Bu çalışma K. Teter NIH hibe R01 AI073783 tarafından finanse edildi. Biz yazının eleştirel okuma Subselüler fraksiyonasyon protokolü ve Helen Burress gelişimi Dr. Shane Massey yardım için teşekkür ederim.

1. Digitonin, hazırlanması <ol><li> Bir mikrosantrifüj tüp 500% 100 etanol mcL ekleyin ve 80 ° C de 10 dakika süreyle bir ısı bloğu yerleştirin. </li><li> Digitonin% 1 hisse çözüm üretmek için ısıtmalı etanol 250 mcL digitonin 2.5 mg eritin. </li><li> % 0.04 digitonin çalışan bir çözüm üretmek için, 960 mcL HCN tampon (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-ethylmaleimide, ve proteaz inhibitörü digitonin stok solüsyonu 40 mcL ekleyin kokteyl). </li></ol> 2. Hücre zehirlenme ve permeabilization Bizim translokasyon tahlil toksinler ve hücre hatları bir dizi yapılabilir. Aşağıda, kolera toksini (CT) tespiti için detaylı bir protokol sağlar. Prosedürün bir bakış Şekil 1&#39;de verilmiştir. <ol><li> HeLa hücrelerinde% 10 ile desteklenmiş 1 ml DMEM içeren 6-kuyucuğu numaralı seribaşı fetal sığır serumu ve antibiyotik-antimikotik1x10 6 hücre elde etmek için / iyi bir gecelik inkübasyon 37 ° C Tekrarlanabilir tespiti için yeterli sitozolik toksin oluşturmak için, üç nüsha kuyuları, her bir durum için gereklidir. </li><li> Bir gecelik inkübasyondan sonra, 1 ml DMEM gangliozid GM1 100 ng / ml içeren kültür ortamı değiştirin. BT GM1 reseptör GM1 bir çözüm maruz kalan hücrelerin plazma zarı içine enterkale Bu, CT için bağlayıcı sitelerinin sayısını artırır. </li><li> 37 1 saat inkübasyondan sonra ° C, GM1 içeren orta kaldırmak ve DMEM ile hücreler iki kez yıkayın. Sonra, 4 hücrelerin ° C 30 dakika 1 ml DMEM CT 1 mcg / ml içeren. </li><li> 37, toksin içeren orta çıkarın DMEM ile hücreler iki kez yıkamak ve 1 ml DMEM hücrelerin inkübe ° C istenilen zaman aralığı (ler). </li><li> Her kovalama dönemi sonunda, hücreler PBS ile yıkama ve PBS içinde 0.5 mM EDTA 250 mcL ile her kuyu kuluçkaya yatmaktadır. Hücreler 10 için bekletin<html> sonra oda sıcaklığında dakika ve 6-P1000 Pipetman dinç öğütme plaka bunları kaldırmak. Hücrelerinin bir kuyu toplanan edildikten sonra, aynı durum ikinci ve ardından üçüncü birleştirin. Hücre kazıyıcılar hücreleri toplamak için kullanılabilir. </li><li> Kombine hücre süspansiyonu, tek bir mikrosantrifüj tüp içinde üç çoğaltmak kuyu (750 mcL toplam hacim), koyun ve 5.000 x g. 5 dakika için bir masaüstü mikrosantrifüj çok spin Kabaca eşdeğer büyüklükte Hücre pelet tüm koşulları sağlanmalıdır. </li><li> Süpernatantı atın ve% 0.04 digitonin çalışma çözeltisi 100 mcL hücre pelletini tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonu 10 dakika buz koyun. </li><li> 16.000 xg de 10 dakika süreyle bir masaüstü mikrosantrifüj digitonin permeabilize hücreleri dönerler. Sitoplazmada içeren süpernatant fraksiyonu, taze bir mikrosantrifüj tüp transferi ve organel içeren pelet fraksiyonu korumak. </li></ol>başlığı &quot;&gt; 3 örnek hazırlama <ol><li> Cytosol içeren süpernatant kesirleri HCN son hacim 1 ml tampon seyreltilir. En az 1 mL örnek hacmi, hava enjeksiyon öncesi 500 mcL örnek döngü