Bu protokol aynı anda hücre büyümesi üzerindeki etkileri için birkaç yüz bileşikleri taramak için iki tahlil kullanmak için hızlı ve etkili bir strateji sunar. Tahliller belirli bileşiklersi sitotoksik olup olmadığı hakkında bize bilgi sağlayabilir, hücre büyümesini inhibe, ya da hücre büyümesini artırmak. Birlikte iki tahliller kullanarak, doğruluğu artırmak ve sitotoksik bileşikleri belirlemek edebiliyoruz.
İki tahlil sonuçlarının farklı olduğu durumlarda, bu strateji bize daha fazla başka yollarla incelenebilir hücresel fonksiyon üzerinde benzersiz etkileri ile bileşik belirlemek için izin verebilir. Bu stratejinin en büyük avantajı, hızlı, ucuz ve işgücü olmayan yoğun olmasıdır. Bir kez hakim, bu araştırmacılar kolayca bir hafta içinde 200 bileşiklerkadar bir birincil ekran gerçekleştirmek için izin verir, ve daha sonra başka bir hafta içinde 10 ila 15 bileşikler üzerinde ayrıntılı bir doz yanıt eğrisi gerçekleştirmek.
Prosedürü gösteren ben ve Rohini Manickam, bir personel bilim adamı ve laboratuvardan post-bakalorya adam olacaktır. İlk olarak, biyolojik bir güvenlik kabininde, NSC ortamına sahip bir T75 şişesindeki kültür hücreleri, teşbe başlarken en az %80'inin en fazla konca olacağını söyler. Ve şişeyi 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit olarak ayarlanmış bir hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Hücreler %80 birleştiğinde, şişeyi kuvözden çıkarın ve NSC ortamını aspire edin. Üç mililitre hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin ve kuvözde beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, şişeye yedi mililitre NSC ortamı ekleyin ve tüm hücrelerin kopmasını sağlamak için pipeti şiddetle ekleyin.
Ayrıştırılmış hücre çözeltisini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 200 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Süpernatant'ı tüpten çıkarın ve 10 mililitre NSC orta daki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına 200.000 hücreye yeniden ayarlamak için tüpe NSC ortamı ekleyin.
Daha sonra, hücre dışı matris ile kaplanmış üç 96 kuyunun 60 iç kuyusunda sütun alabilen hücre karışımı sütununun 100 mikrolitresini tablalamak için sekiz kanallı çok kanallı pipettorun sekiz yuvasından altısını kullanarak. Hücreleri içeren en dış kuyulardan potansiyel buharlaşmayı en aza indirmek için hücresiz tüm kuyulara 100 mikrolitre baz orta veya NSC ortamı ekleyin. Hücre kültürü mikroskobu altında, hücrelerin beklenen yoğunlukta oturduğunu doğrulamak için üç 96 kuyu plakasının her birinde en az 10 kuyuyu görsel olarak inceleyin.
37 santigrat derecede kuluçka ya da %5 karbondioksit. Hücre kültür plakalarını bölmeden 16 ila 24 saat sonra kuvözden çıkarın ve sekiz çok kuyulu yuvadan sadece altısını kullanarak NSC orta sütununu sekiz kanallı çok kuyulu pipettorla kolona aspire edin. Üç çoğaltma plakasının her kuyuya 95 mikrolitre taze NSC ortamı ekleyin ve plakaları kuvöze geri yerleştirin.
Sekiz kanallı çok kuyulu pipettor ile, boş bir U dipli, V dipli veya yuvarlak dipli 96 kuyu plaka iç 60 kuyuher birine NSC orta 49 mikrolitre ekleyin. Hazırlanan ana bileşik plakayı kapatın. Pipet, nsc orta içeren iç 60 kuyuların her içine ana plaka bileşik bir mikrolitre, ve bir tezgah üst pipettor ile seyreltilmiş bileşik üç kez karıştırın.
