Diese Arbeit wurde aus Mitteln des National Institutes of Health (Zuschüsse R21 R01 und NS45037 ES014901) unterstützt.

1. Vorbereitung von Kulturmedium (C2-Medium) <ol><li> Fügen Sie den folgenden, in der Reihenfolge aufgeführt, zu einer sterilen Einweg 500 ml Erlenmeyerkolben: <table border="1"><tbody><tr><td> Betrag </td><td> Komponente </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 190 ml </td><td> DMEM (low Glukose) </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> fettsäurefrei BSA (20mg/ml in DMEM) </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> 2,8 ml </td><td> L-Glutamin </td><td> 1,4 mM </td></tr><tr><td> 4 ml </td><td> Insulin / Transferrin / Selen (100x) </td><td> 10 ug / ml Insulin 5,5 ug / ml Transferrin 38,7 nM Selen </td></tr><tr><td> 0,4 ml </td><td> NGF (125 pg / ml) </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 200 ml </td><td> Ham F-12 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table></li><li> Vorsichtig schwenken to Mix und aliquote 10 ml pro Röhrchen in 17 x 100 sterile Schnappdeckel Röhren. </li><li> Bei -80 ° C </li><li> Wichtige Hinweise: <ul type="disc"><li> Auftauen NGF unmittelbar vor dem Gebrauch. </li><li> Vor Aliquotieren die NGF-Stammlösung, Precoat die Innenwände der Gewebekultur-Plastik serologische Pipette mit Protein zu minimieren Verkleben von NGF an dem Kunststoff. Einfachste Ansatz besteht darin, die DMEM Mischung, welche die BSA mehrmals pipettieren. Man spült die NGF mehrfaches mit dem DMEM Mischung. </li><li> Fügen Sie F-12 zuletzt, weil freies Cystein kann Disulfidbindungen in dem Insulin zu destabilisieren. </li><li> Nicht in Mengen einfrieren größer als 10 ml, weil CaPO 4 Kristalle bilden können, </li><li> Nicht einfrieren und auftauen C2 Medium mehr als 2 mal. </li></ul></li></ol> 2. Vorbereitung der Deckgläschen <ol><li> Wir haben festgestellt, dass nur feine deutsche Deckgläsern konsequent arbeiten in diesem Protokoll (siehe Tabelle 1 für empfohlene Quell-und Katalog-Nummer). </li><li> Fügen Sie 75-100 ml 70% Salpetersäure auf 300 ml Glas-Probe Flaschen mit Polytetrafluorethylen (PTFE oder Teflon) Deckel-Liner (Fisher Katalog # 09-911-765). </li><li> Das Tragen von Handschuhen, Deckgläser Tropfen eins nach dem anderen in die Salpetersäure-Lösung. Fügen Sie genug Deckgläser, um eine Schicht nicht mehr als 2-3 Deckgläser dick auf dem Boden des Glases zu machen. </li><li> Schütteln Sie die Behälter mit den Deckgläsern für 6-8 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler Satz für nicht mehr als 185 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Arbeiten in einem Abzug vorsichtig dekantiert man die Säure und entsorgen nach den örtlichen Bestimmungen. Spülen Sie Deckgläschen einmal mit ultrareinem Gewebekultur-grade Wasser, dann fügen Sie 75-100 ml Wasser in den Behälter. Deckgläser kann mehrmals gespült werden, wenn das Wasser trüb wird. Vorsichtig über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Schüttler Satz für nicht mehr als 185 rpm schütteln. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte aus Salpetersäure / Gewebekultur-grade Wasser täglich für insgesamt 3 Tage. </li><li> Man dekantiert die endgültigeGewebekultur-grade Wasser und fügen Sie genug Aceton zu bedecken gerade knapp die Deckgläser. </li><li> Dekantieren dieses Aceton und richtig entsorgen. </li><li> Übertragen auf ein Deckgläschen 150 mm Glas-Petrischale. Fügen Sie genug Aceton zu bedecken gerade knapp die Deckgläser. Sicherstellen, dass die Deckgläser sind in einer einzigen Schicht in der Schale. </li><li> Lassen Sie das Aceton über Nacht verdunsten in einem Abzug. </li><li> Bake Deckgläsern in einem Trockenofen bei 180 ° C für 1,5 Stunden zu sterilisieren. </li></ol> 3. Vorbereitung der Deckgläser für Kultur <ol><li> Am Tag vor der Dissektion, fügen Sie ein Deckglas (hergestellt wie oben beschrieben) in jede Vertiefung einer 24 Well-Gewebekulturplatte mit steriler Technik. Geben Sie 200 ul sterilem Poly-D-Lysin-Lösung (100 mg / ml in 0,5 M Tris-Puffer, pH 8) in jede Vertiefung und speichern Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Der Tag der Dissektion, und im Idealfall vor Beginn der Dissektion, saugen Sie den Poly-D-Lysin-Lösung aus jeder Vertiefung und Waschen Sie jede Vertiefung 5 malmit sterilen Gewebe-Kultur reines Wasser. </li><li> Geben Sie 200 ul DMEM mit niedrigem Glucosegehalt auf jeder Platte und Speicher in 37 ° C Inkubator. Etwa 1 Stunde vor dem Beschichten Zellen, entfernen DMEM mit niedrigem Glucosegehalt und 250 ul C2 Medium pro Vertiefung. Shop-Platten bei 37 ° C unter 5% CO 2, bis die Zellen sind bereit zu sein vernickelt. </li></ol> 4. Dissection und Isolierung des Ganglion cervicale superius <ol><li> Dissoziierten Kulturen von sympathischen Neuronen sind in der Regel durch Dissoziation von cervicale superius Ganglien (SCG) von pränatalen geerntet (embryonaler Tag 19-21) Rattenjungen vorbereitet, weil es weniger Gliazellen sind. Dies kann jedoch dasselbe Protokoll erfolgreich mit frühen postnatalen (1 bis 3 Tage alt) Rattenjungen oder perinataler Maus Welpen verwendet werden. </li><li> Einschläfern trächtigen Ratten über CO 2-Inhalation. Rasieren Sie den Bauch und waschen Sie die Haut mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Uterushörner unter sterilen Bedingungen und platzieren Sie die Uterushörner in einem sterilen 150 mm Petrischale. VermeidenSchäden an den Därmen oder anderen inneren Organen des Damms während der Dissektion. </li><li> Legen Sie die Petrischale mit den Welpen auf einen Topf mit Eis, um die embryonale Jungtiere zu betäuben. Sezieren die Embryonen frei von der Uterushorn und Fruchtwasser Membranen. Schneiden Sie das Rückenmark eines jeden Welpen entlang der Mittellinie unter der Schulter, um die Welpen einschläfern. Dies gilt auch durchtrennt die Vena Cava, die Blutung reduziert aus der Halsschlagader beim Präparieren der SCG. Sobald freipräpariert des Uterushorns, Ort Embryonen in einem sterilen Leibovitz L-15-Medium (oder einem Luft-gepuffertem Medium) mit Penicillin und Streptomycin ergänzt. </li><li> Legen Sie die Embryonen auf dem Rücken auf einer 150 mm Petrischale mit Sylgard zur Hälfte gefüllt. Mit einer sterilen 20-Gauge-Nadel, Pin Brustkorb und Kopf, sanft Überstreckung des Halses, die Dissektion der SCG erleichtert. </li><li> Machen Sie einen Einschnitt an der Mittellinie entlang des Halses auf der Ebene der Schlüsselbeine, die submandibularis offenbaren. Entfernen Sie die Drüsen mit einer feinen Pinzette (no. Nr. 4 oder Nr.. Dumont 5) zum Freilegen der Muskelschicht. </li><li> Verwenden Sie die feinen Pinzette, um den M. sternocleidomastoideus in der Nähe des Schlüsselbeins zu schneiden. Dann heben Sie vorsichtig einschneiden und den M. omohyoideus neben der Luftröhre. Dieser Muskel ist sehr dünn, so vermeiden Schneiden zu tief, um nicht zu zerreißen die zugrunde liegende Arteria carotis und SCG. Sobald diese Muskel-Schichten entfernt werden, sollte der Arteria carotis und der Vagus-Nerv deutlich sichtbar sein. </li><li> Die SCG liegt knapp unterhalb der Gabelung der Halsschlagader. Mit feinen Pinzette (Nr. 4 oder Nr.. 5), stumpf zu zerlegen Gewebe von beiden Seiten der Halsschlagader das Ganglion freizulegen. Mit zwei feinen Pinzetten, fassen Sie