molecular </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons

A forma do mandril dendrítica determina a entrada total sináptica um neurónio pode receber 1-3, e influencia os tipos e distribuição destes 4-6 entradas. Padrões alterados de crescimento dendrítica e plasticidade estão associados com a função neurocomportamental prejudicada em modelos experimentais 7, e são pensados ​​para contribuir para os sintomas clínicos observados em ambas as 8-10 neurodesenvolvimento distúrbios e doenças neurodegenerativas 11-13. Tais observações ressaltam a importância funcional da regulação precisamente morfologia dendrítica, e sugerem que a identificação de mecanismos que controlam o crescimento dendrítico não só avançar na compreensão de como a conectividade neuronal é regulado durante o desenvolvimento normal, mas também pode fornecer informações sobre novas estratégias terapêuticas para diversas doenças neurológicas. Estudos sobre os mecanismos de crescimento dendrítico seria grandemente facilitada pela disponibilidade ofa sistema modelo que permite que os neurónios a ser experimentalmente comutada a partir de um estado em que não se estendem para uma dendritos em que elaborar um mandril dendrítica comparável à do seu em homólogos in vivo. Culturas primárias de neurônios simpáticos dissociados do gânglio cervical superior (GCS) de roedores perinatais fornecer tal modelo. Quando cultivados em meio definido na ausência de soro e ganglionar células gliais, neurónios simpáticos estender um único processo que é axonal, e este estado unipolar persiste durante semanas a meses em cultura 14,15. No entanto, a adição de qualquer proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou 16,17 Matrigel 18 ao meio de cultura desencadeia estes neurónios para estender vários processos que satisfaçam os critérios morfológicos e bioquímicos e funcional para dendrites. Neurônios simpáticos dissociadas do SCG de roedores perinatais e cultivadas sob condições definidas são uma população homogênea de neurônios 19que respondem de forma uniforme para a actividade promotora de dendrite-Matrigel, BMP-7 e BMPs outros do decapentaplegic (DPP) e subfamílias 60A 17,18,20,21. Importante, Matrigel e BMP-induzida dendrite formação ocorre na ausência de alterações na sobrevivência das células ou do crescimento axonal 17,18. Aqui, nós descrevemos como configurar culturas dissociadas de neurónios simpáticos SCG derivados da de ratos perinatais de modo que eles são responsivos à actividade dendrite-promoção selectiva de Matrigel ou BMPs.

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Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Nós descrevemos um protocolo para a utilização de proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou Matrigel para selectivamente induzir o crescimento dendrítica em primárias neurónios simpáticos dissociadas do gânglio cervical superior (SCG) de ratos neonatais.

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

inducing-dendritic-growth-in-cultured-sympathetic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K visualizações.  University of California, Davis. Nós descrevemos um protocolo para a utilização de proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou Matrigel para selectivamente induzir o crescimento dendrítica em primárias neurónios simpáticos dissociadas do gânglio cervical superior (SCG) de ratos neonatais.

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neurociência

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Methods Article

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos