We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. Tepe Emisyon ve Çapraz-talk Tayini (Ayrıca Bakınız Şekil 2) <ol><li> Emisyon tepe ve verici arasındaki çapraz konuşma (kumarin türevi V450) ve akseptör (fluorescein), boyalar miktarını belirlemek 405 nm eksitasyon bireysel fluorophores hem ile etiketlenmiş hücrelerin spektral tarama işlemi gerçekleştirmek için. </li><li> Verici ve alıcı kanalları (buradan 455-465 nm ve 525-535 nm) için kullanılacak olan her bir boyadaki zirve içinde 10 nm bant genişliği belirler. Dalga boyu üzerinde normalleştirilmiş yoğunluğu arsa ve alıcı kanalı ve tersi (Şekil 2) donör boya çapraz konuşma ortalama yüzdesini hesaplamak. </li></ol> Y&#39;nin 2. Hazırlık Hücre Kültürü Enfeksiyon için enterocolitica Suşları <ol><li> Aşağıdaki suşları kullanın: WA-314 PMK-ova ve (WA-314 17 PMK-bla ve PMK-ova 17, sırasıyla plazmidler ile transforme) WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-) 17 314ΔYopE plazmid ile transforme PMK&#39;yi-bla </li><li> Enfeksiyon çizgi Y. önce en az iki gün enterocolitica suşları WA-314 PMK-ova, WA-314 PMK-bla ve WA-314ΔE WA-314 PMK-bla ve WA-314 PMK-ova için (kanamisin gerekli antibiyotikleri içeren LB-agar plakaları üzerinde hisse senedi kriyo gelen PMK-bla ; kanamisin ve WA-314ΔE PMK-bla için tetrasiklin) ve 27 ° C&#39;de O / N büyür. Daha sonra bir haftaya kadar 4 ° C plakaları tutun. </li><li> Enfeksiyondan bir gün önce, ilgili suşlarının bir koloni ile istenen antibiyotik içeren LB-ortamı içinde 3 ml inoküle ve 180 rpm&#39;de bir çalkalama 27 ° C &#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Enfeksiyonun günde antibiyotikler olmadan, taze LB-ortamı içinde 40 ml O / N kültürünün 2 ml&#39;sini aşılamak ve tip III sekresyon sisteminde ekspresyonunu indüklemek için 180 rpm&#39;de bir çalkalayıcıda olmak üzere 37 ° C &#39;de 90 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Uygun bir tüp içine kültürleri aktarın ve C buz üzerinde veya 4 ° kültürleri tutmakbundan sonra. 5000 xg ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca kültürler santrifüj. </li><li> Buz 2-3 ml soğuk PBS bakteriyel pelletini. Bir spektrofotometre kullanılarak, 8 x 10 8 cfu / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar bakteri süspansiyonu ile seyreltilir. Ayrı ayrı ilgili optik yoğunluk belirlenir. HeLa hücrelerini enfekte kadar buz üzerinde bu süspansiyon tutun. </li></ol> 3. Kaplama HeLa Hücreleri <ol><li> 96 gözlü bir levhanın gözleri içinde% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu (FCS) ihtiva eden ve 37 ° C&#39;de bir% 5 CO2 inkübatörü içinde yetiştirmek 200 ul DMEM içinde bir gün enfeksiyon tohum önce 1.5 x 10 4 hücre HeLa hücreleri. Her bir suş (üç farklı inkübasyon kez) üç kuyu Seed. </li></ol> 4. HeLa Hücreleri Enfeksiyon ve CCF4 ile yükleme <ol><li> Orta bakteriyel süspansiyon 3.5 ul ekleyerek HeLa hücreleri enfekte ve nazikçe orta kez pipetleme karıştırın. Bakteriler üzerinde çökelmesi için izin verHücre başına yaklaşık olarak 100 bakteri MOI (enfeksiyon kısmı) hücrelere. Bir zaman süreci için -90 dakikada, -60 dakika ve -30 dakikada enfeksiyonları başlatmak ve ortak bir uç noktası elde etmek için 0 dakika kadar bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyon tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde HeLa hücreleri çıkarmadan orta aspire ve CCF4 ihracat azaltmak için efektör ve 2.5 mM probenesid ekspresyonunu durdurmak için 20 ug / ml kloramfenikol içeren PBS 50 ul ekle. </li><li> Bu noktada, bir mikroskop kademesine 96 oyuklu plaka transfer ve de her biri daha sonraki analizler için uygun noktalar tanımlar. 