The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.

1.. Elektrot Binası (Şekil 1) <ol><li> Ticari çok kanallı amplifikatör sistemleri 1,2,25 elektrot arayüz kartı uygun bir elektrot adaptörü üretimi. <ol><li> 18 Pin bağlayıcı tabanına yapıştırılmış küçük bir pleksiglas tabak kullanın. </li><li> Pleksiglas plaka üzerine vidalı 3 ayrı lehim pabuçları için izole tel 3 kısa adet (Şekil 1 A1-A3) ile taban bağlayın. </li><li> Bir cam kılcal kolayca hareket edebilir ve bir vida ile yerinde tutulabilir hangi Plexiglas plaka içine bir yiv (Şekil 1 B1) takın. </li><li> Bir minutien pimi kullanılarak yaklaşık 5 mm cam kılcal uzatın. </li><li> Istikrar ve destek garanti minutien pimi ve cam kapiller boyunca mikro elektrot tel takmak. </li></ol></li><li> Çok kanallı mikro tel üretimi (Ryuichy Okada 32,33 den alınmıştır) <ol><li> Dizisi 3. mikro teller (poliüretan kaplı bakır tel, 15bunlar yanyana yerleştirilen bir şekilde (Şekil 1 B2) um çapında). </li><li> (Elektrot ucu) (Şekil 1 B3) birlikte tutkal onları kısmen telleri boyunca düşük erime diş balmumu ince bir film tabakası (50 ° C) yaymak için bir 12 V lehim iğne kullanın. Bu bölümde elektrot adaptörü ile mikro telleri bağlamak için daha sonra kullanılabilir olacak gibi unglued birkaç santimetre (elektrot ucu) bırakın. </li></ol></li><li> Elektrot adaptöre çoklu kanal mikro teli bağlayın <ol><li> Sahibinden cam kılcal çıkarın ve elektrot ucu minutien iğne ile sabitleyin. Mikro-elektrot (Şekil 1 B3) paralel bir konuma getirin. </li><li> Düşük erime diş balmumu kullanarak minutien pin elektrot ucu Tutkal ve (küçük oklar 1 B3 Şekil) minutien pin ve elektrot sonunda 2-3 cm çıkıntılı, ucunda mikro elektrot kesti. </li><li> Kılcal sl Kaymaightly geri elektrot adaptörü içine. (Şekil 1 B4) bunu düzeltmek için vidayı kullanın. </li><li> Yalıtımın erimesini (Şekil 1 B4) olmak üzere yaklaşık 360 ° C arasında bir sıcaklığa sahip bir lehim tabancası kullanarak lehim pabuçları için üç tellerin gevşek uçları Lehim. Lehimleme sonra yeterli elektrik kontağı (~ 300 kOhm) olduğundan emin olun. </li><li> Headstage elektrot arayüz kartına elektrotlar (master) birini mount ve ayrı bir adaptör üzerinde diğer çok kanallı elektrot (köle) düzeltin. Ana elektrot (Şekil 1 C1) slave kanallarını bağlayın. Ayrıca, ana elektrot tabanına başvuru yanı sıra kas elektrotlar (Şekil 1 C2) lehim. </li></ol></li></ol> 2.. Arı Hazırlama (Şekil 2) Bu tarif edilen deneylerde, omurgasız bir hayvan olan bal arısı (Apis mellifera),ve bu nedenle kullanım için özel etik izin kullanılır gerektirmez. <ol><li> Başkaları 34,35 gösterildiği gibi sabah kovan girişinde balarısı silaj (A. mellifera) yakalayın. </li><li> Immobilizasyon (5-10 dk) kadar ezilmiş buz üzerinde arılar soğuk ve baş maruz bir şekilde (Şekil 2 A) standart bir pleksiglas sahibinin veya metal tüp içinde bir tane. En aza indirmek için baş hareketleri, düşük erime diş mumu (~ 50 ° C) kullanabilir ve bileşik göz ve boyun çevresinde esas sahibine dikkatlice başlığı düzeltmek. </li><li> Flagellumu dokunmadan baş kapsülü (Şekil 2 B) anten SCAPI sabitleşmek düşük erime balmumu kullanın. Antenin kamçı ileri işaret edilmesi gerekmektedir. Arı serbestçe burnumun taşıyabilirsiniz emin olun. </li><li> Kesintisiz bir görünüm ve başın üst erişimi sağlamak için baş kapsülü tıraş. </li><li> Saturati kadar bir% 30 sukroz çözeltisi ile arı Beslemebeyin dokusu ve hayvanın iyi canlılığı (Şekil 2 C) yeterli nemlendirilmesini sağlamak için. </li><li> Dikey olarak bileşim gözün sınırları boyunca ve yatay olarak antennal bazlar yukarıdaki gibi ocelli altında dikkatli olun ve insizyon kütikül gevşek parça (Şekil 2 B) çıkarın. </li><li> Dikkatle hipofaringeal bezleri kenara ve net bir görünüm ve ekleme (Şekil 2E, 2F) elektrot önce beyne erişim sağlamak için trakea çıkarın. </li></ol> 3.. Elektrot Yerleştirme Şekil 2&#39;de gösterilen örnek durumda, tek bir elektrot l-ALT, m-ALT 2 amaçlayan diğer bir amaçlayan konumlandırılmıştır. Özellikle işaretlerini kullanarak, diğer hedef bölgelerde, örneğin MB AL ve çıkış bölgeleri 1, hem de mümkündür. <ol><li> (Ilgilenilen bölgesinde mikromanipülatörler kullanarak elektrotlara yerleştirin <strong&gt; Şekil 2G ve 3A). M-ALT yerde AL ve mediale MB dikey lobundan arasındaki elektrot hedeflemek için. Mediolateral ALT PNS dallanma noktasının üzerinde olma ekleme siteyi olun. Yaklaşık 180 um (Şekil 2E) bir derinliğe sahip, beyin içine elektrod çıkıntı yapar. Elektrot dikey lob ve AL orta yan tarafı arasında bir hayali çizginin ortasında yanal protocerebrum (LH) altında l-ALT PN kayıt için burası. Yaklaşık 300 um (Şekil 2E) bir derinliğe sahip elektrot yerleştirin </li><li> Manikür küçük bir