die Halsschlagader nur oberhalb und unterhalb der rostralen und kaudalen Enden der SCG, bzw. um den Abschnitt der Halsschlagader, die oberhalb der SCG sowie die SCG selbst zu entfernen. Es ist wahrscheinlich, dass das Ganglion nodosum, die neben der SCG in diesem Stadium der Entwicklung befindet, wird auch bei diesem Schritt entfernt werden. Die Ganglien nodosum kann identifiéd durch seine runde Form und die große Vagusnerv, der von es. Dies liegt an einem der Zweige der Halsschlagader. Im Gegensatz dazu wird der SCG mandelförmig und liegt direkt unter der Gabelung der Halsschlagader. Setzen Sie den sezierten Gewebes in ein steriles 35 mm Kulturschale mit L-15-Medium und Antibiotika. Entfernen Sie den SCG aus aller Welpen vor voran, um die nächsten Schritte. </li><li> Mit einer feinen Pinzette vorsichtig trennen den SCG aus der Halsschlagader und alle anderen Gewebe entfernt während der Dissektion (insbesondere der Vagusnerv und Ganglion nodosum). Verwenden feinen Pinzette, um die Kapsel von den Ganglien zu entfernen. Dies reduziert die Anzahl von nicht-neuronalen Zellen in Kultur. Übertragen Sie die Ganglien zu einem anderen sterilen 35-mm-Schale mit L-15-Medium. </li><li> Um die SCG distanzieren, entfernen Sie die L-15-Medium und ersetzen mit 2 ml Collagenase (Endkonzentration 1 mg / ml) / Dispase (Endkonzentration 5 mg / ml) in Calcium-und Magnesium-freie Hanks balanced salt solution. Incubate bei 37 ° C für 40 Minuten. </li><li> Übertragen Sie die SCG in ein steriles 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und bringe das Volumen auf 10 ml mit L-15 mit BSA (Endkonzentration 2.1 mg / ml) ergänzt. Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Überstand verwerfen und waschen Sie noch einmal mit L-15 mit BSA ergänzt. </li><li> Nach dem zweiten Waschen, entfernen Sie alle L-15 und resuspendieren Sie das Ganglien in ~ 2 ml Medium C2. Man reibt die Zellen unter Verwendung eines feuerpolierte gebogenen Spitze Pipette, vergewissern Sie die Pipette mit BSA/L15 beschichtet wird, bevor Verreibung zu minimieren Anhaften von Zellen auf das Glas. Man reibt sanft 3-4 mal. Lassen Sie die großen Klumpen für ca. 1 Minute absetzen und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie weitere C2 Medien auf die verbleibende SCG und verreiben. Nach Trocknung der Klumpen absetzen, übertragen Sie die Zellsuspension aus der zweiten Verreibung zu, dass nach der ersten Verreibung gesammelt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis die Ganglien meist dissoziiert sind. Discard alle verbleibenden Klumpen nach dem vierten Verreibung. </li><li> Für Zellen, losgelöst von einem Wurf von jungen Ratten (in der Regel 12 bis 16 Welpen), bringt das Gesamtvolumen des Mediums in der Zell-Suspension auf 8-10 ml durch Hinzufügen zusätzlicher C2 Medium. Erythrozyten vorsichtig resuspendieren mit einer Pipette entfernen und eine kleine Teilmenge, um die Zelldichte zu bestimmen. Stellen Sie die Lautstärke der Zellsuspension zu 2X die Zelldichte in der Kultur gewünscht zu erreichen, und dann, sicher zu sein, um die Zellen in Suspension, 250 ml Aliquot der Zellsuspension pro Vertiefung zu halten. Für morphometrische Studien des dendritischen Wachstums wir in der Regel Platte Zellen mit geringer Dichte (~ 5 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) in 24-Well-Platten. </li><li> Unser Labor bebrütet SCG Kulturen in Exsikkatoren Glas und nicht direkt in einem CO 2-Inkubator. Wir tun dies, weil sympathischen Neuronen in serumfreiem Medium gezüchtet bessere Leistung mit einem etwas höheren CO 2-Konzentration (etwa 6,5%). Darüber hinaus verwenden wir keine