Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Greg Martin (Cornell University) e il suo gruppo per aver fornito il ceppo DC3000, semi di pomodoro, e consiglio. Si desidera inoltre ringraziare il Dr. Zhonglin Mou per un aiuto con il protocollo DAB e la Divisione Proteomics UF presso il Centro Interdisciplinare per la Ricerca in Biotecnologie per l&#39;assistenza allo sviluppo del metodo. Il protocollo per l&#39;estrazione delle proteine ​​è stato modificato dal Hurkman e Tanaka 16. Il protocollo sulla cysTMT etichettatura, a pochi passi da 4 a 6 è stato adattato in base al prodotto originale Thermo Fisher Scientific manuale Pierce 17. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation (MCB 0.818.051 a S Chen).

1. Piantine in crescita e batteri Preparazione <ol><li> Piantine sono germinati in metromix 500 miscela di sporco (Aziende BWI) in una camera di crescita (160 fotoni micromoli m -2 s -1 con un fotoperiodo di 8 ore di luce solare a 22 ° C e 16 ore di buio a 20 ° C per 1 settimana. Relativa umidità è stato impostato al 70%. piantine sono state annaffiate con acqua di rubinetto come necessario per mantenere il terreno diventi secca. </li><li> Due pianticelle di dimensioni simili vengono trapiantate a 4 &quot;vasi contenenti il ​​diametro metromix 500 terreno e coltivate per ulteriori 3 settimane nelle stesse condizioni 1,1. </li><li> Pseudomonas syringae (Pst) è inizialmente T-striato sul Kings B Medio (KBM) piastre per litro: 20 g PROTEOSE Peptone, 0,1975 g MgSO 4, 1% glicerolo, 1,5 g di K 2 HPO 4, Agar 18 g) e coltivate per due giorni a 28 ° C. Una singola colonia viene raccolto, mescolato in 300μl Kings liquido B Medium (20 g PROTEOSE peptone, 0,1975 g MgSO 4 </sub&gt;, glicerolo 10 mL, 10 mL di 100x K 2 HPO 4 archivio (1,5 g di K 2 HPO 4 in 10 mL di H 2 O), e diffuso su una piastra Kings B medio. Questo viene coltivato durante la notte a 28 ° C. </li><li> L&#39;inoculo viene preparato batteri raschiando i batteri coltivati ​​dalla piastra KBM in 20 mL H 2 O. Un OD 600 di 0,03 (~ 10 6 cfu / ml) viene preparato in 1 L di tampone di inoculazione (10 mM MgCl 2 + 400 microlitri Silwett-70). L&#39;inoculazione del buffer meno batteri è stata preparata per la soluzione di controllo. </li></ol> 2. Inoculazione di pomodoro con Pst e H 2 O 2 istochimica Stain <ol><li> Quattro settimane di età piante sono state inoculate mediante immersione nella soluzione inoculazione sopra per 30 secondi. Sacchetti di plastica sono state messe sopra le piante immediatamente dopo l&#39;inoculazione. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina (DAB) macchia 11 è stato preparato (1 mg / ml DAB in H 2 O, pH 3,8 (HCl)) tre days prima dell&#39;uso per avere solubilità completa. La soluzione è stata scossa per miscelare a temperatura ambiente. </li><li> Ventiquattro ore dopo il trattamento, la foglia completamente espansa è stato rimosso, posto in DAB lato macchiato epidermica, e infiltrato vuoto per 15 min. Le foglie sono poi stati messi al buio a temperatura ambiente per tutta la notte per la colorazione. </li><li> Le foglie sono stati bolliti in 95% etanolo per 10 minuti, e quindi tenuti in etanolo al 75%. </li></ol> 3. Estrazione delle proteine <ol><li> Dopo la raccolta, foglia di pomodoro sono state polverizzato con azoto liquido usando mortaio e pestello. </li><li> Per 0,5 g di tessuto, aggiungere 1,25 ml di Tris pH 8,8 tamponata fenolo e 1,25 mL / 0,5 g di tampone di estrazione (0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 10 mM EDTA, 0,9 M saccarosio), poi proseguire macinazione per qualche minuto in un più cappa. </li><li> Trasferire l&#39;estratto di centrifuga tubo Oakridge (Thermo Fisher Scientific Company Nalgene) ed agitare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare a 5000 xge 15 ° C per 10 min. Trasferire la fase superiore fenolo in una nuova provetta pulita. </li><li> Back-estrae la fase acquosa estratta con un volume uguale tampone fenolo; agitate su un agitatore per 30 min. Centrifugare e trasferire l&#39;estratto in una nuova provetta Falcon. </li><li> Ripetere il passaggio precedente ancora una volta e trasferire l&#39;estratto di nuovo tubo Oakridge. </li><li> Fenolo precipitare le proteine ​​estratte con l&#39;aggiunta di 5 volumi di acetato di ammonio 0,1 M in metanolo 100% (conservato a -20 ° C). Vortex e incubare a -20 ° C per il pernottamento. </li><li> Raccogliere la proteina pellet mediante centrifugazione a 20.000 xg, a 4 ° C per 20 min. </li><li> Lavare i pellet 2 volte con il freddo acetato di ammonio 0,1 M in metanolo e 2 volte con l&#39;80% acetone freddo. Aggiungere 1,5 ml di etanolo freddo al 70% di pellet e sospendere. Trasferire in una provetta da microcentrifuga da 2 mL (USA Scientific) e centrifugare a 14.000 rpm, 4 ° C per 20 min. Eliminare l&#39;etanolo. </li><li> Asciugare brevemente il pellet in un concentratore SpeedVac e si dissolvono in un extr proteineun&#39;azione tampone, ad esempio ReadyPrep Protein Reagent Kit di estrazione 3 (8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris-base, tiourea 2 M) (Bio-Rad). Centrifugare a 14.000 rpm e 20 ° C per 30 minuti per formare un pellet. Raccogliere il surnatante. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine ​​con un CB-X dosaggio di proteine ​​in base al manuale del costruttore (Geno Technology). </li></ol> 4. Preparazione del campione e Labeling Peptide con cysTMTs <ol><li> Preparare il campione di proteine ​​ad una concentrazione di 2-5 mg / pl. Qui usiamo 100 microgrammi di proteine ​​per ogni tag di massa, 20 campioni ul ul-50. Per questo esperimento, tutti i tag 6 sono stati utilizzati. </li><li> Aggiungere volume uguale di tampone alchilazione (100 mM Tris-HCl pH7.5, 200 mM di iodoacetammide) per il campione di proteina per bloccare il gruppo tiolo libero. Buffer deve essere preparato fresco. Alchilazione viene effettuata a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Precipitare la proteina aggiungendo 1 ml di acetone freddo 80% a -20 ° C per una notte. La proteina pellet mediante centrifugazione a 14.000rpm, 4 ° C per 20 min. Lavare 3 volte a pellet con l&#39;80% Acetone vortex ogni volta. Rimuovere il surnatante e permettere all&#39;aria quando asciutto su ghiaccio. </li><li> Risospendere il precipitato in 50 microlitri di tampone di lisi (6 M urea, 50 mM Tris base, 1 mM EDTA). 0,5 pl di 100 mM Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) viene poi aggiunto per ridurre i legami disolfuro mediante incubazione per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Preparare i tag con l&#39;aggiunta di 20 microlitri di acetonitrile ai tubi di reagenti per solubilizzare i tag. Vortex e centrifugare fino in fondo. </li><li> Lavare TCEP usando un dispositivo Microcon centrifuga 3KD filtro (Millipore). Aggiungere 50 microlitri di campione colonna Microcon 3KD, e 50 pl di tampone di lisi alla colonna. Centrifugare per 15 min a 10.000 xg e 4 ° C. Ripetere questo passaggio per un totale di tre volte. Rimuovere colonna e invertire in una provetta pulita. Centrifugare per 5 min a 1000 xga 4 ° C. </li><li> Controllare il pH. Se necessario, regolare il pH a 7,0-8,0 con 1 M HCl. </li><li> Aggiungere 5 pl della cysTMReagente T per ogni campione (Il kit reagenti cysTMT dispone di 20 microlitri per i tag fino a 500 mg di proteine. Questo metodo utilizza il 100 pg di proteina, quindi usiamo un quinto del tag.). Lasciare la reazione per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> I campioni sono stati combinati con tampone per campioni di Laemmli (Bio-Rad) in un rapporto 1:1. </li></ol> 5. Eliminazione delle materie non ha reagito Frazionamento Tag Campione <ol><li> I campioni sono stati bolliti per 5 minuti e separato su un pre-cast gel di poliacrilammide 12% (Bio-Rad). Il gel è stato lavato tre volte in intervalli di 5 minuti con filtrato H 2 O e colorato con Coomassie Blue (Bio-Rad) per 1 ora. Il gel è stato de-macchiato durante la notte con H 2 O. </li><li> Dodici frazioni sono state raccolte da ogni corsia di gel. Le frazioni sono state determinate le concentrazioni di banda di proteina. Le frazioni sono state tagliate in pezzi 1mm e raccolto in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Pezzi di gel sono state de-tinto con 50% acetonitrile e di bicarbonato di ammonio 0,1 M in H 2 </sub&gt; O. Questa operazione deve essere ripetuta fino colore blu viene rimosso da pezzi gel (circa 3-4 volte, 15 minuti ogni volta). </li><li> De-gel macchiati pezzi sono stati essiccati utilizzando il 100% acetonitrile (coprire parti gel) per 15 min, surnatante eliminato, e le parti secche con una SpeedVac. </li><li> Sciogliere