I L Watanabe, M takımlarda hasar ve kullanışlı yorum ve tartışma Yoshihara laboratuvar diğer üyelerine teşekkür ediyorum. Ben sinek stokları, deneyler göstermek için S Yokoyama, teknik yardım için Shinya Iguchi ve malzeme bilgi için Nobuko Yoshihara K. Scott ve L. Looger teşekkür ederiz. Bu çalışma Ruh Sağlığı Teşvik MH85958 Ulusal Enstitüsü, ve MY için Worcester Vakfı tarafından desteklenen

1. Sinekler oluşturma <ol><li> Yanak eritilmesi ve uygun bir açı ve kalınlık (; Şekil 2, Şekil 1a) oluşturacak şekilde bu oyarak 35 mm Falcon kabının kapağını bir platform şekillendirmeye. Ağız serbestçe odası (Şekil 1a) ve dışında maruz kaldığı bu tür sinek başı (Şekil 1a, b) kabul etmek platformda bir delik delin. Sinek dikkat edilmesi eşleşen boyutu ile, bir Pipetman ucu sonu kesin. Platforma tutkal ucu sinekler (Şekil 2) tamamlamak için Şekil 1a&#39;da gösterilen. </li></ol> 2. Gözlem için Fly hazırlanması <ol><li> 25 24 saat için yetişkin bir sinek açlıktan ° C açlık gerekirse, sadece ıslak bir kağıt havlu ile bir şişe yerleştirerek deney öncesinde. </li><li> Buz üzerinde ayakta duran bir 15ml plastik tüp yerleştirerek sinek uyutmak. </li><li> Forseps kullanarak odasının içine bir sinek eklemekSinekler ve hareket edemiyor kadar hafifçe sinek itin. Sonra, sinek korumak için bir fiş takın. (Şekil 1a, b). </li><li> Deliğinin iç kenarı ile proksimal hortum (rostrum) çevreleyen parça mühürlemek; taraftan ışık sertleşen yapıştırıcı (Tetric EvoFlow), az miktarda uygulanır ve ikinci rostrum yukarıda dışındaki (Şekil 3 &#39;de oklar). Sineklerin içten kafasının dorsal parçası ve deliğinin iç kenarı (Şekil 1b) arasındaki boşluğa tutkal de geçerlidir. Kürsüden serbestçe hareket etmesine izin vermek için, bakım tutkal yaymak için bir kirpik (veya benzer bir şey) kullanarak kürsüde dokunmadan herhangi bir tutkal önlemek için alınmalıdır. Son olarak, aşırı sıcaklardan sinek zarar vermemek için tedavi için yeterli mavi ışık zayıf aydınlatma ile tutkal tedavi. Fişi çıkarın. </li><li> Kürsüden kısmen (Şekil 3 ok) kaldırdı tutmak için bir konu sinek stabilize etmek için istihdam edilebilir &#39;SOG için faringeal bölümünün yumru kaçınarak ve özellikle burnumun tamamen geri çekilir farenks parçası ile kaplıdır Gr5a nöronların 8, görüntüleme presinaptik terminaller için, SOG ventral kısmı açığa tarafından kafası. </li><li> ; KCl, 2; MgCl2, 4.5; CaCl2, 1.5; ve HEPES-NaOH, 5 7,1 10 arasında bir pH değerine sahip NaCl, 140: bir şeker içermeyen tuzlu su ihtiva eden (mm) ile platform yüzeyi doldurun. Bu sakaroz içermeyen tuzlu sık kullanılan olanlar sukroz içeren bu HL3.1 11 olarak Salines benzer toniklik vardır. </li><li> Ismarlama bir cihaz ve ilk SOG (Şekil 4) ortaya çıkarmak için manikür ve trakea klibi Dr Kageyuki Yamaoka, Japonya tarafından tasarlanmış makas gibi keskin uçlu bir tungsten bıçak ve forseps kullanarak baş kapsülü açın. Dorsal kenar kesim gibi kritik değildi oysa kafa kütikül ventral kenarı mümkün olduğunca ventral olarak kesildi. Birincisi, üzerinden bir kesi yapmakarka kenarı bir tungsten bıçak kullanarak. Sonra, tarafı boyunca kesilmiş ve keskin forseps kullanılarak, ön kenar. Cut manikür parçası forseps ile kaldırdı ve çıkarılmalıdır. Anten ve antennal sinirler bilenmiş forseps tarafından kesilmelidir. </li><li> Kayıt sırasında hareket eşya önlemek amacıyla, beyin sineği bazı kısımlarının çıkarılması ile stabilize