10 dakika içinde bu adımı tamamlayın (edinim ayrıntıları için bakınız bölüm 5.1). </li><li> Ortalama de, 20 içeren CCF4 / AM yükleme çözeltisi (0.24 ul çözelti A, 1.2 ul çözelti B, 70 ul, 18.56 ul çözelti C (çözelti A, B, ve C CCF4 / AM yükleme kiti içinde temin) ve 50 ul PBS (ekleme Çok p kullanılarak ug / ml kloramfenikol ve 2.5 mM probenesid)ipette oda sıcaklığında 5 dakika inkübe vb. Şimdi çalışma kesintisiz itibaren. </li><li> Yükleme solüsyonu aspire ve çok pipet kullanılarak 20 ug / ml kloramfenikol ve 2.5 mM probenesit içeren 100 ul PBS ilave edin. Sonra hızla mikroskop aşamaya 96 plaka aktarmak ve yükleme çözümünün aspirasyonu 10 dakika içinde alımı başlatabilirsiniz. </li></ol> 5. Lazer Tarama Mikroskopi ve Veri Analizi <ol><li> Görüntü edinimi <ol><li> Fototoksisite, Photobleaching ve çapraz uyarma toplam foton sayısını en üst düzeye çıkarmak ve en aza indirmek için bir şekilde görüntüleme koşullarını ayarlayın. <ol><li> Modern bir konfokal lazer tarama mikroskobu, aynı anda aktif donör ve alıcı kanalları, 8 bit derinliği ile yüksek hassasiyet GaAsP-dedektörleri seçin 2.5 Airy birimlerinin (yani, geniş optik kesit) detektör iğne deliği açmak, 20X yüksek sayısal açıklık daldırma objektif kullanın ~ 750 nm piksel boyutu, 3 kat çerçeve ortalama ve Excit405 nm diyot lazer% 10 e. </li><li> Doğru miktar aynı değere her iki kanal dedektör kazancını ayarlamak sağlamak ve herhangi doymuş piksel önlemek için. Not: Burada kazançları% 150 kuruldu. </li></ol></li><li> 1 ml şırınga ile, örneğin kuyu dibine batırma orta yayarak sürekli daldırma emin olun ve herhangi bir hava kabarcığı yakalama kaçının. </li><li> Iletilen ışık etkinleştirin ve her kuyuda bir görüş temsilcisi alanını bulmak. Bir doğru kalibre otomatik sahne kullanın ve yazılımı konumunu işaretleyin. </li><li> Boyama için plakasının sökülmesinden sonra, (bölüm 4.3) plaka takın ve fokal sürüklenme önlemek için üst kısmında bir ağırlık ilave. Lazer tarama modu ile kaydedilen pozisyonları gözden geçirin ve düzgün odaklama ve yanal konumunu ayarlamak. </li><li> 2 saat kadar, 2 dakika süre zaman atlamalı ayarlayın ve alımı başlatabilirsiniz. </li></ol></li><li> Resim miktar (örneğin Bitplane Y verilecek) bu tür IMARIS gibidir <ol><li> Piksel matrislerin aritmetik hesaplamaları izin veren yazılım içine veri kümesi aktarın. Sürükleyip bağışçı ve yazılım simgesine alıcı kanalı hem de içeren kaynak dosya bırakarak bunu yapın. </li><li> Aynı ofset kullanarak her iki kanallarda arka plan çıkarın. Bunu yapmak için, Menü&#39;yü tıklatın ve sonra Görüntü tıklayın&gt; İşleme&gt; Baseline Çıkarma. Her kanalı seçin ve bazal değeri girin. </li><li> Yeni bir kanal oluşturarak, önceden belirlenmiş düzeltme faktörü f (1.1 bakınız) ile alıcı kanalı (CH2) içine donör kanalı (Ch1) ve boşaltma-through düzeltin: Ch2 &#39;= CH2 - Ch1 * f Not: verici kanalı içine alıcı bir boşaltma yoluyla gürültü seviyesi üzerinde tespit edilememiştir. <ol><li> Menü&gt; Görüntü İşleme&gt; Kanal Arithmetics tıklayın ve butonu abs (CH2- (ch1 * 0.33)). Daha sonra Menü&gt; Düzenle&gt; Kanallar Sil&#39;i tıklatarak Kanal 2 silin. Emin olunkanamaya-yoluyla düzeltilmiş alıcı kanalı olarak kalır yeni Kanal 2. İsteğe bağlı: Menü&gt; Düzenle&gt; Görüntü Özellikleri giderek orijinal rengine gri kanal rengini değiştirin. Channel 4&gt; Haritalı Renk&gt; Temel Rengi seçip yeşil, örneğin değiştirin. </li></ol></li><li> Göreceli FRET katsayısını belirlemek için aşağıdaki işlemi ile yeni bir kanal oluşturun: = CH3 Ch2 &#39;/ (Ch1 + CH2&#39;), <ol><li> Menü&gt; Görüntü İşleme&gt; Kanal Aritmetik gidin ve ./ (CH1 + CH2) CH2 girin </li></ol></li><li> 8 bit görüntüde FRET kanalının uygun görünüm için, dördüncü kanal oluşturmak: Ch4 = 255 * Ch3 <ol><li> Menü&gt; Görüntü İşleme&gt; Kanal Aritmetik gidin ve 255 * CH3 girin. Menü&gt; Düzenle&gt; Görüntü Özellikleri giderek kanal rengini değiştirin. Channel 4&gt; Haritalı Renk&gt; Renk Tablosu Dosya&gt; Jet seçin. </li></ol></li><li> Kanallar CH3 ve Ch4 tha bir 3x3 medyan filtre uygulamakt görüntüler gürültüyü azaltır. Bunu yapmak için, Menü&gt; Görüntü İşleme&gt; Düzleştirici&gt; Medyan Filtre tıklayın. Her iki kanal seçin ve bir filtre boyutu &quot;3x3x1&quot; uygulanacaktır. </li><li> Hücresel sinyal ölçümü için doğru ofset ayarlayarak Ch4 