tripsina (Promega) a 1:10 (tripsina: proteina) il rapporto del volume stesso (come pool campione marcato) di 25 mM di bicarbonato di ammonio. Ad esempio, 600 pg di proteina campione con un volume di 500 pl bisogno di 60 ug tripsina sciolti in 500 pl di 25 mM di bicarbonato di ammonio. </li><li> Aggiungere la soluzione di tripsina ai pezzi gel e impostare sul ghiaccio per reidratare. Se i pezzi non sono coperti aggiungere 50 mM di tampone di bicarbonato di ammonio. Dopo la reidratazione, incubare a 37 ° C per 12-16 ore. </li><li> Rimuovere il liquido estratto dai campioni di proteine ​​incubate. </li><li> Bloccare la reazione e rimuovere qualsiasi residuo digest proteina coprendo pezzi gel con 5% acido formico, 50% acetonitrile .. Agitare pezzi gel per 20 min a temperatura TEmperature. Trasferire il surnatante ai tubi di proteine ​​estratte dal campione 5.7. Ripetere la procedura di estrazione due volte. Asciugare i peptidi estratti utilizzando il SpeedVac. </li></ol> 6. Arricchimento del campione di cysTMT etichetta-peptidi <ol><li> Aggiungere un gradiente di anti-TMT resina per provette da 0,5 ml per un impasto al 50%. (Gradiente è stata determinata dalla concentrazione di banda in gel frazionamento. Se una raccolta frazione costituita da una fascia scura, più resina è necessaria. Frazioni con deboli bande richiedono meno resina come c&#39;è meno proteina.) </li><li> La resina viene poi lavata tre volte con un volume di colonna 1x soluzione salina tamponata Tris (TBS) (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,2) (Pierce Thermo Scientific Research Products Protein). </li><li> Aggiungere 200 ul 1xTBS a ciascun campione. I campioni vengono quindi aggiunti anti-TMT resina (Thermo Scientific Products Pierce ricerca sulle proteine) e agitato a temperatura ambiente per 2 ore seguita da oscillare notte a 4 ° C. </li><li> Aggiungere il campione alla colonna (TheRMO scientifici Pierce prodotti proteici di ricerca). </li><li> Lavare ogni colonna tre volte con TBS 1x 200 pl. Segue poi con lavaggio tre volte con 0,05% CHAPS (disciolto in 1x TBS). </li><li> La colonna viene poi lavata tre volte con 4 M urea in 1x TBS. Duecento microlitri di H 2 O viene poi utilizzato per lavare la colonna tre volte. </li><li> Ogni campione viene eluito tre volte con 200 microlitri tampone di eluizione 50% (50% acetonitrile, 0,4% TFA). </li><li> I campioni vengono poi essiccati in un concentratore a vuoto. </li></ol> 7. Analisi di Spettrometria di Massa <ol><li> Risospendere i campioni in 12 pl del 3% acetonitrile con 0,1% di acido formico e iniettare 5 microlitri direttamente su un Eksigent nanoLC-1D colonna cromatografia liquida ad alta pressione (AB SCIEX, USA). </li><li> Peptidi sarà separata su una colonna C18 II Proteopep ID 75 um x 20 cm (Nuovo obiettivo, USA) utilizzando un gradiente 4-60% (A: acetonitrile 3%, 0,1% di acido formico; B: 97% acetonitrile, 0,1% formico acido)a 3 pl / min per 60 minuti. </li><li> A Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL spettrometro di massa è stata utilizzata per rilevare peptidi utilizzando un top 2 x 3 esperimento costituito da stage MS singolo seguito da acquisizione di 3 MS / MS con una maggiore energia C-trap dissociazione (HCD) la frammentazione seguita da 3 MS / MS con la dissociazione indotta da collisione (CID) per l&#39;identificazione delle proteine. I parametri in questa modalità sono: larghezza Isolamento: 3,0 m / z; energia di collisione: 50% (10% con due passaggi). Peptidi Solo doppiamente e triplamente-caricate sono stati selezionati per la frammentazione. Parametri dinamici di esclusione sono stati fissati per: Ripetere count = 1; durata della ripetizione = 60; list size esclusione = 500; Esclusione durata = 28. Valori target sono i seguenti: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. Tempi di trasferimento di ioni sono stati fissati a 500 e 300 per FTMS per MS / MS (HCD). Due microscans sono stati richiesti per spettri HCD. </li></ol> 8. Ricerca nel database e quantificazione <ol><li> I dati acquisiti CID e HCD eranonalyzed con Thermo Scientific software Discoverer Proteome 1.2 (Thermo Scientific Pierce Prodotti ricerca sulle proteine) attraverso un flusso di lavoro ramificata che ha attuato uno Reporter Ion quantizer (20 ppm tolleranza di massa di ioni frammento) per