edilmesi gerekir. İlk olarak, seçici SOG ve tırnak arasında hava çuval kaldırın. Farenks doğru sonunda ve farenks ve beyin arasındaki bağlantıyı kaldırmak için SOG girecek sonunda yemek borusu kesin. Sonra Muscle 16 12 çekin ve son olarak beyin ve kütikül bağlayan herhangi bir trakea ayırın. </li><li> Biz bir iplik diski konfokal mikroskop sistemi (Perkin Elmer içinde Improvision) (Şekil 5) bağlı bir Olympus BX51WI mikroskop sahnede bizim Sinekler ayarlayın. Bir suya daldırma objektif, örneğin 40X/0.8 NA, banyo (Şekil 6 batırılır edildi </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + Beyin Görüntüleme <ol><li> Ca2 + görüntüleme GCaMP3.0 kullanılarak 1, 9 Marella ark tarafından belirlenen yöntemi vasıtasıyla yapıldı. 8 (Şekil 6). Bir iplik Disk konfokal mikroskop (Improvision) kullanarak, ilgi bölgedeki (motor nöron bir hücre gövdesi, ya da bir internöron veya presinaptik terminallerinde odaklanarak, 491nm uyarılma lazer kullanarak 122ms bir pozlama süresi ile 4Hz tek bir optik bölümü almak tat duyu nöronlarının) Hız yazılım, sürüm ile. 4,3 (Improvision). </li></ol> 4. Probosis Uyarıcı <ol><li> Ucu (Şekil 7) dışarı çıkan küçük bir fitil (Japon washi kağıttan yapılmış, özel reaktiflerin bkz. Tablo) hipodermik bir iğne içine 100mM sulu sakaroz çözeltisini aspire. </li><li> Fitil üzerine sukroz çözeltisi, küçük bir damla deşarj, daha sonra, hemen befor, bu aspireburnumun ucu ıslanmış washi kağıt fitil uygulayarak e. Washi kağıt fitil sadece doyma (Şekil 8) önlemek için bir an için uygulanmalıdır. Probosis Uzatma Tepki (PER) Ca 2 + görüntüleme ile eşzamanlı olarak (Şekil 5) bir diseksiyon mikroskobu bağlı bir CCD kamera kullanarak davranışlarını izlemek. Veri BAŞINA yanıtı bu koşullar altında bir saatten fazla devam etmez çünkü diseksiyonu başladıktan sonra bir saat içinde alınmalıdır. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Kürsüden iletki, burnumun uzantısı için kürsüden kaldırma sorumlu tutulan başlıca kasları bir çift, Motor nöronların tatlı uyaranlara 13 sağlam yanıtları göstermek için bildirilmiştir. Şekil 9&#39;da, Ca 2 + sinyalleri GCaMP3.0 1, 9 yoluyla ifade motor nöron bir hücre gövdesinden Gal 4 sürücüsü, E49 13,. Video, bir robu &#39;de gösterildiği gibist BAŞINA Ca2 + sinyali bir artış ile eşzamanlı olarak gözlenmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> Şekil 1.. Fly beyin Canlı Görüntüleme ve Elektrofizyoloji Sahne (uçar) şematik. Bir, sinekler sinek kafası düz bir şekilde gelmesi için duvar açısı sağlayan bu tür inşa edilmiştir. Sinek burnumun üç segmente renk kodlu vardır; kürsüsüne eflatun olduğunu. Sinek forseps odasına yerleştirilen ve bir Pipetman ucunun sonunda kesilen bir parça kaçan sineği engellemek için odanın arka takılı edilir. B, delik sinek kafasına uyacak şekilde sıkılır. Sızıntı olmadığından emin olmak için belirtilen kalan eksiklikleri ışıkla sertleşen yapıştırıcı ile kapatılır. Tutkal tamamen donduktan sonra bir tıkaç görevi Pipetman ucu kaldırılır. Salin beynin yüzey tamamen kapalı olduğu gibi sinekler içine dökülür. Hiçbir tuzlu su sızıntısı olduğunu sağlanmalısinek başın ön ucuna dışarı ing. Panel b kesikli çizgi ile çevrelenmiş gölgeli alan çıkarılmış üzere bir kısmını göstermektedir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> Şekil 2. Sineklerin Fotoğraf. Tutkal hilal şeklinde bir duvar (bir tutkal tabancası itibaren) perfüzyon