Daha sonra, kuvözden nsc üç 96 kuyu plakaları çıkarın ve 72 saat boyunca bileşik ile% 0.1 inküttü hücrelerinin 10 mikromolar son bileşik konsantrasyonu için 10 mikromolar nihai bileşik konsantrasyonu için bir 1000 seyreltme verim hücreleri içeren üç plaka her kuyuiçine seyreltilmiş bileşik beş mikrolitre dağıtmak ve sitotoksisite tahlilleri ile devam edin. Doz yanıt tayini yapmak için, bir 96 iyi kurmak. Altı DMSO kontrol çoğaltmaları için Sütun İki'yi kullanın ve 10 mikromolar yüksek dozile başlayan, altı dozda, iki kat seri seyreltmelerde üç farklı bileşiğin triplicates test.
DMSO'daki dört mikrolitreyi %100 DMSO veya test bileşimi 0,5 veya 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde 196 mikrolitre NSC ortamına seyreltin. Kuyuları kontrol etmek için seyreltilmiş DMSO'nun 25 mikrolitresini ve seyreltilmiş test bileşiklerinin 50 mikrolitresini ilgili kuyularına ekleyin. Pipet 25 mikrolitre NSC orta kalan boş kuyular için 96 kuyu plaka iç kısmında.
Çok kanallı pipettor ile, 10 mikromolar kuyulardan beş mikromolar kuyuya bileşiğin 25 mikrolitresini aktarın ve en az beş kez karıştırın. Pipet uçlarını değiştirin ve bileşiklerin her biri için altı doz toplam iki kat seyreltme ler triplicates oluşturmak için kalan satırları karıştırarak işlemi tekrarlayın. Her seyreltmenin beş mikrolitresini test edilmekte olan kültür hücreleriyle yeni bir tabağa aktarın.
Tabağı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le kuvöze yerleştirin. Hücreler 72 saat kuluçkaya yattıktan sonra, tabağı kuvözden çıkarın ve plaka okuyucunun içine yerleştirin. Çalışma için protokol ve deneme dosyaları ayarlamak için görüntüleyici yazılımını açın.
Görev Yöneticisi'nde Imager Manuel Modu'na gidin ve Şimdi Yakala'yı tıklatın. Gemi tipi olarak 96 iyi plaka seçin. Büyütme için 10 kez, kırmızı floresan protein 531 ve 593 görüntüleme tdTomato için seçin.
Bir kuyuya tıklayın. Ardından görüntüyü odaklamak için Otomatik Netleme'ye ve uygun pozlama süresi için Otomatik Pozlama'ya tıklayın. Gerekirse odağı ve pozlamayı manuel olarak ayarlayın.
Resmi yakalamak için kamera simgesini tıklatın. Ardından, protokolü oluşturmaya devam etmek için görüntünün üstündeki İşlem Çözümle'yi tıklatın. Ve Analiz sekmesini seçin.
Resmin sağında, Analiz Ekle Adımı'nda Hücresel Çözümleme'yi tıklatın ve Başlat'ı tıklatın. Görüntü, her bir hücreyi göstermek için vurgulanan hücreleri gösterir. Floresan eşiğine veya hücre boyutuna göre hücreleri daha iyi seçmek için parametreleri değiştirmek için Seçenekler seçimini tıklatın.
Görüntüleyici hücreleri düzgün bir şekilde sayıyorsa, ekranın alt kısmında Adım Ekle'yi tıklatın. Görüntü kümesinden deneme oluşturmak için ekranın üst kısmındaki simgeyi tıklatın. Açılan pencerede, Protokol sekmesinin altındaki Yordam'ı tıklatın.
Ardından, açılan yeni pencerede Oku'yu seçin. Hücreleri içeren yalnızca 60 kuyuyu seçmek için Tam Plaka'yı tıklatın. Değişiklikleri kaydetmek için Tamam'ı tıklatın.