quantificare il rapporto. Un segmento separato elaborato il MS 2 spettri attraverso la Spectrum Selector, Normalizer Spectrum, ei nodi Grouper Spectrum. </li><li> I dati sono stati poi confrontati con il motore di ricerca SEQUEST. Una tolleranza 20 ppm di massa è stato utilizzato. Modifiche statici sono stati fissati per il reagente cysTMT (304,18 Da) e modifiche dinamiche inclusi fosforilazione e l&#39;ossidazione della metionina (Da 15,99). Un database personalizzato per Solanum lycopersicum è stata composta utilizzando RNA dati (con circa 350.000 voci dalla Harvard University) 13 è stato utilizzato in entrambi i casi. </li></ol> 9. Risultati rappresentativi Una immagine rappresentativa di una foglia di impianto di controllo di pomodoro e una foglia di Pseudomonas è inoculatomostrato nella Figura 1. Una differenza tra controllo trattati e le foglie di Pseudomonas trattati si osserva. Dopo che le foglie vengono rimossi e colorati con DAB, la de-colorazione processo permette la colorazione istochimica a mostrare segni di ROS nel tessuto fogliare (Figura 2). Figura 2A è rappresentativo di una foglia di controllo senza colorazione. Figura 2B è rappresentativo di una foglia trattata con colorazione positiva per Pseudomonas e H 2 O 2 produzione. Un esempio di uscita Proteome Discover dati di una proteina differenzialmente regolati redox viene mostrato nella Figura 3. Questa proteina è un noto ferredossina-1 redox regolata proteina 14 e ha dimostrato di giocare un ruolo nella difesa contro pomodoro Pseudomonas syringae pv 15. Intensità di picco tra il controllo e campioni inoculati viene utilizzato per ottenere la quantificazione relativa, che mostrava cambiamenti significativi nella ferredoxin-1 regolazione redox (p &lt;0,05). Picchi ad alta intensità suggeriscono che questa proteina è ossidato in risposta al trattamento patogeno. Figura 4 è un esempio di uscita Proteome Discover dati di una proteina che ha simile regolazione redox di una proteina tra un campione e controllo inoculato. Picchi di intensità simile suggeriscono la presenza di legami disolfuro non regolata da un cambiamento di trattamento. Il metodo rivoluzionerà il modo di rilevare gli scienziati redox cisteine ​​reattivi e disolfuri 10. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Figura 1. Un&#39;immagine rappresentativa di pomodoro lascia inoculato con soluzione di controllo (A) e Pseudomonas (B). &lt;class span = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Figura 2. Un&#39;immagine rappresentativa di colorazione DAB di pomodoro lascia inoculato con soluzione di controllo (A) e Pseudomonas (B). Le foglie sono state colorate con 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina. Clorofilla è stato rimosso dalle foglie mediante bollitura in etanolo al 95%. Colorazione scura indica la presenza di H 2 O 2. Lascia solo inoculato con coltura batterica ha mostrato una colorazione scura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> Figura 3. Un esempio di output Proteome Discover dati di ferredossina-1, differenzialmente regolati redox proteina 14. Intensità del picco di sopra di ogni picco viene utilizzato per la quantificazione assoluta. Picco di intensità tra controllo e campioni inoculati viene utilizzatoper eseguire la quantificazione relativa. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> Figura 4. Un esempio di uscita Proteome Discover dati di una proteina che ha intensità simile picco tra un campione e controllo inoculato. Picchi di intensità simile suggeriscono la presenza di legami disolfuro non regolata da un cambiamento di trattamento.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questo protocollo fornisce informazioni su come eseguire la colorazione DAB così come cysTMT quantificazione etichettato cisteina redox. Queste procedure sono utili in esame produzione di ROS nonché l&#39;effetto sulla regolazione proteina quando Solanum lycopersicum viene inoculato con Pseudomonas syringae. I metodi presentati in questo protocollo forniscono un modo per esaminare ROS in campioni di foglie intere in un modo che fa sì che la minor quantità di danno al tessuto fogliare. La procedura di etichettatura fornisce un metodo per esaminare le proteine ​​regolate potenzialmente redox utilizzando un metodo di etichettatura cisteina. Questo