sırasında tuzlu su akışını kontrol etmek ve kullanılan tuz miktarını azaltmak için yapılır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> Şekil 3. Bir sinek ön görünümü ışıkla sertleşen yapıştırıcı bir tuzlu su geçirmez conta oluşturmak için sinek (oklar) başının etrafında nasıl uygulanacağını Bu görüntü bir sinek Sineklerin ayarlanır gösterir. Sinekler monte ve. Sineğin probosis kadar herhangi bir tuzlu su sızıntıları, daha sonra deneme başarısız olur. Sahneye tethered iplik (ok başları) tamamen retrac değildir, böylece pozisyonda burnumun tutmak olduğunu<html> ted. Aksi takdirde SOG ile daha ventral kısmı tıkayabilir ve hareket eserler neden olur. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> Şekil 4. Bir disseke sinek ile Sineklerin En görünümü. Bu görüntü bir sinek şu kütikül kaldırma maruz SOG gösterir. Yemek borusu, kas 16 ve trakea beyin bağlı olarak seçilen hava-çuval da kalsiyum sinyalleri eşya yol açabilir beyin, rahatsız engellemek için çıkarıldı. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> Şekil 5. Izleme cihazı. Bu cihaz bir iplik diski konfokal mikroskop sistemi (Improvision) bağlı bir Olympus BX51WI mikroskop monte edilen ve bir Nikon SMZ800 mikroskop yan monte edilir. Bu kurulum davranış BAŞINA sırasında beyin aktivitesinin canlı görüntüleme sağlar. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; 6 Şekil. Sineklerin yan görünümü göstermek için fotoğraf. Tuzlu su ince bir tabaka 40X suya daldırma lens ve sinek arasında sandviç edilir. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> Şekil 7. Washi kağıt fitil yapmak için şematik. Gampi-washi kağıt (Haibara, Japonya) son derece ince ve pürüzsüz bir geleneksel Japon parşömen olduğunu. Ayrıca, çok kuvvetli ve sıvı büyük miktarda muhafaza edebilir. Washi kağıt çok özel boyutları olan bir yamuk şeklinde kesilmiş olmalıdır; 0.3 mm ve 0.7 mm genişliği ve uzunluğu 4-5 mm (a). Bu, daha sonra bir yamuk 23 G derialtı iğne ucu içine 0,7 mm taraftan eklenir ve aynı zamanda bir V-şeklinde (b) bükülmüş bir böcek pimi, yerleştirilmesi ile kararlı hale getirilebilir. C, washi kağıt hale şeffaf aşağıdaki maruz kalmabir sıvı için, bu deney için idealdir. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> Şekil 8. Washi-fitil ile sinekleri üzerinde burnumun uyarılması. Bir derialtı iğne ucunda washi kağıt fitil tek elle bir Joystick manipülatör kullanılarak bir an için uygulanır. İğne sukroz çözeltisi aspirasyon ve boşaltılması için, diğer taraftan ile manipüle bir enjektör için esnek bir boru ile bağlanır. <img alt="Şekil 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> Şekil 9. Temsilci sonuçlanır. bir, davranış PER stereomikroskop yüklü CCD kamera aracılığıyla kaydedildi. Stimülasyonu azından uyarılmasıyla önce uzun bir hortum (oklar), ve 100 mM sukroz sulu çözeltisi (arrowhead) ihtiva eden bir fitil A ile uyarıldıktan sonra bir starved sinek frontal görünümler. Aydınlatma kullanılan bir 491 nm lazer sayesinde gerçekleşirGCaMP floresans. b, hasret devlet kürsüden kas iletki için motor nöron içinde GCaMP 3.0 yanıtı Sakkaroz-indüklenen. Uyarılması daha önce üst panel; alt panelini, hemen uyarıldıktan sonra. Ölçek çubuğu, 10 mikron. C, sukroz bağlı GCaMP 3.0 yanıtının belirlenmesi. Motor nöron temel çizgi birkaç saniyelik bir restorasyon aşaması takip floresan keskin bir artış ile sakaroz uyarana yanıt verir.