Antibiotika in der our Medien, da es das Neuritenwachstum und Aufrechterhaltung Kulturen in den Exsikkator inhibiert scheint die Ausbreitung der Kontamination zu minimieren, wenn sie in einer Untergruppe von Kulturen entwickelt. Mit diesem System, wir routinemäßig pflegen SCG Kulturen für bis zu 8 Wochen. Einmal vergoldet, SCG Kulturen werden auf dem Porzellan Exsikkator Platte in Glas Exsikkatoren mit sterilem Wasser in den Boden gelegt. Ungefähr 120 ml CO 2 in den Exsikkator Vor dem Verschließen zu und Anordnen des gesamten Exsikkator in einen Inkubator Satz bei 35,5 ° C injiziert </li></ol> 5. Fütterung und Pflege der Kulturen <ol><li> Kulturen werden in der Regel 3 mal pro Woche gefüttert, mit dem ersten Austausch von Medien vorkommenden 24 Stunden nach der Beschichtung. Mit einem sterilen gebogenen Spitze Pipette vorsichtig etwa die Hälfte der Medien pro Well zurückzutreten. Mit einem sauberen sterilen gebogenen Spitze Pipette, ersetzen Sie das Volumen des Mediums mit frischem C2 entfernt. </li><li> Um nicht-neuronalen Zellen aus der Kultur zu beseitigen, die Anti-mitotischen Wirkstoff cytosine-D-arabinofuranosid (ARA-C, Endkonzentration 1-2 um) ist typischerweise mit dem Kulturmedium in der ersten Medienaustausch-/-speicherungsvorrichtung (z. B. 24 Stunden nach dem Ausplattieren) für 48 Stunden zugegeben. Diese Konzentration von Ara-C ist in der Regel ausreichend, um alle nicht-neuronalen Zellen zu entfernen. Wenn zusätzliche ARA-C Behandlung erforderlich ist, empfiehlt es sich, dass diese jede andere Fütterung eine toxische Wirkung auf die Neuronen zu minimieren getan werden. </li></ol> 6. Induktion von dendritischen Wachstums mit Matrigel oder BMP-7 <ol><li> Um das dendritische Wachstum zu induzieren, wird Matrigel oder BMP-7 zu den Kulturen zugegeben, nachdem nicht-neuronalen Zellen eliminiert wurden und ARA-C-Spiegel in den Kulturen werden deutlich reduziert. Normalerweise fügen wir Matrigel oder BMP-7 an dem Medium am Tag 5 in vitro, aber das dendritische Wachstum kann durch Matrigel oder BMP-7 zu jedem Zeitpunkt in vitro zugesetzt induziert werden. Matrigel oder BMP-7 ist mit dem C2 zugesetzt und Kulturen zugeführt werden, wie oben beschrieben. </li><li> Matrigel-und BMP-induzierte dendritischen Wachstums ist an der Zeitund konzentrationsabhängig. Für die maximale Wirkung wird Matrigel bis C2 in einer Endkonzentration von 50-75 g / ml zugegeben, BMP-7 ist mit dem C2-Medium bei einer Endkonzentration von 50 ng / ml zugegeben. Matrigel Konzentrationen von mehr als 100 pg / ml oder BMP-7-Konzentrationen von mehr als 100 ng / ml festgestellt wurden, um neuronale Toxizität verursachen können. Dendritische Prozesse (wie von morphologischen Kriterien bestimmt) werden etwa 48 Stunden nach der ersten Exposition gegen Matrigel oder BMP-7 bei maximal wirksamen Konzentrationen deutlich. Um robuste dendritischen Wachstum zu induzieren, werden Kulturen mit BMP-7-haltigem Medium bei jeder Fütterung zugeführt. Gleiche Ergebnisse wurden unter Verwendung von BMPs 2, 4, 5 und 6 in vergleichbaren Konzentrationen 20,21. </li></ol> 7. Immunzytochemische Analyse der BMP-7 induzierte Wachstum Dendritische <ol><li> Wenn die gewünschte Ausmaß der dendritischen Verzweigung erreicht worden ist, werden Kulturen fixiert mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer. Die beste Fixierung ist einechieved durch Ersetzen des halben Medium in gut mit 4% Paraformaldehyd und Wiederholen dieses Schritts 3-5 mal über 10-15 Minuten. </li><li> Spülen Kulturen durch Ersetzen des halben 4% Paraformaldehyd mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und Wiederholen dieses