è utile quando l&#39;esame di una fase precoce della risposta allo stress. Metodi quali isotopo codificato marcatore per affinità (ICAT) e cysTMT può essere utilizzato in esame potenziali redox proteine ​​regolamentati in campioni biologici. ICAT permette l&#39;etichettatura e il confronto di due campioni 12. Entrambi i metodi etichettare cisteine ​​libere e possono essere utilizzati per la proteina quantificzione 10,12. Tuttavia, il metodo cysTMT consente una riduzione nella variazione sperimentale e multiplazione 10. Il numero di tag a disposizione permette ai ricercatori di comprendere repliche o più campioni nel loro design sperimentale. Avendo più campioni fornisce il potenziale per un numero superiore di proteine ​​identificate. Uno dei principali svantaggi della tecnica cysTMT è che compromette la qualità complessiva di identificazione di proteine ​​a causa delle fasi di arricchimento selettivo per cysTMT etichettati-peptidi (6,5-6,6). Il numero di peptidi per l&#39;identificazione di proteine ​​dipende in larga misura il numero di residui di cisteina nella sequenza della proteina. Questo problema può essere superato presentando una parte del campione triptico prima di arricchimento per l&#39;identificazione spettrometria di massa proteica. A causa della natura del disegno sperimentale così come il meccanismo di etichettatura che utilizza il metodo cysTMT, certi passi sono critici. Durante l&#39;esecuzione di proteine ​​Precipitation e pellet lavaggi (3,9) è importante mantenere i campioni raffreddata su ghiaccio per ridurre la degradazione delle proteine. Durante etichettatura cysTMT, rimozione del reagente riduzione (4,6) è importante perché i campioni possono subire etichettatura inversa. Etichettatura inversa è possibile ridurre se reagente rimane nel campione. Se i campioni vengono ridotte dopo l&#39;etichettatura, il tag cysTMT può essere rimosso. Quando le etichette vengono aggiunti ai campioni, il pH deve essere controllata (4,7) in modo da avere un&#39;efficienza ottimale etichettatura. Inoltre, l&#39;analisi dei dati dipende da ciò che è richiesto del ricercatore e l&#39;obiettivo finale in utilizzando il protocollo. È anche dipendente dal software utilizzato come ogni software deve algoritmi differenti. Questo esperimento utilizza patogeno come stimolatore per la maggiore produzione di specie reattive ossidativi nel pomodoro, ma altre reazioni redox regolamentati può essere misurato di conseguenza. Questo progetto sperimentale è adattabile ad altri impianti e sistemi animali. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Metromix 500 </td><td> BWI Aziende </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobenzidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep sequenziale kit del reagente di estrazione 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X proteina saggio </td><td> Geno Tecnologia </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT reagenti </td><td> Thermo Scientific Protein Pierce Prodotti di ricerca </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli Sample Buffer </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Bio-Safe Comassie (G-250 macchia) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD colonna </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> Immobilizzato anti-TMT resina </td><td> Thermo Scientific Protein Pierce Prodotti di ricerca </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Centrifuga colonna </td><td> Thermo Scientific Protein Pierce Prodotti di ricerca </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II colonna C18 </td><td> Nuovo obiettivo </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Proteome Discoverer 1,2 software </td><td> Thermo Scientific Protein Pierce Prodotti di ricerca </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge provetta da centrifuga </td><td> Thermo Scientific Nalgene Società </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Microcentrifuga tubo (2 ml) </td><td> USA Scientific </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Top of Form &gt; Bio-Safe Coomassie StainBottom della Forma </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT arricchimento kit </td><td> Thermo Scientific Protein Pierce Prodotti di ricerca </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