Ardından Yordam penceresinde Tamam'ı tıklatın. Plakayı çalıştırmak için Oynat simgesini tıklatın. İstemde, dosyayı kaydedin ve ardından Yük Plakası isteminde Tamam'ı tıklatın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, görüntüleyici yazılım programındaki hücre sayısı verilerini analiz için bir elektronik tabloya indirin.
TdTomato görüntülemeişlemini tamamladıktan sonra iki saat içinde MTT tsay'ına başlayın. 25 miligram MTT tartın ve mililitre MTT stok çözeltisi başına beş miligram yapmak için beş mililitre NSC orta ile yeniden askıya alın. MTT görünür çökeltiler kadar, birkaç dakika için çözelti girdap.
Hücre kültür plakalarını kuvözden çıkarın ve hücre kültürü ortamını aspire edin. MTT'yi taze NSC ortamında 1 ila 10 arasında seyreltin ve seyreltilmiş MTT'nin her bir kuyuya 100 mikrolitre ekleyin. Hücreleri 37 derecede iki saat boyunca kuluçkaya yatırın.
Morumsu bir çökelti kuyudaki hücre sayısı ile orantılı olarak kabaca görülebilir. MTT çözeltisini plakalardan aspire edin ve her kuyuya %100 DMSO'luk 50 mikrolitre ekleyin. 400 RPM'de 10 dakika oda sıcaklığında bir shaker üzerine plakayerleştirin.
Bundan sonra, bir plaka okuyucu ya da plaka aktarın. Her kuyunun emiciliğini 595 nanometre önceden ayarlanmış dalga boyunda okuyun ve verileri tam olarak hücre sayısı verileri gibi analiz için elektronik tabloya aktarın. TdTomato floresan görüntülerinin incelenmesi, MTT ve hücre sayımı tsay arasında toksisite için iki kuyu uyumsuz ortaya koymuştur.
Bir kuyu için, hücre sayımı verileri toksisite olmadığını gösteriyordu. Ama MTT verileri yaptı. Başka bir kuyu tdTomato sayısına göre MTT tarafından hücre sayısı overestimated vardı, ve daha büyük hücrelere sahip olduğu ortaya çıktı, MTT tdTomato göre hücre sayısını hafife kuyularda ise, hücreler daha küçük olduğu ortaya çıktı.
Özetle, tdTomato tsay toksik olarak 11 bileşikler, büyüme inhibitörü olarak 11, ve büyüme arttırıcı olarak bir, 34 hücre büyümesi üzerinde belirgin bir etkiye sahip. MTT tsay toksik olarak 13 bileşikler sınıflandırılır 13, büyüme inhibitörü olarak iki, ve büyüme arttırıcı olarak bir, 41 hücre büyümesi üzerinde belirgin bir etkiye sahip. Bileşik WP1066 için canlı hücrelerin grafiği dört en düşük konsantrasyonları için hiçbir toksisite ile nispeten düz eğri gösterir.
Eğri hızla beş mikromolar dozdüşer, ve neredeyse tam toksisiteye düşer 10 mikromolar, hangi ölümcül doz yol açar 50 olarak 4.4 ve 6.0 tdTomato testi ve MTT testi için mikromolar. Bileşiklerin doz yanıt ekranında doğru seyreltilmiş olması önemlidir, böylece doğru doz yanıt eğrisi oluşturulur. Hücre büyümesini etkilemek için bu prosedür tarafından tanımlanan bileşikler daha fazla hücre büyümesini kontrol potansiyel olarak yeni sinyal yollarını belirlemek için fonksiyonel tahliller ile karakterize edilebilir.
Nöral kök hücreler için toksik bileşikler beyin kanserleri için potansiyel terapötik ajanlar olarak test edilmiştir, glioblastoma ve nöroblastom gibi. Memeli hücreleri, DMSO ve MTT ile işlerken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. DMSO ve MTT'yi kurumunuzun Kimyasal Atık Yönergelerine uygun olarak atın.