Schritts dreimal über 10 - 15 Minuten. </li><li> Entfernen Sie das gesamte PBS und mit 200 ul 0,1% Triton X-100 in PBS in jede Vertiefung für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen permeabilisiert. </li><li> Nehmen Sie Triton-Lösung durch Absaugen und mit 200 ul pro Vertiefung Blocking-Puffer (PBS mit 5.3% BSA und 1% Ziegenserum ergänzt). Inkubieren für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie die Blocking-Puffer und fügen Sie den primären Antikörper, Mikrotubuli-assoziierten Protein-2 (MAP2) bei 1:2000 verdünnt - 1:5000 in Blocking-Puffer. Inkubieren Kulturen für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C </li><li> Entfernen Sie die primäre Antikörper-Lösung, Waschen der Kulturen mit PBS dreimal über 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li>Inkubieren der Kulturen mit dem sekundären Antikörper, verdünnt in PBS mit 1% BSA für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Die sekundäre Antikörperlösung und wasche die Kulturen dreimal mit PBS über 10-15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Berg Deckgläser auf Objektträger Zelle nach unten in einen Tropfen der wässrigen Medium auf der geeigneten pH für die Fluorochrom markiert an den sekundären Antikörper. Halten Sie die Folien bei Raumtemperatur über Nacht, damit der Einbau halbtrocken. Objektträger bei 4 ° C bis Bildgebung. </li><li> Die Objektträger auf Raumtemperatur, bevor bildgebende Gleichgewicht zu bringen. Erwerben fluoreszierenden Bildern mit einem Phasenkontrast-Mikroskop für Epifluoreszenz ausgestattet. Typischerweise kann der gesamte dendritischen Dorn eines einzelnen Neurons gefangen mit einem 20x-Objektiv und entsprechenden Filtern werden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Sympathischen Neuronen losgelöst von der SCG der perinatalen rats gewachsen und in der Abwesenheit von Serum und Ganglien-Gliazellen nicht, MAP2 immunpositiven Verfahren (1) erstrecken, sondern typischerweise nur eine einzige erstrecken axonalen Verfahren 14,15. Die Exposition gegenüber BMP-7 (Abb. 1) oder Matrigel induziert die Bildung von zahlreichen Prozessen, die die morphologischen, biochemischen und funktionellen Kriterien von Dendriten 17,18 gerecht zu werden. Die Dendriten-fördernde Aktivität entweder Matrigel oder BMP-7 ist konzentrations-und zeitabhängige 17,18,20. Maximale dendritisches Wachstum beobachtet wird unter Verwendung von Konzentrationen von Matrigel zwischen 50 und 75 ug / ml oder BMP-7 zwischen 30 und 100 ng / ml und eine halb-maximale Effekte werden typischerweise bei BMP-7-Konzentrationen von etwa 2 ng / ml beobachtet. Jedoch können wesentliche Änderungen in dendritische Wachstum mit BMP-7-Konzentrationen so niedrig wie 300 pg / ml nachgewiesen werden. Die dendritischen Reaktion auf entweder Matrigel oder BMP-7 ist relativ langsam, mit &lt;50% der Neuronen Ausbilden eines zweiten Prozesses innerhalb von 24 Stunden nach Exposition an entweder Dendriten-p<html> ie Förderung Agenten. Jedoch innerhalb von 3 Tagen nach der ersten Exposition BMP-7, praktisch alle Neuronen auf maximal wirksame Matrigel oder BMP-7 Konzentrationen reagieren. Die Zahl der Dendriten pro Neuronen weiterhin mit kontinuierlichen Exposition gegenüber BMP-7 zu erhöhen, wobei der Großteil der Veränderung, die während den ersten 10 Tagen der Behandlung. Nach 4 Wochen, BMP-7-behandelten Neuronen haben in der Regel 6-8 primäre Dendriten, die sekundäre, tertiäre und quartäre sogar dendritischen Verzweigungen aufweisen 17. Dieser Anstieg der dendritischen Dorn tritt in der Abwesenheit von jeder wesentlichen Veränderung in Wachstum der Nervenfasern, und