hücrelerin tespit etmek ve çok küçük yapılar dahil büyüklük olarak yapı filtre. <ol><li> Seçin Görünüm Aşan ve simgesi &quot;Yeni Yüzey Ekle&quot; düğmesine tıklayın. Yüzey penceresinde algılama algoritma parametreleri tanımlayın. Daha hızlı işlem için, iki onay kutularını &quot;Segment İlgi sadece Bölge&quot; ve &quot;nihayet Süreç tüm Image&quot; etkinleştirin. Boyutlarını düzenleyerek ilgi bölgeyi tanımlamak. </li><li> Kaynak kanalı olarak Kanal 4 seçip eşik&gt; Arka Plan Çıkarma (Yerel Kontrast) tarafından eşiğini ayarlamak ve 10 um çapı ayarlayın. Maksimum intensi elle 0&#39;a asgari yoğunluk eşiğini ve maksimum eşik ayarlamakty. Alana göre yapılarını Filtre ve örneğin, 187 μm² minimum değeri ayarlayın. Yüzey algılama bitirin. </li></ol></li><li> Donör floresan yoğunluğu (Ch1) ve bağıl FRET katsayısı (Ch3) ve hücresel varlık kendi standart sapmaları için ortalama değerler ayıklayın. Bunu yapmak için, Yüzey özelliklerine gidin. Yüzeyler Stil / Kalite&gt; Yüzey seçerek yapıların görünümünü değiştirin. Filtreler sekmesini tıklayarak bütün yapıları seçiniz. Seçimi&gt; birleştirmek Süreç giderek tespit yapıları birleştirin. Istatistik sekmesini tıklayarak MS Excel yüzey istatistiklerini İhracat&gt; İhracat Tüm istatistikleri Dosyaya. </li><li> Zaman içinde bu değerler çizilir. Transloke efektör miktarını temsil ettiği uygun bir parametre olarak her bir durum için donör kanalı floresan artış maksimum eğim 10 dakika aralığını belirlemek. M = Δ donör floresan yoğunluğu / Δ süresi (min) olarak eğimi hesaplayın. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol>
	<li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Type+III+Secretion+Systems:+Specialized+Nanomachines+for+Protein+Delivery+into+Target+Cells.">Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells.</a> Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).</li><li>Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+functions+of+pathogenic+Yersinia+species.">Effector functions of pathogenic Yersinia species.</a> Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).</li><li>Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia's+stratagem:+targeting+innate+and+adaptive+immune+defense.">Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense.</a> Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).</li><li>Viboud, G. I., Bliska, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+outer+proteins:+role+in+modulation+of+host+cell+signaling+responses+and+pathogenesis.">Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis.</a> Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).</li><li>Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Yersinia+type+III+secretion+system:+traffic+control.">Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control.</a> Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).</li><li>Pettersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+virulence+factor+expression+by+pathogen+target+cell+contact.">Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact.</a> Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).</li><li>Schweer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+necrotizing+factor+of+Yersinia+pseudotuberculosis+(CNFY)+enhances+inflammation+and+Yop+delivery+during+infection+by+activation+of+Rho+GTPases.">The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases.</a> PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).</li><li>Wolters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+necrotizing+factor-Y+boosts+Yersinia+effector+translocation+by+activating+Rac+protein.">Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein.</a> J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).</li><li>Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+controls+type+III+effector+delivery+into+host+cells+by+modulating+Rho+activity.">Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity.</a> PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).