kesikten taraftaki bileşik göz içine referans (gümüş tel, yaklaşık 25 mikron çapında) takın. Yanal ocelli altındaki kas projeksiyon bölgeye başka bir gümüş tel yerleştirin. NOT: Gerekirse arının öğrenme davranışı i katılır kas M17, kayıt yüksek zamansal hassasiyetle izlenebilirn arı 36 burnumun uzantısı yanıt (PER) olarak 25 tarif. </li><li> Sağlam, beyin ve kafa kapsül içindeki elektrotlar demirlemek kurumasını beyin engeller, iki bileşenli silikon (Şekil 2H) ile beyin yukarıdaki tüm alanı kapsayacak. Not: kayıtlar güne kadar saatlerce sürebilir ve arılar, örneğin klasik bir klima prosedür (Şekil 2H) sırasında kaydedilebilir ya da farklı kokuların geniş bir paneli ile stimüle edebilir. </li></ol> 4. Veri Toplama ve önişlemesi <ol><li> Aşağıdaki gereksinimleri karşılayan uygun toplama yazılımı kullanın: min 25 kHz örnekleme oranı; analog 1,25 veya elektrot kanallar arasında dijital 2 çapraz farklılaşması; bant başak olayları ayıklamak için 8.000 Hz 300 Hz arasında geçiş filtresi. </li><li> Templ örneğin, tek birim aktivitesi elde etmek için mevcut çivi sıralama yazılımı kullanarakSpike2 yazılımı (Şekil 3) dahil olarak eşleştirme tekniklerini yedik. </li><li> Daha fazla analiz için (Şekil 4) veya Temel Bileşen Analizi (PCA) için nüfus vektörleri hesaplamak için (Şekil 5) piyasada mevcut yazılımını kullanarak koku yanıtları ortalama tek bir birim hesaplamak için ayıklanır birimlerinin zaman damgalarını kullanın. Ayrıca tek bir birim ve nüfus yanıt gecikme analiz etmek son yayınları 1,2,25 karşılaştırın lütfen. </li></ol> 5.. Bağıl Elektrot Pozisyon Görselleştirme (Şekil 4) <ol><li> Alexa 568 veya Alexa önce kayıt deneyler için 0.5 M potasyum klorid solüsyonu içinde eritildi 488 hydrazide% 5 hydrazide% 5 ya da bir çözelti içine elektrotlar ipuçları batırın. </li><li> Arı Ringer çözeltisi ile beyin durulayın, deneylerden sonra dikkatlice elektrotları ve kaplama silikon kaldırmak, bezleri ve trakea çıkarın ve tetramethylrhodami minik kristaller eklemekn, dekstran ya da anterogradely ALTS etiket AL içine 1.0 M potasyum asetat içinde çözülmüş,% 5 solüsyonu ekleyin. Karanlıkta aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Boya içine alındı ​​ve bir 30-45 dakika daha arı Ringer çözeltisi ile üç kez beyin yıkanmasından önce, aksonal yolları (30-45 dakika) (Şekil 4A) boyunca çıkıntı nöronlar tarafından taşınacak izin verin. </li><li> Immobilizasyon kadar buz üzerinde arı soğuk ve dikkatle kafa kapsülden beyin kaldırmak. % 4 formaldehit ihtiva eden bir 0.1 M PBS çözeltisi içinde durulama beyin sabitleştirmek ve 4 ° C de bir gece tutmak </li><li> 0.1 M PBS (her biri 10 dk) &#39;de beyni, iki kez yıkamadan önce en az 12 saat bekleyin. </li><li> % 0.2 &#39;in 20 dakika boyunca 3 kez yıkayın beyin Triton artan bir alkol serisi (% 30,% 50,% 70,% 90,% 95,% 100 etanol 3x, 20 dakika içinde dehidrasyon önce 0.1 M PBS içinde seyreltilmiş X-100 her adım). </li><li> Bir mikroskop lamı ve s metilsalisilat de susuz beyin gömBir kapak slayt ile eal. </li><li> Bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın ve bir harmonik Bileşik Planı Apochromat objektif (10X 0.4 NA daldırma) kullanarak her 2-5 mikron optik bölüm olarak beyin tarayın. 568 nm dalga boyu için tetramethylrhodamin dekstran ve elektrot konumu için 488 nm&#39;lik bir dalga boyu kullanılarak doku harekete geçirir. </li><li> Rekonstrüksiyon yazılımına (örneğin. AMIRA veya Fiji) (Şekil 4) ile 3D görüntü yığınlarından gelen lekeli beyin yapıları ve elektrot yolları yeniden. </li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu makalede, üretim ve özel tasarlanmış çok kanallı mikro tel elektrotların kullanımını gösterir. Tarif edilen elektrotlar bir birim ve (ayrıntılar için bkz 1,2,25) bir numune içinde gecikme ölçümleri ve farklı nöron ve farklı neuropils diğer geçici yanıt özellikleri için özellikle yararlıdır nüfus aktivitesini kayıt için uygundur. Ayrıca biz kalıcı güne kadar saat sürecek bal arıları davranıyor istikrarlı, uzun süreli kayıtları izin mikro tel elektrotları nasıl uygulanacağını göstermiştir. Ekstrasellüler çoklu birim kayıtları mekansal bilgi ile birlikte yüksek zamansal çözünürlük elde etmek için olumlu bir araç haline geldi. Bizim durumumuzda, bu paralel nöronal yolları 2 ya da iki farklı neuropils 1. ya vardır. Çoklu nöronlar paralel tek nöron düzeyinde ve yüksek zamansal çözünürlükte kayıt ve analiz edilebilir. Çoklu-birim rekor41 - bulgular ilk böceklerin 39 da daha sonra memelilerde 38 uygulandı ve edilmiştir. Önemli ilerleme dışı çoklu kanal kayıt teknikleri 42,43 geliştirilmesi ve iyileştirilmesi ile elde edilmiştir. Bu, örneğin, yeni elektrotlar 44 veya roman başak sıralama ve kümeleme algoritmaları 45 geliştirme içerir. 