temizlenir sağlamak için gerekli. </li><li> Organel içeren pelet kesirler 1 ml% 1 Triton X-100 içeren HCN tampon yeniden süspanse. Deterjan eklenmesi toksin membran kaplı havuzu serbest bırakmak için gereklidir. </li><li> 100 konsantrasyonları, 10, 1, ve 0.1 ng / ml Toksin standartları HCN tampon hazırlanır. </li><li> Sitozolik ve organel kesirler paralel setleri fraksiyonasyon prosedürünün doğruluğunu onaylamak için bir kontrol deneyi için hazırlanmıştır. Kesirler Bölüm 2&#39;de açıklandığı gibi 20 mcL 4x örnek tamponu (sitozolik fraksiyonu) veya 1x örnek tamponu (organel fraksiyonu) 120 mcL yeniden süspanse oluşturulur. Her fraksiyonu eşdeğer miktarda sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile çözümlenir ve b probedy Western Blot analizi supernatant fraksiyonu sitozolik protein bölümleme ve pelet fraksiyonu 16-19 çözünür, yerleşik ER protein göstermek. </li></ol> 4. SPR slayt hazırlama <ol><li> Reichert SR7000 SPR Refraktometre SPR deneyler için kullanılır. </li><li> SPR enstrüman Kendi oluşturduğunuz bir tek tabaka ile altın kaplamalı bir cam slayt ayarlayın. 41 mcL / dak akış hızında 10 dakika için slayt üzerinde 0.4 M EDC ve 0,1 M NHS çözüm: sensör slayt etkinleştirmek için, 1:1 (v v) serpmek. Tüm sonraki perfüzyonları aynı akış hızı kullanacaktır. </li><li> EDC kaldırmak için: NHS aktivasyon tampon, plaka PBS% 0.05 Tween 20 (PBST) içeren 5 dakika yıkayınız. NHS çözüm: plaka EDC tarafından Sır nedeniyle reaktif amid hayvan iplerini içerir. </li><li> 15 dakika için 20 mM sodyum asetat (pH 5.5) 1:20,000 bir seyreltme aktif sensör slayt üzerinde bir anti-CTA antikor serpmek. Refraktif bir ilk düşüşdex birimi (RIU) pH değişikliği nedeniyle görülecektir. Bu antikor sensör slayt amid-reaktif hayvan iplerini tarafından yakalanır RIU bir artış ile takip edilecektir. </li><li> 5 dakikalık bir PBST yıkama ile sensör slayt bağlanmamış antikor çıkarın. Yakalanan antikor tarafından üretilen RIU sinyal plato ve stabilize, yeni bir temel sinyal sağlayarak. </li><li> 5 dakika boyunca sensör slayt üzerine serpmek 1 M etanolamin (pH 8.5). Bu kapaklar ve sensör slayt sol bağlanmamış hayvan iplerini inaktive. </li></ol> 5. Numune SPR analizi <ol><li> 5 dakika süreyle antikor kaplı bir sensör üzerinde bir temel okuma, yayma PBST kurmak için. </li><li> 300 saniye boyunca sensör üzerinde deneysel bir örnek veya toksin standart serpmek. Başka bir 200 sn için tampon ve sensörün üzerine serpmek PBST ligand çıkarın. </li><li> Her perfüzyonu takiben, bağlı toksin pH 5.0 PBST ile 100 saniye yıkama sensörü kaldırılır. Bu sinyal dönecektirböylece başka bir örnek aynı sensör üzerinde işlenecek sağlar. ilk temel okuma, </li><li> Yeni bir örnek yüklemeden önce, bir önceki örnekten herhangi bir kalıntı sıvı sınırdışı örnek döngü içinde küçük bir miktar hava itin. 5,2-5,4 özetlenen yordamı kullanarak, önemli temel sinyal kaybı olmadan bir slayt 12 örnek için çalıştırmak. </li><li> Veri analizi Scrubber 2 yazılımı ile yapılır, ve Igor yazılım rakam hazırlanması için kullanılır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Pertussis