</li><li>Aili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Yersinia+Yop-effector+delivery+by+translocated+YopE.">Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE.</a> Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).</li><li>Gaus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+YopE+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway+fine-tunes+Yop+delivery+into+host+cells+and+facilitates+systemic+spread+of+Yersinia+enterocolitica+in+host+lymphoid+tissue.">Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue.</a> Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).</li><li>Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YopB+of+Yersinia+enterocolitica+is+essential+for+YopE+translocation.">YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation.</a> Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).</li><li>Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+pathogenic+type+3+secretion+system+in+action.">Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).</li><li>Sory, M. P., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+hybrid+YopE-adenylate+cyclase+from+Yersinia+enterocolitica+into+HeLa+cells.">Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells.</a> Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).</li><li>Schlumberger, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+type+III+secretion:+Salmonella+SipA+injection+into+host+cells.">Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).</li><li>Charpentier, X., Oswald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secretion+and+translocation+domain+of+the+enteropathogenic+and+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+effector+Cif,+using+TEM-1+beta-lactamase+as+a+new+fluorescence-based+reporter.">Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter.</a> J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).</li><li>Koberle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+enterocolitica+targets+cells+of+the+innate+and+adaptive+immune+system+by+injection+of+Yops+in+a+mouse+infection+model.">Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model.</a> PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).</li><li>Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cells+targeted+by+Salmonella+type+III+secretion+in+vivo.">Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo.</a> PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).</li><li>Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plague+bacteria+target+immune+cells+during+infection.">Plague bacteria target immune cells during infection.</a> Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+type+III+secretion+system+activity+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+effector+translocation+by+the+type+III+secretion+system+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).</li><li>Heesemann, J., Laufs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+mobilizable+Yersinia+enterocolitica+virulence+plasmid.">Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid.</a> J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).</li><li>Zumbihl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxin+YopT+of+Yersinia+enterocolitica+induces+modification+and+cellular+redistribution+of+the+small+GTP-binding+protein+RhoA.">The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA.</a> J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Biz burada başarılı Y. tarafından efektör translokasyon kantitatif analizi için bir TEM-1 beta-laktamaz muhabiri bazlı analiz uygulamalı enterocolitica. Bu, hassas bir özel ve oldukça basit bir tekniğin bir çok farklı varyasyonlar literatürde tarif edilmiştir. Bu çalışmada, lazer tarama mikroskobu floresan sinyalleri en hassas ve kesin tespiti için yürütülmüştür. Özellikle, verici ve alıcı boyalar ve bağımsız olarak ayarlanabilen tespit bant genişlikleri arasında çapra...