48 - hücre-dışı çok üniteli bir kayıt teknikleri genel yöntemler de 46 tarif edilmiştir. Bu videoda gösterilen kendini inşa elektrotlar ayrıca daha elektrot başına microwires veya mikro teller uçları arasındaki ölçülebilir sürekli mesafeleri kazanmak için bükülmüş olabilir ekleyerek adapte edilebilir. Her iki prosedür, ancak, esneklik azaltılması ve elektrot kalınlığı artan yol açacaktır. Yaygın şahin güve, keçiboynuzu ve hamamböceği 40,49 gibi çok daha büyük böcekler dışı kayıtlar için kullanılan silikon sondalar karşılaştırıldığında - </sup&gt; 51 tarif edilen mikro tel elektrotlar esnek, daha küçük olan ve potansiyel beyin hareketleri ile kolayca başa çıkabilir ve bu nedenle, güvenilir bir şekilde daha geniş bir davranış gösterir repertuar arı ve karıncalar gibi küçük sosyal böceklerde kullanılabilir. Tanımlanan mikro teller, yuvarlak esnek ve daha küçük ve hedefi uzun çalışma için ise açık bir avantajdır çevredeki dokuya dolayısıyla daha az zararlı iken çoğu silikon sondalar, onların ekleme kanal boyunca akson ve sinir dokusunun kesilmesi gibi yapıları keskin incik var bir sağlam ve davranışlar hayvan vadeli plastisite. Mikro tel elektrotlar diğer bir avantajı da düşük maliyetli üretim ve kolay kullanımıdır. Bunun yerine dikkatle pahalı silikon sonda temizlik elektrot telleri taze, bu nedenle tıkanıklık olmaması sorunları önce beyin ekleme için kesilir ve. Bundan başka, her iki farklı neuropiles 1 o eklenen aynı hazırlanmasında birden fazla mikro tel elektrot kullanmak mümkündürr yolları 2 biz burada göstermek gibi. Bu yaklaşım, farklı nöral işleme düzeylerde tepki gecikmeleri ve etkileşimler gibi zamansal yönlerini analiz etmek ve karşılaştırmak için özellikle olumludur. Biz bir hücre dışı kayıtlı sinyal başına tek hücre aktivitesini yansıtmadığını bilincindeyiz. Her zaman, elektrot ucu etrafında gerilim etkinliğinin bir bileşiktir. Bir elektrot içinde iki komşu kablo mikro kanallar fark her zaman hesaplanan sinyalinin kaynağını tam olarak belirlemek için. Böylece tek ünite aktivitesini ayıklamak için kullanılan başak sinyalleri için kaynak her zaman bir ya da kolayca ayırt başak dalga şekilleri sonuçlanan diğer elektrot kanala ya da çok yakındı. Uzağa gelen sinyaller, komşu neuropils kas aktivitesi veya etkinlik gibi, karşılaştırılabilir şekilleri ve genlikleri çağrıştıran, aynı anda hem elektrotlar ulaşmak ve bu prosedür ile atılır. Spike2 şablon uygun teknik kullanılarak,Biz aynı değildir tek ünite aktivitesini elde etmek çok emin, ama tek bir nöron aktivitesi için çok yakındır. Ancak, başak sıralama sorunu hücre içi kayıt teknikleri kullanılarak önlenebilir. Keskin elektrotlar veya yama pipet ile ya tek hücre kayıtları, tek bir nöronun fizyolojik özellikleri hakkında derinlemesine bilgi sağlar. Bununla birlikte, küçük bir böcek nöronların büyüklüğü ve nöritlere (arı PNS 52 için, örneğin., En az 1 um), sadece kısa vadeli kayıtları yönetilebilir. Ayrıca, hücre içi kayıtları invaziv olabilir ve muhtemelen zamansal sınırlamalar için bir başka nedendir hücreyi zarar olabilir. Böceklerde in vivo hücre içi kayıtları nadiren bir saat dayanmak. Tek bir tespit nöronun, ventral çiftleşmemiş maxilar nöron # 1 (VUMmx1) dan hücre içi kaydedilen Martin Hammer 53 öncü çalışmaları için yeterli bir zaman penceresi. O l olabilirdoğrudan ödül yoluna mürekkep aktivitesini. Juliane Mauelshagen 54 hücre bir tespit mantar vücut dış nöron aktivitesini kayıtlı, klasik koşullanma sırasında pedunculus dış nöron # 1 (PE1). Onlar Kenyon Hücreler elektriksel stimülasyon sonra LTP bulduğumda aynı nöron Menzel ve Manz 55 odağı oldu. Ancak, Okada ve arkadaşları 56 ekstraselüler kayıtlar sırasında Pe1 tanımlanması için hücre iyi karakterize spike desen (çift ve üçlü ani) kullanabilirsiniz. Her iki yöntemin her bir kombinasyonundan sonra tespit nöronlar ve dışı uzun süreli kayıtlar hücre içi kayıtları gelecekteki araştırmalar için güçlü bir araç olabilir. Ancak, zamansal tepki ilişkileri ve / veya hatta plastik değişiklikleri analiz etmek güne kadar birçok saat boyunca farklı işleme seviyelerde aynı anda birden fazla hücre (adet) kaydetmek için keskin elektrotlar kullanan ineredeyse imkansız. 62 - ilk kalsiyum görüntüleme kalsiyum duyarlı boyalar kullanarak balarısı 57,58 yaklaşımları ile koku yanıtların mekansal desen analizi 59. erişilebilir. Ancak, birçok durumda kalsiyum duyarlı boyalar tekrar arının ömrü ve analiz hücrelerin içsel özellikleri sınırı invaziv manipülasyonlar yoluyla beyin dokusu tanıtılacak olması. Bu sorun, genetik tanıtıldı kalsiyum sensörleri 63,64 kullanarak meyve sineği gibi diğer model organizmalar aşılır. Büyük olasılıkla koku tepkilerin geçici özelliklerini etkileyen kalsiyum tampon olarak hareket edebilir Ancak, genel olarak, kalsiyum algılayıcılar başka sınırlamalar taşıyabilirler. Kalsiyum görüntüleme veya hesaplamalı yaklaşımlar ile birlikte eşzamanlı hücre içi kayıtları görüntüleme uygun zamansal çözünürlük 65,66 işler kanıtlayabilirim. Bununla birlikte, görüntüleme işlemi kendi zamansal çözünürlüğü olan rather sınırlıdır. 