toksini (PT) Bir zincir (PTS1) 3, 12 sitoplazmada girmeden önce ER hücre yüzeyinde hareket bir AB toksin. Şekil 2&#39;de görüldüğü gibi, SPR tabanlı translokasyon testi sarhoş CHO hücreler sitoplazmada PTS1 tespit olabilir. Sinyal yok PTS1 anti-antikor ev sahibi sitoplazmada bir bileşeni ile çapraz tepki vermedi doğruladı unintoxicated hücreleri, sitoplazmada oluşturulmuştur.brefeldin A (BFA) varlığı sarhoş hücreleri sitozolik fraksiyonu da olumlu bir sinyal üretmek için başarısız oldu. BFA ER translokasyon sitesinde 6-8, 12, 20-25 ve böylece sitoplazmada zinciri teslim toksin taşıma önler. Her çalışma sonunda, bağlı toksin sensör slayt kaldırılır. Bu izin çok sayıda örnekleri tek bir sensörü slayt gösterildi ve böylece farklı deneysel koşullar altında elde edilen sonuçlar arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlanacak. BT, başka bir AB-tipi, ER-translocating toksin 4. Şekil 3A, CTA1 CT-tedavi HeLa hücrelerinde sitozolik bir kısmını tespit edildi. Bu bizim metodoloji birden fazla hücre tipleri ile çalışır ve bir anti-Bir zincir antikor mevcut olduğu için herhangi bir toksin uygulanabilir olduğunu vurguladı. CT-tedavili hücrelerde sitozolik fraksiyonu, bir anti-CTB antikor (Şekil 3B) ile kaplı bir SPR sensör üzerinden perfüze iken sinyal böylece CTA1 gösteren tespit edildisubunit ancak hücre bağlayıcı CTB pentamer sitoplazmada girer. Şekil 3C organel fraksiyonu sinyal zayıf sinyal sitozolik fraksiyonu karşılaştırma ölçekli gösterir. Bu da sitoplazmada ulaşabilirsiniz toksin miktarını sınırlar ER translokasyon sitesi 6, 7, BT ulaşım bilinen verimsizlik ile uyumlu idi. Ayrıca, organel fraksiyonu CT holotoksin yanı sıra ER-lokalize CTA1, organel kısmı için sonuç SPR sinyali holotoksin ilişkili CTB pentamer ek bir kitle tarafından şişirilir içerir. Böylece, aynı sensorgram organel ve sitozolik kesirler verileri çizmek için pratik değildir. Bizim test transloke, sitozolik toksin (Şekil 4) zaman bağımlı birikimi izleyebilirsiniz. Hücreler, 4 BT maruz kaldılar ° C, plazma zarı toksin bağlayıcı izin verir, ancak hücre ile ilişkili toksin içselleştirilmesi engelleyen bir sıcaklık. Remo sonrabağlanmamış toksin val, hücreler 37 ° C&#39;ye kadar ısındı. ER toksin taşıma zinciri ve sitoplazmada translokasyon Her ikisi de bu sıcaklıkta oluşabilir. Sitoplazmada 15 dakika ısıttıktan sonra toksin 37 ° C tespit edildi Bu ER (i) holotoksin ticareti için gerekli gecikme süresi yansıtıyordu; ER (ii) A / B altbirim ayrılma ve sitoplazmada (iii) Bir zincir ihracat. Sitozolik toksin küçük bir havuz C ° 37 30 dakika sonra tespit edildi ve 45 ve 60 dakikalık bir kovalamaca aralıklarla sitozolik toksin aşamalı olarak büyük miktarlarda sonra tespit edildi. Sitozolik toksin bile daha fazla düzeyde, bu nedenle, ev sahibi sitoplazmada hücre ile ilişkili toksin sürekli, uzun vadeli teslimat gösteren, 5 saat kovalamaca aralığı 17 sonra tespit edildi. Bizim tahlil de sitoplazmada toksin translokasyon inhibisyonu (Şekil 5) algılayabilir. Hücreler% 10 dimetil sülfoksit (DMSO), termal bozukluklar engelleyen kimyasal bir hastabakıcı