Pseudomonas syringae pv. Pomodoro DC3000 ceppo non solo provoca la malattia batterica speck in Solanum lycopersicum, ma anche su specie di Brassica, nonché su Arabidopsis thaliana, un organismo geneticamente trattabili 1,2 pianta ospite. L&#39;accumulo di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) in cotiledoni inoculati con DC3000 indica un ruolo dei ROS nella modulazione morte delle cellule necrotiche durante la malattia batterica granello di pomodoro 3. Il perossido di idrogeno, un componente di ROS, viene prodotto dopo l&#39;inoculazione di piante di pomodoro con Pseudomonas 3. Il perossido di idrogeno può essere rilevato utilizzando un istochimica macchia 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina (DAB) 4. Colorazione DAB reagisce con perossido di idrogeno per produrre una macchia scura il 4 tessuto fogliare. ROS ha un ruolo normativo l&#39;ambiente cellulare redox, che può modificare lo stato redox di alcune proteine ​​5. La cisteina è un importante aminoacido sensibilemodifiche redox. Sotto blanda ossidazione, ossidazione reversibile di cisteina gruppi solfidrilici funge redox sensori e trasduttori di segnale che regolano una varietà di processi fisiologici 6,7. Di massa tandem tag (TMT) reagenti consentire l&#39;identificazione simultanea e multiplex quantificazione delle proteine ​​in diversi campioni con spettrometria di massa tandem 8,9. Le cisteina-reattivi TMT (cysTMT) reagenti consentono etichettatura selettiva e quantificazione relativa di cisteina contenenti peptidi da un massimo di sei campioni biologici. Ogni tag cysTMT isobarica ha la stessa massa madre nominale ed è composto da un sulfidrile reattivo, un gruppo MS-neutro braccio spaziatore e un MS / MS giornalista 10. Dopo etichettatura, i campioni sono stati sottoposti a digestione proteasica. I peptidi cisteina-marcati sono stati arricchiti con una resina contenente anticorpi anti-TMT. Durante MS / MS, una serie di ioni del reporter (cioè, 126-131 Da) emergono nella regione di bassa massa, fornisce informazioni sulla quantificazione relativa.Il flusso di lavoro è efficace per ridurre la complessità dei campioni, migliorando gamma dinamica e studiare modifiche cisteina. Qui vi presentiamo redox analisi proteomica del pomodoro Pst DC3000 trattati (Rio Grande) lascia utilizzando la tecnologia cysTMT. Questo elevato throughput metodo ha il potenziale per essere applicata a studiare altri processi fisiologici redox-regolati.

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Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Livello di specie reattive di ossigeno è elevata quando le cellule incontrano condizioni di stress. Qui si mostra l&#39;esempio di 3&#39;-3 &#39;colorazione diaminobenzidina così come l&#39;etichettatura cysTMT e spettrometria di massa per analizzare il proteoma redox in<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Trattati foglie di pomodoro.

Profiling tiolo Proteome Redox Utilizzando tag spettrometria di massa isotopica

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

profiling-thiol-redox-proteome-using-isotope-tagging-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Views.  University of Florida. Livello di specie reattive di ossigeno è elevata quando le cellule incontrano condizioni di stress. Qui si mostra l'esempio di 3'-3 'colorazione diaminobenzidina così come l'etichettatura cysTMT e spettrometria di massa per analizzare il proteoma redox in Pseudomonas syringae Trattati foglie di pomodoro.

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Ricerca

Biologia

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling di massa (OLIMP) di polisaccaridi extracellulari

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Analisi diretta di singole cellule mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profilatura di metiltransferasi e altri S-Adenosil- L-Omocisteina-binding proteine ​​mediante spettrometria di massa Compound Capture (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Identificazione di MyoD Interattoma Utilizzando Tandem Affinity Purification accoppiato alla spettrometria di massa

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...