2-Foton-Görüntüleme hızlı dizileri 68 elde etmek mümkün olabilir ancak optik toplama sistemleri genellikle, 5-20 Hz 67 bir zamansal çözünürlüğe sahip CCD-görüntüleme kullanın. Ancak, artan örnekleme oranı her zaman uzamsal çözünürlük kaybı ile birlikte gider. Ayrıca honeybee kullanılan kalsiyuma duyarlı boyalar da elde etme süresi 69 azaltan ağartma, geçer. Böceklerde diğer fizyolojik kayıt teknikleri ile karşılaştırıldığında bizim esnek çoklu-kanal mikro-tel elektrotlar tek ünite ve arılar davranıyor nüfus nöronal aktivitenin uzun süre erişim sağlamak. Biz farklı kayıt siteler arasında zamansal kodlama yönlerinin analizini kolaylaştırır aynı hayvan, farklı işleme aşamalarında bu elektrotların ikisini nasıl kullanılacağını gösterdi. Araştırma sorunu ve burada gösterdiği elektrot binanın temel yöntemi böcek modele bağlı olarak kolayca genişletmek edilirmümkün ve / veya adapte edilebilir. Örneğin, bu çok kanallı elektrotları oluşturmak için üç adet tek teller fazla kullanmak düşünülebilir. Buna ek olarak, kayıt sitelerinin sayısı genişletilmiş ve ikiden fazla ya da yolları neuropils zamansal açıdan gözlemlemek mümkündür edilebilir. Temennimiz bu yöntem pek çok bilim adamı ilham kaynağı olacak ve küçük beyinleri gelişmiş nöronal işleme anlayışına olumlu katkı olacaktır.

Bal arısı gibi diğer birçok böcekler ağır olfaction güveniyor. Diğerlerinin arasında bu yönelim, çiftleşme, conspecifics ile iletişim ve yiyecek aramak için koku ipuçlarını kullanın. Onların iyi oluşturulmamıştır koku sistemi çiçek koku uyanlarla ilişkili öğrenme davranışları zengin bir repertuar katkıda bulunmaktadır. (- 5 incelemesi 3 bakınız) Bu davranışlar kolayca kontrollü laboratuvar koşullarında ele alınabilir. Nöron nispeten küçük numaralar ile onların &quot;mini beyinleri&quot; (krş. 6) balarısı koku kodlama eğitim ve nöral aktivitenin izlenmesi sırasında öğrenme için de uygun bir model organizma yapar. Böcekler hem de memelilerde koku alma sistemi (7,8 inceleme için bakınız) büyük ölçüde benzer organizasyonunu göstermektedir. Bal arılarında yılında anten 10,11 boyunca sensillae bulunan yaklaşık 80.000 reseptör nöronlar 9 neur içine çevre koku uyaran çevirmekÖnal sinyali. Olfaktör reseptör nöronlardan gelen aksonlar omurgalı koku ampul karşılaştırılabilir bir glomerüler organizasyona sahiptir antennal lobu (AL), innerve. AL 4000 yerel internöronlar (LN) ile birbirleri ile bağlantılı yaklaşık 164 glomerül içerir (inceleme için 12). Özellikle balarısı o LN yamalı yanal bağlantı sağlamak ve farklı subpopülasyonunun element ve configural koku kodlama özelliklere 13,14 sahip olduğu son zamanlarda kanıtlanmıştır. AL medial ve lateral antennal lob yolu (m-ve l-ALT sebebiyet veren bir ventral ve dorsal hemi lobun bölünerek gösterilmiştir; eskiden m-ve medial-lateral antennal lob protocerebral l-APT olarak adlandırılan ) 15-17 cezbet. İşte böcek beynin bir birleşik adlandırılması için yeni bir çaba tarafından tanıtılan yeni bir sistem terminoloji 18 kullanılacaktır. Her iki ALT basılı (l-ve m-ALT) 410 (l-ALT) veya 510 (m-ALT) uniglomerular Proje ya da kombinection nöronlar (PN), sırasıyla 15,16,19. Her iki yollarında PNS son zamanlarda (inceleme için 17,20 bakınız) paralel 2 kod koku gösterilmiştir ve hem yolları synaptically Kenyon Hücreleri (KC), mantar gövde (MB) anapara nöronlar ile farklı bağlantıları oluşturur. 23 - Her MB yaklaşık 172.000 kcs 21 içerir. MB uyarıcı entegrasyon, öğrenme ve hafıza oluşumunda rol oynadığı bilinmektedir. Vertica veya alfa-lob ve yatay veya beta-lob 22,24: keratinosit karsinom axo dentritler iki ana çıkış bölgeleri var pedinkülde (mantar kök) oluşturur. MB çıkışı sadece yaklaşık 400 dış nöronların (EN) 24 yakınlaşıyor. Koku bilgi işleme sorumlu çoğunlukla dikey lobun 22 ventral innerve ens. Son zamanlarda, bu alanda kaydedilen Ens&#39;i koku ödül ilişki 25 kodlayan gösterilmiştir. Olarak Temporal29 - böcekler gibi omurgalıların koku alma sistemi içinde cevapların dağılımı potansiyel kodlama ilke 26 gibi önemli ve anlamlı bir yönü haline gelmiştir. Aynı anda yüksek temporal çözünürlük farklı sitelerden birden nöronlar kayıt yapabilmek için, biz arı koku sisteminde farklı hedef bölgelere tanıtıldı özelleştirilmiş çok kanallı tel elektrotlar kullanılarak çift çoklu birim kayıt