ile tedavisi izole CTA1 subunit (T. Banerjee ve K. Teter, yayınlanmamış gözlemler), tedavi edilmemiş kontrol hücrelere kıyasla düşük seviyelerde sitozolik CTA1 sergiledi. Toksin Unfolding Bir zincir sitoplazmada 16-18 translokasyon için bir ön koşul olduğunu, buna göre CTA1 DMSO indüklenen istikrar ER sitoplazmada hareketini engelledi. SPR deneyler hesaplanan dernek hız sabiti (k), perfüzyon tampon 14, 15, 26 ligand konsantrasyonu ile doğru orantılıdır . Böylece, bir grafik sitozolik toksin konsantrasyonu belirlemek mümkün k toksin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak toksin standartları için bir değerler çizer. Bu prosedür Şekil 5 sunulan toksin translokasyon DMSO bağlı blok ölçmek için kullanılır: toksin bilinen konsantrasyonlarda üretilen standart eğri bir sitozolik CTA1 concentrat hesaplamak için kullanılır.iyon 0.3 ng / ml, tedavi edilmezse hücreleri ve DMSO muamele edilen hücreler için 0.1 ng / mL (Şekil 6). DMSO tarafından unfolding CTA1 inhibisyonu böylece CTA1 ER-sitoplazmada translokasyonu 3 kat bir azalma elde etti. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> Şekil 1. Protokolü genel bakış. (A) Hücreler, 4 AB toksin ile inkübe ° C, hücre yüzeyinde toksin bağlayıcı sağlar ancak toksin endositoz engeller bir sıcaklık. Toksin A ve B alt birimden, sırasıyla, kırmızı ve mavi çevreler tarafından temsil edilmektedir. (B) Sınırsız toksin ortamdan uzaklaştırılması ve hücreler ° C ER holotoksin endositoz ve retrograd ulaşım teşvik etmek amacıyla 37 ısındı. Holotoksin disosiasyon ER, izole bir zincir ER membran protein iletken bir kanal (lar) geçerek sitoplazmada girmenizi sağlar oluşur. (C) Hücreler için seçici plazma permeabilize digitonin ile tedavi edilirmembran. (D) Santrifüj ayrı sitozolik ve organel kesirler bölümü hücreler için kullanılır. Digitonin oluşturulan gözenekler aracılığıyla hücrenin sitoplazmada sıkılarak ve süpernatant yer almaktadır. Sağlam, membrana bağlı organelleri pelet fraksiyonunda bulunur. (E), ev sahibi sitoplazmada toksin A zincirinin transloke havuzu algılamak için supernatant fraksiyonu, bir anti-A zinciri antikor ile kaplı bir SPR sensör üzerinden perfüze. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> Şekil 2 ana sitoplazmada içine PTS1 translokasyon belirlenmesi. CHO hücreler darbe etiketli 4 ° C de 30 dakika ile 1 mcg / ml PT. Hücreler daha sonra 37 saat süreyle 3 kovaladı hiçbir eklemeler (sarhoş) veya 5 mg BFA / ml (+ BFA sarhoş) içeren ° C toksin içermeyen orta. Digitonin ile plazma membran Permeabilization ayrı organel ve sitozolik fracti bölüm hücre ekstreleri için kullanılanEklentiler. Bir anti-PTS1 antikor ile kaplı bir SPR sensörü, tedavi edilmezse veya BFA tedavi edilen hücrelerin PTS1 sitozolik havuzu algılamak için kullanıldı. PTS1 standartları unintoxicated hücrelerden sitozolik fraksiyonu sensör slayt üzerinde bir negatif kontrol olarak perfüze iken, pozitif kontrol olarak sensörün üzerine perfüze edildi. Her çalışma sonunda, ciltli örneği sensör slayt elimden alındı. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> Şekil 3 ana sitoplazmada içine CTA1 translokasyon belirlenmesi. HeLa hücrelerinde darbe etiketli 4 ° CT 1 mcg / ml ile 37 ° C 2 saat kovaladı hiçbir eklemeler (sarhoş) veya 5 mg BFA / ml (+ BFA sarhoş) içeren ° C toksin içermeyen orta. Digitonin ile plazma membran Permeabilization ayrı organel ve sitozolik kesirler bölüm hücre ekstreleri kullanılmıştır. (A) sitozolik kesirler, bir anti-CTA antikor ile kaplı bir SPR sensör üzerinden perfüze edildi. Bilinenunintoxicated hücrelerden sitoplazmada bir negatif kontrol olarak kullanılan iken KTHY miktarları, pozitif kontrol olarak kullanıldı. (B) BFA yokluğunda sitozolik sarhoş hücrelerin bir kısmı, bir anti-CTB antikor ile kaplı bir SPR sensör üzerinden perfüze edildi. Pozitif kontrol olarak saflaştırılmış bir CTB pentamer slayt üzerinde perfüze edildi. (C) organel fraksiyonu çözünür% 1 Triton X-100, bir anti-CTA antikor ile kaplı SPR sensörün üzerine perfüzyon önce. Karşılaştırmalı amaçlar için, aynı hücre özü ve CTA standart sitozolik fraksiyonu (1 ml final hacim) sensör üzerindeki perfüze edildi. Tüm panelleri için, bağlı örnek her çalışma sonunda sensörü elimden alındı. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> Şekil 4 sitoplazmada içine CTA1 girdi Kinetiği. HeLa hücrelerinde darbe etiketli ° C 1 mcg / ml CT kovaladı, 15, 30, 45 veya 60 dakika 37 ° C toksin Mediu (4)m. Toksin transloke havuzu algılamak için, digitonin-permeabilize hücrelerin sitozolik kesirler, bir anti-CTA antikor ile kaplı bir SPR sensörün üzerine perfüze edildi. KTHY standartları yanı sıra sensör üzerindeki perfüze edildi. Her çalışma sonunda, ciltli örneği sensör slayt elimden alındı. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> Şekil 5 DMSO tarafından CTA1 translokasyon inhibisyonu. HeLa hücrelerinde darbe etiketli 4 ° CT 1 mcg / ml ile 37 ° C 2 saat kovaladı hiçbir eklemeler (sarhoş) veya% 10 DMSO (+ DMSO sarhoş) içeren ° C toksin içermeyen orta. Toksin transloke havuzu algılamak için, digitonin-permeabilize hücrelerin sitozolik kesirler, bir anti-CTA antikor ile kaplı bir SPR sensörün üzerine perfüze edildi. KTHY standartları (100, 10, 1 ve 0.1 ng / ml) pozitif kontrol olarak sensörün üzerine perfüze edildi; sadece 1 ve 0.1 ng / ml standartlarına ölçekleme amaçlar için gösterilmiştir. Unintoxicate gelen sitoplazmadad hücreler negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Her çalışma sonunda, ciltli örneği sensör slayt elimden alındı. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> Şekil 6 sitozolik CTA1 hesaplanması Şekil 5 CTA standartları için bir değerler k toksin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. K dayalı standart eğri, belirlemek için kullanılan, Şekil 5, tedavi edilmemiş ve DMSO ile tedavi edilen hücrelerin sitozolik CTA1 konsantrasyonu deney örneklerinin a değerleri . Tedavi edilmezse sitoplazmada açık bir kare olarak sunulmaktadır; Toksin standartları dolu daireler olarak sunulmaktadır ve DMSO tedavi sitoplazmada açık bir daire olarak sunulmaktadır. Ortalamaları ± aralıkları iki bağımsız deneyler göstermiştir.

Çıkar çatışması ilan etti.