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121, 141-152 (2005).</li><li>Schroll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hamada, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Peabody, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+decision+network+for+wing+expansion+in+Drosophila+using+targeted+expression+of+the+TRPM8+channel.">Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel.</a> J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).</li><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hungry Fly. , (1976).</li><li>Shiraiwa, T., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proboscis+Extension+Response+(PER)+Assay+in+Drosophila.">Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).</li><li>Marella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category.">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category.</a> 49, 285-295 (2006).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+mediated+by+cAMP+and+protein+kinase+A+enhance+spontaneous+transmitter+release+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Miller, A., M, D. e. m. e. r. e. c. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-534 (1950).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+signaling+by+Syt+4+induces+presynaptic+release+and+synapse-specific+growth.">Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth.</a> Science. 310, 858-863 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Ben ifşa hiçbir şey yok.</p

Sinekler Ca2 + sinyalleri ve BAŞINA davranış eşzamanlı kayıt için olanak sağlar. Hatta, normal tuzlu su ile BAŞINA davranışı maruz beyin gözlenmiştir. Yerine özgün kılcal method7 kullanılan bir Kimwipe fitilin Gampi-washi fitil kullanmak, yüksek oranda tekrarlanabilir ve istikrarlı BAŞINA davranışı kolaylaştıran ve yapma ve iyi bir Kimwipe fitil seçiminde becerikli olmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Deneysel ipuçları bizi başarıyla Ca 2 derece stabil bir kayıt yol burnumun hareketi bozuklukları önlemek için + sinyaller düşük gürültü ile izin yukarıda belirtilen. Bazen, doku alınması kötü sonuçlara yol açan, hücrelerin maruz veya yeterince hareketini bastırmak için yeterli değildi. Ancak, bir kez biz becerikli, hazırlıkları fazla% 80 iyi sonuç üretti. Bu metodoloji Ca 2 + görüntüleme için değil sadece, ama davranış BAŞINA gözlemlerken aynı zamanda herhangi bir canlı görüntüleme adapte edilebilir. Örneğin, üzerinden herhangi bir hücre erişebilirdoğrudan faaliyet kaydetmek için bir elektrot kullanın. Iki foton uyarması mikroskobu ile birlikte, biz davranış değişiklikleri ile ilgili olabilir sinaptik yapısı time lapse görüntüleme gerçekleştirmek edebiliyoruz. Bu nedenle, davranışsal gözlem ile beyin görüntüleme yönteminin nöronal ağ fonksiyonel diseksiyon için değerli değil sadece, ama bellek arkasındaki mekanizmalar sinaptik plastisite 14 ilişkilendirmek için güçlü bir araç olarak kullanılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman / Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar Vivadent </td><td> M04115 </td><td> Işıkla sertleşen yapıştırıcı </td></tr><tr><td> BX51WI Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> BX51WI </td><td> 40X (NA 0.8) su altında kalacak objektif lens ile </td></tr><tr><td> Disk konfokal mikroskop sistemi Spinning </td><td> Perkin Elmer yılında Improvision </td><td></td><td> 491 nm lazer ile </td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ-800 </td><td> Bir kola bağlı. Stereo görünümü hala video kaydı ile kullanılabilir </td></tr><tr><td> Gampi-washi kağıt </td><td> Haibara, Japonya </td><td></td><td> Geleneksel Japon kağıt özel bir tür </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Görüntüleme Kaynak </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 piksel SONY CCD </td></tr><tr><td> Joystick manipülatör </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> Enjektör </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