tekniklerini kurulmuştur. Bu yaklaşım tek nöronların ve ya paralel koku yolları, ikili koku yolunun 2 veya farklı sonraki neuropils 1 arasında var nöronların popülasyonlarının düzeyinde balarısı koku sisteminde zamansal işleme, analiz ve karşılaştırma için bize sağlar. Son zamanlarda elektrotlar farklı bir yapılandırma kullanarak çekirge koku alma sistemi 30 benzer bir deneysel yaklaşım ile plan-değişmeyen koku tanıma 31 için zamanmekansal kodlama mekanizmasını analiz başardık. ThBize, kurulan ikili kayıtları eşzamanlı nöronal aktivite profilleri hakkında mekansal bilgi toplama etkinleştirin. Kalsiyum görüntüleme elde geniş uzamsal örnekleme göre bu yöntem sadece iki noktalar kaydedilmesini sağlar. Bununla birlikte, kalsiyum görüntüleme tekniklerine göre avantajı ise, geleneksel CCD görüntüleme ya da 2-ya da foton görüntüleme satın tarafından temin edilemeyen bir eylem potansiyeli kayıtlarında, yüksek zamansal hassas olduğunu. Burada tarif edilen hücre dışı bir sürekli olarak implante elektrotlar ve elektrot sürüklenme kaçınarak, beyin ve kafa kapsül göre sabitlenir. Bu keskin hücre içi elektrotların kullanımı ile karşılaştırıldığında açık bir avantajdır. Hücre içi kalsiyum kayıtları ve görüntüleme kıyasla diğer bir avantajı, çok saatler güne kadar değişen uzun bir gözlem sinir zamandır. Bu öğrenme ve bellek oluşumu sinirsel araştırmak için önemli bir ön koşuldur. Çok ek faydalarbirim kayıtları ayrıca tartışma bölümünde özetlenmiştir. Bu metodolojik genel olarak özel tasarım tel elektrotlar imalat prosedürü, gösterilir 32,33 uyarlanan ve balarısı beyinde uzun süreli çoklu birim kayıtları için uygundur. Buna ek olarak, bu tür elektrotların sürekli olarak aynı anda kaydetmek üzere bal arısı koku alma sistemi içinde iki farklı kaydına implante nasıl bir örnek L-ve çok stimülasyon protokolleri izin vermek için, uzun süre boyunca m-ALT 2 gösterilmiştir. Kayıt pozisyonların doğrulanması için kayıt sitelerin boyama ve sonrası kayıt görselleştirme için bir örnek ve protokol sağlanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>76235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odors</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Methanol free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>BioChemica</td>
			<td>A1388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylsalicylate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4529.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7162</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10437</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bee Ringer Solution</td>
			<td>see 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane-coated copper wire</td>
			<td>Elektrisola</td>
			<td>15&#181;m diameter &#38; P155 insulation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax&#160;</td>
			<td>Densply Detrey</td>
			<td>64103015S1</td>
			<td>moderate melting point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax</td>
			<td>Flexaponal&#160;</td>
			<td>124-202-00</td>
			<td>low-melting Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWIK SIl</td>
			<td>WPI</td>
			<td>03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 Pin Socket</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>189634-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot melting glue</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>827673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soldering needle</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>830283</td>
			<td>12 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering terminal lug&#160;</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>531901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glaselectrodes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td>V2A 0.2 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>switchable headstage</td>
			<td>Tucer Davis Technologies</td>
			<td>SH16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage connection module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>INT-03M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier Module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>PDA-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition boards</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6123, Ni-6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Lab View 8.2</td>
			<td>custom design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-Sorting&#160;</td>
			<td>CED&#160;</td>
			<td>Spike 2 v7.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG-wires</td>
			<td>WPI</td>