Mevcut metodoloji ile Karşılaştırma Bizim SPR tabanlı translokasyon tahlil ev sahibi sitoplazmada içine toksin teslim algılamak için hızlı, duyarlı ve kantitatif bir yöntem temsil eder. Teknik Radyoaktif veya toksin diğer modifikasyonlar gerektirebilir ve bu zinciri antikor mevcut olan bir anti-toksin herhangi bir toksin uygulanabilir. Sitoplazmada içine toksin geçişini izlemek için varolan yöntemleri de ayrı sitoplazmada ve membran fraksiyonları 11, 23, 27, 28 b...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Gangliozid GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Liste </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimide) </td><td> Delmek </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-Etil-3-(3-Gaz sistemlerinde) carbodiimide) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Etanolamin </td><td> Sigma </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA antikor </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80.747 </td></tr><tr><td> Anti-CTB antikor </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 antikor </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57.639 </td></tr><tr><td> Refraktometre </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR algılayıcı slaytlar </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Şırınga pompası </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

AB toksinler A alt biriminin bir enzimatik ve hücre bağlayıcı B alt ünite 1 oluşur. Bu toksinler ekstraselüler ortam içine salgılanan, ancak ökaryotik sitoplazmada içinde hedefleri doğrultusunda hareket. Bazı AB toksinler hücre yüzeyinde sitoplazmada 2-4 girmeden önce endoplazmik retikulum (ER) vezikül taşıyıcılar tarafından seyahat ER, toksin ve hamle geri kalanı protein iletken bir kanal aracılığıyla katalitik Bir zincir ayrışmaktadır onun sitozolik hedef 5 ulaşmak için . ER toksin ticareti son derece verimsiz bir süreç olmasından dolayı, transloke, sitozolik zinciri tespit etmek zordur: en içselleştirilmiş toksin golgi ve ER 6 ulaşır yüzey bağlı toksin yüzden sadece küçük bir bölümünü, bozulması için lizozomlar yönlendirilir -12. ER kültürlü hücrelerde sitoplazmada toksin translokasyon izlemek için highl Subselüler fraksiyonasyon protokolü kombineyüzey plazmon rezonans (SPR) 13-15 y hassas algılama yöntemi. Toksin-tedavili hücrelerde plazma zarı seçici, daha sonra bir anti-toksin A zinciri antikor ile kaplı bir SPR sensör üzerinden perfüze bir sitozolik fraksiyonu toplanması için izin verirler digitonin ile permeabilize. Antikor kaplı sensör sitozolik toksin pg / mL miktarlarda yakalamak ve tespit edebilir. Bu protokol ile, sitoplazmada toksin giriş kinetiği takip etmek ve translokasyon olayı üzerine inhibitör etkileri karakterize etmek mümkündür. Sitozolik toksin konsantrasyonu sensör üzerindeki perfüze edilmiştir zinciri standartları bilinen miktarlarda üretilen standart bir eğri de hesaplanabilir. Bizim yöntem, hedef toksin Radyoaktif veya diğer modifikasyonlar gerektirmeyen bir, hızlı, duyarlı, ve kantitatif algılama sistemi temsil eder.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Bu raporda, yüzey plazmon rezonans ev sahibi sitoplazmada içine toksin girişini tespit etmek için nasıl kullanıldığını açıklar. Bu son derece duyarlı bir yöntem sitozolik toksin miktarı nicel veri sağlayabilir ve toksinlerin bir dizi yapılabilir.

Yüzey Plasmon Rezonans Host Cytosol Toksin Translokasyon Tespiti

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K Görüntüleme.  University of Central Florida. Bu raporda, yüzey plazmon rezonans ev sahibi sitoplazmada içine toksin girişini tespit etmek için nasıl kullanıldığını açıklar. Bu son derece duyarlı bir yöntem sitozolik toksin miktarı nicel veri sağlayabilir ve toksinlerin bir dizi yapılabilir.

Video: Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Yanal-flow teknolojisi kullanılarak Hematolojik Malignite Hastalarda invaziv pulmoner aspergillozis Algılama

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Pamuk Yeşilkurt bir densovirüs Host Fitness Host doku Dağılımı, İletim-modunu ve Etkisi incelenmesi için Protokoller

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.