Davranış, işlevi açısından nöron ağları çalışmak için, her bir davranış paterni oluşturulduğunda nöronların nasıl işlediğini analiz etmelidir. Böylece, nöronal aktivite ve davranış eşzamanlı kayıtlar davranış beyin aktivitesini ilişkilendirmek için gereklidir. Bu tür davranış analizleri için, meyve sineği Drosophila melanogaster, bize, bu GCaMP 1 gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri dahil etmek nöronal aktivitenin izlenmesi ve özellikle nöronlar 2-5 tespit aktif hale getirmenin optogenetic veya thermogenetic teknikleri için sofistike genetik manipülasyonlar kullanmanıza olanak sağlar. Bir thermogenetic tekniği kullanın beslenme davranışı için kritik nöronlar (Taşkın ve ark., Revizyon altında) bulmak için bize yol açmıştır. Onun probosis veya tarsi üzerinde duyusal hücrelerin tatlı bir uyarana yanıt; davranışı bir beslenme ana parçası olarak, bir Drosophila yetişkin 6 (PER probosis uzantısı yanıt) beslenmek için burnumun uzanır. Codavranışsal gözlem ile eş zamanlı olarak, suboesophageal ganglion (SOG) - GCaMP3.0 1 kullanarak bir kalsiyum görüntüleme tekniği 8, 9 ile 7 BAŞINA için protokol mbining, sanırım besleme merkezinde nöronların etkinliğini izleyebilir deneysel bir sistemi kurduk burnumun. Onun beyni bir suya daldırma merceğinden + görüntüleme Ca 2 banyo maruz iken kendi burnumun serbestçe hareket etmelerine olanak sağlayacak, Drosophila yetişkin yerleştirmek için: Ben bir aparat (&quot;Sinekler&quot; &quot;Fly beyin Canlı Görüntüleme ve Elektrofizyoloji Sahne&quot;) tasarladı . Sinekler ayrıca elektrofizyolojik kayıt veya sinaptik morfoloji time lapse görüntüleme gibi sinek beyinleri canlı deneyler birçok türleri için uygundur. Canlı görüntüleme sonuçlarını doğrudan eşzamanlı PER davranışı ile korele edilebildiği için, bu yöntemi nöron ağlarının bilgi işlem eğitim için mükemmel bir deneysel sistem sağlar ve nasıl bu c edebilirsinizellular aktivitesi plastik süreçleri ve bellek bağlanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Meyve sineği,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Onun probosis veya tarsus bir şeker uyarana yanıt, beslenmek için burnumun uzanır. Bizi davranışsal gözlem ile eş zamanlı olarak, beyindeki nöronların aktivitesini izlemenize olanak veren bir kalsiyum görüntüleme tekniği ile burnumun uzantısı yanıt (PER) gözlemleri bir araya getirdik.

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.5K Görüntüleme.  University of Massachusetts Medical School. Meyve sineği, Drosophila melanogaster, Onun probosis veya tarsus bir şeker uyarana yanıt, beslenmek için burnumun uzanır. Bizi davranışsal gözlem ile eş zamanlı olarak, beyindeki nöronların aktivitesini izlemenize olanak veren bir kalsiyum görüntüleme tekniği ile burnumun uzantısı yanıt (PER) gözlemleri bir araya getirdik.

Video: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Böcekler Tek Sensillum Kayıtlar Drosophila melanogaster Ve Anofel gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Nörobilim

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Transgenik Balık Sağlam Beyin Tespit Edilen nöronlar Elektrik Aktivitesi Kayıt

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Hücre içi Kaydı, Duyu Alan Haritalama ve Sülük de Kültüre Belirlenen Nöronlar Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membran Yetişkin farelerin ventromedial Hipotalamus Nöronlar Potansiyel Boya Görüntüleme Glikoz Algılama Çalışması için

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

A Guide<em&gt; In vivo</emOptogenetically Belirlenen Kortikal inhibitör dan&gt; Tek birim Kayıt

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...