			<td>AGT05100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP2 AOBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMIRA</td>
			<td>Mercury Computer Systems&#160;</td>
			<td>2/5/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees

Memeliler ve böcekler hem de nöronal bilgiler farklı yüksek ve düşük seviyede beyin merkezlerinde işlenir. Bu merkezler yakınsak ve ileri besleme ve geri besleme kabloları dahil olmak üzere farklı anatomik bağlantıları yoluyla birleştirilir. Ayrıca, aynı menşe bilgisi kısmen farklı ve bazen aynı beyin alanlara paralel yollar aracılığıyla gönderilir. Bu kablo stratejileri ve birbirlerine özellikle geçici bağımlılıkları evrimsel yararları yanı sıra sayısal avantajları anlamak için, bu yüksek zamansal çözünürlükte Aynı müstahzar içindeki değişik yolları veya neuropiles tek nöron eş zamanlı erişim için gereklidir. Burada iki müteakip neuropiles 1, antennal lobun (AL), ilk koku işleme aşamasında ve mantar gövdesinin (MB), daha yüksek dereceden entegrasyon merkezi invo multi ünite aktivitesini kaydetmek için eşsiz bir hücre dışı uzun süreli erişim göstererek bal arıları üzerinde yoğunlaşmaköğrenme ve bellek oluşumu, ya da MB ile AL bağlayacak iki paralel nöronal yolları 2 lved. Ikinci bir örnek olarak seçilmiştir ve tam bir şekilde tarif edilecektir. Destekleyen video inşaat ve esnek çok kanallı teli kalıcı ekleme gösterilmiştir. Mikro telidir kanalları İkili diferansiyel amplifikasyon ölçüde gürültüyü azaltır ve sinyalin kaynak yakın elektrot ucunun konumu ile ilişkili olduğunu doğrular. Kullanılan tel elektrotlar mekanik esneklik sağlar: istikrarlı, uzun vadeli invazif kayıtlar çok saat boyunca, geleneksel olarak ilave ve hücre içi vivo kayıt teknikleri ile karşılaştırıldığında açık bir avantaj olan gün kadar.

&quot;Mevcut protokol bireysel arıları içinde iki farklı işleme aşamalarında eş zamanlı kayıtlar sağlar ve ayrıca örneğin yoluyla öğrenme ve hafızanın altında yatan mekanizmaları test etmenize olanak sağlar., Ölçülü bal arıları içinde klima PER.&quot; Bu nöronal işleme zamansal yönlerini analiz etmek için bir ön koşuldur. Farklı bilimsel yaklaşımlar arının koku alma sisteminin nöronal ağı çözülmeye için yöntem kolaylıkla uyarlanabilir. Örneğin, bu yöntem honeybee ikili koku yolunun, l ve m-ALT PNS (Şekil 5) içinde PNS zamansal işleme analiz etmek için, (i) kullanılır. Şekil 5A aynı anda m-ALT bir PN ile kaydedilen bir l-ALT PN bir örneği on deneme ortalaması olarak verilen ve renk kodlu ısı komplo olarak beş farklı koku konsantrasyonları açısından tepki gücü ve gecikmeyi göstermektedir edilir. 11 l-ve 13 mA ile yedi arıların bir ortalamaLT PNS (Şekiller 5B, 5C) tepki gücü hem de cevap gecikme hem de belirli bir dereceye kadar, odorant konsantrasyonunu yansıttığını göstermektedir. Artan Odorant konsantrasyon ile cevap gecikmesi (Şekil 5B, 5C) azalırken, böylece bu örnekte PNS tepki gücünü artırmak. Bu sonuç oldukça sınırlı ve analiz koku verici madde için geçerlidir, ama yine AL 37 son hesaplama modelleri ile uyumludur. Arının AL koku konsantrasyonu kodlama lineer olmayan hesaplamaları yatan ya da diğer kodlama özellikleri hala gelecekte analiz edilmesi gerekir temelini olsun. Ayrıca yöntem, (ii) iki daha sonraki işlem aşamalarında, AL ve MB-çıktı (Şekil 6) en nüfus aktiviteye zamansal açıdan karşılaştırmak için kullanılabilir. Temel bileşenler analizi (PCA) koku hesaplama uzun ve PN düzeyde tüm koku tanıtımı dayanmak olduğunu göstermektedir oysa ENSette ve kapalı yalnızca koku nüfus aktivitesi (Şekil 6) olarak temsil edilmiştir s. PN aktivite hala (krş. Film 1) gelişmekte olan zaman böylece EN nüfus bir zaman noktasında zaten maksimal aktivitesini ulaştı. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> ... Şekil 1. Üç kanallı mikro-tel elektrotları İmalat A1) üç tellerin uçları Pozisyonlar 11, 13 ve 16 A2) Dört lehim pabuçları bir pleksiglas plastik taban plakası üzerine vidalanır bir IC pin konnektör lehimli; Bir minutien pim daha sonra plastik levha. A3) plastik levha, bir IC pim bağlantısı ve her telin serbest ucu üstüne yapıştırılır bağlanmış bir cam boru ucuna sokulur En iyi lehim birine lehimlenmiştir pabuçlar. &lt;İnce bakır teller ile elektrot tutucu donatmak strong&gt; B1), kılcal sahibinin baz daha sonra cihazı hizalanması özel yapılmış sabittir) bir kez daha. B2 dışarı alınmalıdır. . Üç bakır mikro teller B3) paralel mikro teller diş balmumu ile yapıştırılır ve kılcal yerde (uzun oklar) geri koymak her ucunda oluk boyunca hizalanmış ve yapışkan bant ile sabitlenir; yapıştırılmış mikro teller daha sonra bakır teller üç gevşek uçları, böylece elektriksel temas içine getirilmesi üç üst lehim pabuçları lehimlenmiştir diş balmumu ve uçları (kısa oklar) kesilir. B4) ile kılcal bağlıdırlar IC pimli konektör. C1) tam olarak monte iki elektrot, bu amaç için, tek bir headstage. C2) ile kullanılmak bir elektrot (sol, slave) ve pimler doğru (diğer elektroda yalıtılmış kablo ile bağlanır için birbirine bağlanabilir direk) er, burada kafa aşamasına bağlıdır; headstage bağlı elektrot da bir kas (M17) ve referans elektrot (Ref) girdi toplayabilirsiniz. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2,. Hazırlanması ve arı beyin içine sürekli elektrot yerleştirme. A) arı buz üzerinde hareketsizleştirme sonra Plexiglas tutucu içine sokulmaktadır. Flagellum (FL) ve Scapus (SC) ile anten kafa) B. Gösterilir ve antenler diş balmumu kullanılarak tespit edilir. C) baş kapsülü traş edilir ve arı) şekerli su. D ile beslenen kafa kapsülü açıldı. E) beyin üstünden bezleri ve trakea çıkarılmasından sonra, farklı neuropiles ve başlıca yerler kolayca ayırt edilebilir. Alts yörüngeleri ile birlikte gösterilirelektrotlar yerleştirilir bir işareti. (MB: Mantar vücut, AL: Antennal lob, OL: Optik lob, α: Alfa lob veya dikey lob, ALT: antennal lob yolları, E1: m-ALT kayıtları için elektrot yerleştirme tarafı, E2: l-ALT için elektrot yerleştirme yan kayıtları). F) Başvuru (Ref) ve kas elektrotlar (M17) sonra manikür veya bileşik göz. G) tel elektrotlar uygun siteler. H de beyin içine sokulur) küçük deliklerden baş kapsülü içine sokulur iki bileşenli silikon kullanarak yerine elektrotlar sabitleme, arı hala PER gösterir ve klimalı (örn.., şeker su kullanarak). <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> Iki nöral yolları ve tek ünite ekstraksiyon (başak sıralama). Bir de Şekil 3.. Ekstrasellüler kayıt </strong&gt; deney düzeneği) şematik çizim. Arı bir pleksiglas tutucuya sabitlenmiş durumdadır. Koku stimülasyon bir cam tüp ile sağlanmaktadır. İki elektrot sap maruz arı beyinden kayıt edilmiştir. B) bir konsantrasyonda su çözeltisi içinde bal bir 500 msn koku uyarılması için her iki yolları ile ilgili uyarıcı yanıt gösteren l-ve m-ALT PNS (yeşil ve mor izleri) gelen eş zamanlı kayıtları 1:100, en 33 ° C. Her çizilen çizgi A Bar&#39;da elektrot lehim pabuçları renk kodlu etiket olarak farklılaşmış kanallarını temsil eder: tek aksiyon potansiyelleri kriteri ve renk kodlu 50 mV C) başak sıralama işlemlerinden sonra.. Sıralanan birimlerinin Yerleşimi dalga ayrılmasını göstermektedir. D) Spike aralık histogram yeterli başak sıralama kanıtı olarak sıralanmış birimlerinin ayrılması kalitesini gösterir. Ünitenin refrakter dönem içinde herhangi bir başak olduğunu unutmayın. E) İki Defa (E1, E2)birbirine sıralanmış birimlerinin mesafeyi gösterir, temel bileşen analizi ile sıralı biriminin 3D kümeleme. Çemberler uzayda SD ve benzer) Renk kodlu birimleri tek yolu kayıt üç kanalları büyütme görünür aksiyon potansiyelleri tasvir ana bileşen uzay F kümelerin önemli bir farklılaşma gösterir 2.5 kat Mahalanobis mesafeyi belirtir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. Post-kayıt görselleştirme ve kayıt konumuna 3D-rekonstrüksiyon. Bir antero maksimum yoğunluğu hizalama ile z ekseni boyunca orto-dilimlerinin A) Projeksiyon görünüşüdürve MB ve LH AL çıkıntı uniglomerular projeksiyon nöronlarının retrograd dolgu. Hücre içi tracer Microruby (tetramethylrhodamin dekstran) kayıt deneylerden sonra AL sokulmuştur. Alexa olan iki elektrot bir boyama maksimum yoğunluğu hizalama ile z ekseni boyunca orto dilimlerin AL kanıtı uygun PN lekeleme. B) projeksiyon görüntüsü içindeki lekeli glomerül m-ALT (E1, ok için elektrot yerleşimini gösteren 488 hydrazide ) ve l-ALT (E2, ok). İzleyici Alexa hydrazide 488, elektrot çevresindeki dokuya göç ve elektrot yerleştirme sitesi boyar. AL belirgin boyama birlikte balarısı koku alma sisteminin (şematik bir bakış ile yüzeysel bir eser lekeli hedef hücreler (PNS). C) 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve A, B (sağ taraf gelen elektrot ekleme site), Not sol l-ve m-ALT yörüngeleri göstergesi yan). Sadece uniglomer, Notular PN yolları gösterilmiştir. AN: antennal sinir, AL: antennal lob, LH: yan boynuz, MB: mantar gövde, E1, E2: elektrot ekleme siteleri, m-ALT: medial antennal lob yolu, l-ALT: yanal antennal lob yolları, c: kaudal, r: rostral, m: medial, l:. yanal <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> Koku yoğunluğu kodlama Şekil 5,. Örnek çift koku yol içinde. A) ısı araziler tek l-ALT (yeşil tepkisini göstermektedir) ve tek m-ALT PN (Mor) koku verici madde tepki olarak tek bir honeybee aynı anda satın (10 -6 1:100 1 ilâ) koku Artan konsantrasyonlarda heksanal. Her satırı on deneme stimülasyonu bir ortalamaulation. Ateşleme hızı 7 kaydedildi arılar 11 l-ve 13 m-ALT PNS. B) Nüfus tepki gecikme çıkarılır spontan aktiviteye ilişkin ateşleme oranı göreceli yoğunluk değişim olarak gösterilir. Her arı hem sistemince PNS aynı anda kaydedildi. Nüfus cevap gecikmesi hem sistemince PNS koku konsantrasyonu artan azalan bir gecikme gösterir. 