Tip III salgılama sistemleri, doğrudan ökaryotik hedef hücrelere bakterisel olarak kodlanmış proteinlerin efektör sağlamak için gram negatif bakterilerin farklı cins tarafından kullanılan özel bir protein ihracatı makinelerdir. Salgılanması mekanizmasının kendisi yüksek ölçüde korunmuş olsa da, efektör proteinler uzman setleri hücresel sinyal yolları değiştirmek ve belirli bir bakteriyel hastalık stratejileri 1 kolaylaştırmak için farklı bakteri türleri arasında gelişmiştir. Yersinia durumunda, yedi efektör proteinler olarak adlandırılan Yops (Yersinia dış proteinler) &#39;ye kadar, konakçı hücre temas üzerine transloke ve örneğin, fagositoz ve sitokin üretimi, immün hücresi tepkilerini bozmak için birlikte hareket edilir, bakterilerin hücre dışı sürdüreceği 2-4. Translokasyon süreci sıkı farklı aşamalarında 5 kontrol edilir. Bu T3SS birincil aktivasyon hedef ce onun temas ile tetiklenen olduğunun tespit edilmesill 6. Ancak, bu inisiyasyon kesin mekanizması henüz aydınlatılamamıştır olmaktır. Yersinia ise translokasyon sözde ince ayar bir ikinci düzey Up-by veya aşağı-düzenleyen hücresel Rho GTP-bağlayıcı proteinlerin Rac1 veya RhoA aktivitesini elde edilir. Invazın veya sitotoksik nekrotizan faktör Y (CNF-Y) örneğin Rac1 Aktivasyon GAP transloke YopE işlevini (GTPaz protein aktive) ise Rac1 aktivitesini aşağı düzenler ve buna göre bir negatif geribildirim türü translokasyonu azaltır, artan translokasyon 7-9 yol açar mekanizması 10,11. Geçerli ve hassas yöntemler translokasyon Yersinia konak hücre etkileşim sırasında nasıl düzenlendiği araştırmak için önkoşuldur. Birçok farklı sistemleri özel avantajları ve sakıncaları ile birlikte, her biri bu amaç için kullanılmaktadır. Bazı yaklaşımlar western blot analizi ile, ardından farklı bir deterjan enfekte hücrelerin parçalanması değil, bakteri dayanmaktadır. ThBu yöntemlerin e ortak dezavantajı küçük ama kaçınılmaz bakteriyel lizis potansiyel bakteri ilişkili efektör proteinleri ile hücre lizat kirletir olmasıdır. Ancak, hücre dışı proteinler ve efektör ökaryotik hücrelerde seçici parçalanması digitonin sonraki kullanımının indirgemek için proteinaz K ile hücrelerinin tedavi, bu sorunu 12 en aza indirmek için önerilmiştir. Önemli olarak, bu deneyler, en önemlisi, çoğunlukla, ticari olarak mevcut değildir, yüksek kaliteli, anti-efektör antikorları bağlıdır. Girişimleri floresan proteinleri küresel üçüncül yapısı ve sekresyon 13 önce onları açılmak için salgılama aygıtının yetersizlik muhtemelen başarılı nedeniyle değildi translokasyon izlemek için GFP gibi efektör proteinlerin çeviri füzyonlarının ve floresan proteinleri kullanmak için. 14 ya da Flash cyclolysin Bordetella pertussis toksin Ancak, CYA gibi birçok farklı raportör etiketleri (kalmodulin-bağımlı adenilat siklaz) etki alanıetiketi başarıyla translokasyon analiz etmek için kullanılmıştır. Flash etiket, çok kısa bir Tetracysteine ​​(4Cys) motifi etiketi, sekresyon işlemi bozmadan biarsenical boya Flash ile etiketlenmesi için izin verirken, eski deneyinde CYA enzimatik aktivitesi, hücre içi füzyon proteininin sinyal yükseltmek için kullanılır 15. Burada uygulanan yaklaşım, Charpentier vd., Ilk kez bildirilmiştir transloke efektör TEM-1 beta-laktamaz füzyonları 16 (Şekil 1 A) Förster rezonans enerji transferi (FRET) boya CCF4 hücre içi dönüşüm dayanır. CCF4 / AM kumarin türevi (donör) ve flöresan kısmı (akseptör) bir cephalosporin çekirdek ile birbirine takılmış olduğu, bir hücre nüfuz edici bileşiktir. Ökaryot hücreye pasif girmesinden sonra, CCF4 / AM bileşik esterlenmiş floresan olmayan ücret ve floresan CCF4 hücresel esterazlarla işlenir ve bu sayede tuzakhücre içinde. 