vergleichbare dendritischen Reaktionen ausgelöst werden kann, die ähnliche Konzentrationen von BMPs 2, 4, 5 oder 6 20,21. Dendritische Wachstum kann durch Co-Kultivierung sympathischen Neuronen mit endogenen Ganglien-Gliazellen 15,22 ausgelöst werden, jedoch ist die dendritische deutlich langsamer Reaktion unter diesen Bedingungen. . Jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. BMP-7 fördert dendritischen Wachstums in kultivierten sympathischen Neuronen. Nicht-neuronale Zellen wurden aus Kulturen SCG durch Behandlung mit anti-mitotische für 48 Stunden ab dem Tag 2 in vitro eliminiert. Beginnend am Tag 5 in vitro Kulturen wurden entweder mit Kontrollmedium (A) oder ein Medium mit BMP-7 bei 50 ng / ml (B) ergänzt behandelt. Am Tag 11 in vitro (nach 5 Tagen der Behandlung BMP), Kulturen mit mAk konnte MAP2 immungefärbt, vor allem ein Protein von Dendriten und neuronalen Zellkörper. Wie in repräsentativen Fluoreszenz gezeigten Mikroaufnahmen fehlt Neuronen unter der Steuerung Bedingungen gezüchtet Dendriten wie durch das Fehlen von MAP-2 immunpositiven Verfahren Dendriten (A) belegt ist; dagegen Neuronen zu BMP-7 ausgesetzt (B) weisen typischerweise mehrere sich verjüngende MAP-2 immunpositiven Dendriten.

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I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).</li><li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-5+(BMP-5)+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li><li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+(BMPs)+and+BMP+antagonists.">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Vorteile dieses Modells sind: (a) werden die Kulturen einer homogenen Population von sympathischen Neuronen frei von anderen Zelltypen 17,23 umfasst, (b) die Anforderungen der Wachstumsfaktor sympathischen Neuronen sind gut etabliert, das erlaubt die Verwendung von definiertes Medium, und eine Vielzahl von definierten Medien und Substrate eignen sich gut für das Wachstum und die Aufrechterhaltung sympathischen Neuronen 23; (c) Neuronen in diesen Kulturen gleichmäßig Reaktion auf die Dendrite...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> Rund 12 mm Deckglas Nr. 1 Dicke, Deutsch Glas </td></tr><tr><td> Bent Tip Pipetten </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P0899-100MG </td><td> Stammlösung 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Feinen Pinzette Dumont-Nr. 4 und 5 </td><td> Fine Science Tools (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20-Gauge-Nadeln </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Hanks ausgewogener Salzlösung (-Ca,-Mg) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM Low Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Insulin / Transferrin / Selen </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Fettsäure-freies BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Harlan Bioproducts </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 Nährmedium (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Cytosinarabinosid </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc. </td><td> 345-BP-07H BMP7 </td><td> BMPs 4, 5 und 6 funktionieren ebenso gut wie BMP-7 und sind manchmal einfacher, kommerziell erhalten </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fischer </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti-Ratte-Antikörper MAP2 </td><td> Sternberg Monoclonals Inc. </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 Ziege-anti-Maus </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Eindeckmittel </td><td> Verlängern Sie Antifade Kit Molecular Probes </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons

Die Form der dendritischen Dorn bestimmt die gesamte synaptischen Eingang ein Neuron erhält 1-3 können, und beeinflusst die Art und Verteilung dieser Eingänge 4-6. Veränderte Muster des dendritischen Wachstums und Plastizität sind mit beeinträchtigter Funktion neurobehavioral in experimentellen Modellen 7 zugeordnet und werden gedacht, um zu klinischen Symptomen in beiden neurologische Entwicklungsstörungen 8-10 und 11-13 neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet beitragen. Solche Beobachtungen unterstreichen die funktionelle Bedeutung der exakt regulieren dendritische Morphologie, und legen nahe, dass Identifizierung von Mechanismen, dendritische Wachstum steuern nicht nur das Verständnis für, wie neuronale Konnektivität wird während der normalen Entwicklung geregelt, kann aber auch einen Einblick auf neue therapeutische Strategien für die verschiedensten neurologischen Erkrankungen. Mechanistische Untersuchungen von dendritischen Wachstum würde durch die Verfügbarkeit o erleichtert werdenfa-Modell, das Neuronen experimentell aus einem Zustand, in dem sie nicht zu einer Verlängerung Dendriten auf, in dem sie einen dendritischen Dorn vergleichbar mit der von ihren Pendants in vivo erarbeiten geschaltet werden können. Primäre Kulturen von sympathischen Neuronen losgelöst von der überlegenen zervikalen Ganglien (SCG) der perinatalen Nager bieten ein solches Modell. Wenn in einem definierten Medium in Abwesenheit von Serum-und Ganglien-Glia-Zellen kultiviert werden, zu erweitern sympathischen Neuronen einen einzigen Vorgang, der axonalen ist, und dieser Zustand hält für unipolare Wochen bis Monate in Kultur 14,15. Jedoch löst die Zugabe von entweder Knochenmorphogenetischem Protein-7 (BMP-7) oder 16,17 Matrigel 18 mit dem Kulturmedium diese Neuronen, mehrere Prozesse, die die morphologische, biochemische und funktionelle Kriterien für Dendriten erstrecken. Sympathischen Neuronen losgelöst von der SCG der perinatalen Nagetiere und unter definierten Bedingungen gewachsen sind eine homogene Population von Neuronen 19, die gleichmäßig auf die Dendriten-Aktivität von Matrigel, BMP-7 und anderen BMPs der decapentaplegisch (dpp) und 60A Unterfamilien 17,18,20,21 reagieren. Wichtig ist, tritt Matrigel-und BMP-induzierte Dendritbildung in der Abwesenheit von Änderungen der das Überleben der Zelle oder axonalen Wachstums 17,18. Hier beschreiben wir, wie Sie dissoziierten Kulturen sympathischer Neurone aus dem SCG der perinatalen Ratten abgeleitet, so dass sie in Reaktion auf die selektive Dendriten-Aktivität von Matrigel oder BMPs sind.

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Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Wir beschreiben ein Protokoll für die Verwendung Knochenmorphogenetischem Protein-7 (BMP-7) oder Matrigel, um selektiv zu induzieren dendritisches Wachstum in Original-sympathischen Neuronen dissoziiert von der oberen Halsganglien (SCG) der perinatalen Ratten.

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

inducing-dendritic-growth-in-cultured-sympathetic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K Aufrufe.  University of California, Davis. Wir beschreiben ein Protokoll für die Verwendung Knochenmorphogenetischem Protein-7 (BMP-7) oder Matrigel, um selektiv zu induzieren dendritisches Wachstum in Original-sympathischen Neuronen dissoziiert von der oberen Halsganglien (SCG) der perinatalen Ratten.

Serie: Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Forschung

Neurowissenschaften

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...