99 msn de antenlerden de koku tepki başlangıçlı electroantennograms aracılığıyla kaydedildi ve PN tepki gecikmeleri çıkarılır. Tepkiler gecikme ölçümleri için çok zayıftır ve bu nedenle, tepki gücü artmaktadır koku artan konsantrasyon ile B&#39;de olduğu gibi aynı PNS ateşleme hızı. C) nüfus yanıt alınmadı düşük konsantrasyonlarda unutmayın. L-ALT daha güçlü bir tepki kuvvetini gösterir. B, C, ortalama ve SD verilmiştir. <img alt="Şekil 6," fo:content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 6,. Bal arısı en koku yolu boyunca iki daha sonraki işlem aşamalarında nüfus aktivitesi ile karşılaştırılması. Veriler 1-heksanol ve 2-oktanon. A) ile uyarıldı 20 hayvanlarda kaydedildi her satır yanlış renk kodlu bir çıkıntının ortalama ateşleme hızı temsil eder nöron (PN) 1-heksanolün 10 koku tekrar karşısında hesaplanmıştır. Koku sunum 0 zamanda başlar ve üç saniye. B sürdü) A&#39;da olduğu gibi aynı gösterir) ama mantar vücut dış nöronların (EN) için. A &#39;de gösterilen matris) 1-hekzanol ile koku uyarılması sırasında bir PN nüfus vektörü olarak görülebilir. Biz 2-oktanon ile koku uyarılması sırasında nüfus vektörü aynı tür hesaplanır ve zamansal boyut. C tutarak bir temel bileşen analizi hem vektörleri (PCA) kullanılan) ilk üç temel bileşen (PC1, 2 ve 3) idiantennal lob çıkışında PN grup etkinliği olarak koku ayırma göstermek için birbirlerine karşı çizilmiştir. Koku başlamasından önce zaman siyah işaretlenir. 1-heksanol ile uyarma üç saniye boyunca mavi aktivitesi gösterilmiştir. 2-oktanol ile uyarılması esnasında aktivitesi kırmızı gösterilir. Ayrıca, 1-hekzanol (açık mavi) ve (pembe) 2-octanonen kümesi koku sonra aktivitenin 1.5 saniye (post) göstermektedir. PN topluluk düzeyinde çok farklı yörüngeler çağrıştıran hem de kokuları &quot;sabit nokta&quot; outlasts bütün koku uyarımı döneminde yerleşmek unutmayın. Koku ofset sonra yörüngeleri koku uyarımı olmadan geri temel aktiviteye taşıyın. D) Aynı analiz mantar vücut çıkışında faaliyeti temsil EN topluluk düzeyinde yapıldı. PN aktivitesine kıyasla kokuları daha az belirgin yörünge çağrıştırıyor. Ayrıca bir &quot;sabit nokta&quot; gözlemlenebilir değildir. Başlangıçta koku kaynaklı yörüngeleri intekoku hala mevcut olsa da başlangıç ​​etkinliği ile rmingle. Ofset yalnızca, koku ilave bir yörünge uyandırdı. <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">. Movie 1</a> Zaman PN-nüfus vektörü (solda) ve EN nüfus vektörü temel bileşen analizi sonra bir koku uyarılan yörünge değerlendirilmesini çözüldü. (. hakkı; cp Şekil 6) üst kısımları ilk üç temel bileşeni (PC1 içerir 2 ve 3) birbirlerine karşı çizilmiştir. Daha altta olan paneller zaman içinde PC1, 2 ve 3&#39;ün değerlendirilmesini göstermektedir. Koku stimülasyon gri çubuk ile işaretlenir. Tüm paneller senkronize edildi. EN nüfus etkinlik PN nüfus etkinlik öncesi biraz başlayacağını unutmayın, contraintuitive gibi görünüyor ama bir fenomen bağlantısı ve önceki 1 tartışılmıştır ilgili katmanları, özellikleri ile açıklanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees at JoVE.com

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

İki farklı beyin neuropiles veya iki farklı anatomik yolları eşzamanlı dışı uzun süreli kayıtları arıları kuruldu. Bu kayıtlar farklı beyin bölgelerinde tek nörona yanı sıra davranıyor hayvanda topluluk düzeyinde karşısında nöronal işleme zamansal açıdan soruşturma izin.

Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

simultaneous-long-term-recordings-at-two-neuronal-processing-stages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.8K Görüntüleme.  University of Würzburg.  İki farklı beyin neuropiles veya iki farklı anatomik yolları eşzamanlı dışı uzun süreli kayıtları arıları kuruldu. Bu kayıtlar farklı beyin bölgelerinde tek nörona yanı sıra davranıyor hayvanda topluluk düzeyinde karşısında nöronal işleme zamansal açıdan soruşturma izin. 

Video: Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Çoklu Ölçeklerde Sayısallaştırılmış Nöronal Morfoloji Otomatik Sholl Analizi

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Nörobilim

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Hayvanlar davranmak, Awake Tek-birim Recordings Microwires Organize Dizileri implantasyon için Usulü

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

Fareler serbestçe davranıyor uzun vadeli duyusal çatışma

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...