530 nm&#39;de bir yeşil floresan sinyali yayan floresein kısım için FRET 405 nm sonuçlara kumarin parçasının Uyarım. Beta-laktamaz FRET tarafından sefalosporin çekirdek ayrılmasından sonra bozulur ve kumarin kısmının uyarma nm AR460 mavi floresan emisyonuna yol açar. Bu yöntemin farklı uygulamalar çok yönlülüğünü vurgulama literatürde tarif edilmiştir. Yöntem, in vitro olarak translokasyonu analizi sağlar ve aynı zamanda in vivo, örneğin, bu teknik, in vivo 17-19 translokasyon için hedeflenen lökosit popülasyonları tanımlamak için, bir fare enfeksiyon modelinde kullanılmıştır. Sinyallerin okunması plaka okuyucusu, FACS analizi ya da floresan mikroskopi kullanılarak yapılabilir. Unutmayın ki, yöntem aynı zamanda enfeksiyon süreci 20,21 sırasında canlı hücre mikroskopi gerçek zamanlı translokasyonu izlemek için imkanı sağlar. Burada lazer tarama mikroskobu readou floresan uygulanmıştırfloresan sinyalleri t en yüksek hassasiyet ve doğruluk sağlar olarak. Özellikle, yetenek yüksek duyarlı dedektörler ile birlikte nanometre hassasiyetle emisyon penceresini floresens optimize edilmiş ve çapraz konuşma minimize kolaylaştırır ayarlamak için. Buna ek olarak, bu mikroskopi kurulum translokasyonun gerçek zamanlı izleme için uyarlanabilir ve potansiyel olarak hücresel düzeyde-konak etkileşim aynı anda analiz için izin verir. Bir Y. Bu çalışmada translokasyon oranları enterocolitica vahşi tip suş ve hypertranslocator fenotip 10,11 sergileyen YopE silme mutant örnek bir analiz edildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1068">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">LB-Agar</td>
			<td style="width:209px;">Roth</td>
			<td>X969.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (black, clear bottom)</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>31966-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K1095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4895</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560469</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol W immersion oil&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 7.6 software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab compiler runtime</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

Patojenik Yersinia spp dahil olmak üzere birçok gram-negatif bakteriler. Ökaryotik hedef hücrelere efektör proteinleri yerini değiştirmek için tip III salgı sistemlerini kullanır. Konak hücre içinde efektör proteinler bakteriler yararına hücresel fonksiyonları manipüle. Daha iyi translokasyon ölçmek için konak hücre etkileşimi, hassas ve doğru deneyleri sırasında tip III sekresyon kontrolünü anlamak için gereklidir. Burada Yersinia enterocolitica efektör proteini fragmanı füzyon göre bir deneyde (Yersinia dış proteini; YopE) uygulanmasını tarif eder. Translokasyon kantitatif analiz için TEM-1, beta-laktamaz olan deney bir hücre bölünmesinden dayanır geçirgen FRET boyası transloke beta-laktamaz füzyonu (CCF4 / AM). Floresein bozulur ve kumarin yarımının uyarım mavi flüoresans emisyonlarına neden olan beta-laktamaz göre CCF4 sefalosporin çekirdeğin ayrılmasından sonra, kumarin gelen FRET.Bu yöntemin farklı uygulamalar çok yönlülüğünü vurgulama literatürde tarif edilmiştir. Yöntem, bir fare modelinde in vitro translokasyon analizi için ve aynı zamanda in vivo, örn sağlar. Floresan sinyalleri tespit levhası okuyucu, FACS analizi ya da floresan mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Farklı Yersinia mutantlar tarafından HeLa hücrelerine efektör füzyonlarının nitro translokasyon, burada açıklanan kurulum lazer tarama mikroskobu ile izlenir. Gerçek zamanlı olarak beta-laktamaz efektör füzyon ile FRET raportör hücre içi dönüşümünü kayıt sağlam bir nicel sonuçlar sağlar. Biz burada bir Y. tarafından artan translokasyon gösteren, örnek verileri göstermek vahşi tip suş ile karşılaştırıldığında enterocolitica YopE mutant.

Kantitatif hedef hücrelere efektör translokasyon analiz etmek için tarif edilen yönteme kapasitesini göstermek için, farklı bir translokasyon kinetiği iki Yersinia suşlar üzerine çalışıldı: Y. ve onun türevi WA-314ΔYopE (pYVO8ΔYopE 23 barındıran WA-314) (virülans plazmid pYVO8 22 barındıran serogrup O8) enterocolitica vahşi tip suş WA-314. Daha önce iş olduğunu gösterdi Y. Fonksiyonel YopE sergilediğini anlamlı olarak yüksek Yop tr...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions at JoVE.com

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K Görüntüleme.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Video: Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

Yüzey Plasmon Rezonans Host Cytosol Toksin Translokasyon Tespiti

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

Eyeball Dokusunda Efektif Hafıza T Hücrelerini Artıran Kronik Otoimmün Kuru Göz Fare Modeli

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.