Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

Biz kabul Austin Cyphersmith ve Mayandi Sivaguru (Genomik Biyoloji Carl R. Woese Enstitüsü, University of Illinois at Urbana Champaign) mikroskobu ile yardım için ve cömertçe mikroskopi özünde ekran ve video çekimi barındırmak için.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Deneylerde, biz en yaygın hataları uydurma dizilerin kalitesi ile ilgili ve kötü ilgi biyolojik sistem yanıtı karakterize bulduk. Biz cep mikroarray deneylerde yaygın arıza modları ve ilişkili sorun giderme adımları için Tablo 1&#39;de okuyucu bakın. Özellikle dizilerin kalitesiyle ilgili, biz aşağıdaki öneriyoruz. Böyle rodamin-konjuge dekstran gibi floresan etiketli molekülleri kullanarak programları parametreler ve tamponlar arraying teknik kalite ve sağlamlığı onaylayın. önce ya da daha fazla görsel üreticinin talimatlarına göre arraying ve sonra ya tamamen temiz pimleri pim kanalları ışık mikroskobu kullanılarak enkaz açık olup olmadığını kontrol edin. genel protein lekeleri veya immün kullanarak dizilmiş biyomolekül tutma onaylayın. 70 kDa altında bir moleküler ağırlığa sahip biyomoleküller sık hidrojel 23 korunmaz unutmayın </<html> sup&gt; 31. Birden fazla hücre tiplerini kullanarak dizilmiş biyomolekül hücre işlevselliğini doğrulamak. Sadece yapışık hücreler diziler ile uyumlu olduğunu unutmayın; Buna ek olarak, diziler kaynaşmasının hücreye özel özellikleri (örneğin, integrin ifade profili) ve seçilen ECM proteinleri bağlıdır. Sınırlı yer nedeniyle, burada dizi tasarım, düzen ve imalat geniş bir tedavi verilmez ve daha önceki 23 çalışır için, 25 okuyucu bakın. Biz genel olarak 10-20 benzersiz biyomolekül koşulları (yani, 5-10 noktalar / durumu) oluşan 100 nokta Altdizilim (150 mikron nokta çapı 450 mikron merkez-merkez mesafesi) kullanın. bir dizide altdizilimlerden sayısı rahatça biri 25 × 75 mm mikroskop lamı üzerine 1,280 kadar ölçeklendirilebilir ilgi biyomolekül koşulları sayısına bağlı olarak değişir (~ 64 altdizilimlerden içinde 6.400 noktalar)xref &quot;&gt; 25, 31 parametre üzerinde daha fazla ilgi desen boyutuna bağlı olarak değişir;. 75 desen üretme kapasitesine sahip pimleri - 450 mikron kolayca kullanılabilir. Dizi deneyler en iyi diğer kültür biçimlerini kullanarak yüksek faiz-puanlama dizilmiş koşulları, tahlil okumalara ve biyolojik model sistemleri doğrulama ile tamamlanmaktadır. Spesifik olarak, daha ayrıntılı bir şekilde, standart moleküler biyoloji teknikleri (örneğin, QRT-PCR, immün) veya standart TFM ile bağlantılı dökme kültürleri kullanılarak seçme dizilmiş koşullarının kanıtlayan önerilir. Genetik manipülasyon Ayrıca diziler gözlenen etkileri onaylamak için hizmet, uygun bir biyolojik model sisteminde ilgi faktörünün (örneğin, demonte veya aşırı ifadesi). In vivo hayvan modelleri doğrulama başka bir yöntem temsil en son galektin-3 ve galektin-8 merkezi rolü teyit etmek için, örneğin, kullanılanAkciğer kanseri metastatik niş, başlangıçta hücre mikroarray 31 49 aracılığıyla belirledi. Diğer bir dizi yöntem, iki boyutlu bir mikrofabrike sistemleri 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ve üç boyutlu tasarlanmış biyomalzeme sistemleri 56, çeşitli 57, 58 dahil olmak üzere, hücresel fonksiyonları microenvironmental düzenleme, problamak için kullanılmıştır , 59, 60, 61. diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada tarif edilen hücre mikrodizi platformun özel avantajlar oluşur: (1) ila yukarı çıktıyüzlerce veya etkileşim etkilerinin analizi sağlayan faktörlerin farklı kombinasyonları, binlerce; (2) erişilebilir, otomatik görüntüleme ve analizi; (3) dizilmiş faktörlerin kontrollü sunumu ile hem biyokimyasal ve biyofiziksel okumalarla entegrasyonu; (4) alt-tabaka malzemesi özellikleri değiştirme yeteneğini de; hücre kaderinin ve fonksiyonu ve (5) yüksek içeriği tek hücre analizi. Özetle, ayarlanabilir alt tabaka sertliği yüzeylerde TFM hücre microarrays kombinasyonu hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının kapsamlı karakterizasyonu sağlar. Burada görüldüğü gibi, bu platform genellenebilir ve hali hazırda hücre farklılaşması ve mechanotransduction kombinatoryal mikro-çevresel bir düzenleme daha iyi anlaşılması doğru yapışık hücre tipleri ve doku çeşitli bağlamlarda da uygulanabilir.

Hücre ve çevresindeki mikro-çevresel faktörler arasındaki etkileşimler geliştirme, homeostaz ve hastalığın patojenezi, 1, 2, 3, 4 boyunca biyolojik süreçlerin büyük bir çeşitlilik aracılık eder. Bu mikro-çevresel etkileşimler ligand-reseptörü aracılığıyla hücrelere çözünür faktörlerin teslim bağlayıcı hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri bulunmaktadır. Yukarıda biyokimyasal açıdan ek olarak, bu tür alt-tabaka mekanik özellikleri biofiziksel parametreleri (örneğin, Young modülü, gözeneklilik) ve hücre şekli ve ilişkili alt mechanotransduction artan hücre farklılaşması 5, 6, 7, 8, anahtar aracılar olarak tanındı adres 9 <sup&gt; 10. Bu microenvironmental etkileşimler kaynaklanan sinyaller gen ağları ve sinyal yolları girdi olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, bu hücre iç bileşenler aynı zamanda hücre hakiki genetik programlar ve hücre dış mikro-çevresel faktörlerin 5, 11, 12 arasındaki karmaşık eş düzenleyici döngü tamamlayan salgılanan faktörler ve matris-parçalayıcı enzimler yoluyla mikro geri bildirimde bulunur. Mikro-çevresel faktörler tarafından kontrol edilen sunum için tasarlanmış sistemlerinin kullanımı farklı bağlamlarda 13, 14, 15, bir dizi yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle mikrofabrike sistemleri, minyatürleştirme 13 ile protein ve hücreleri hem de yüksek paralelleştirilmiş analiz hassas mekansal model oluşturmanın kolaylaştırmıştır <supSınıf = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Hücre mikrodizileri biyomoleküllerin kombinasyonları iletişim baskılı bir esnek poliakrilamid hidrojel alt-tabaka 23, 24, 25 üzerine olan bu tür bir mikrofabrike sistemi temsil eder. Hücre-yapışkan bileşenlerin (yani matriks proteinleri) dahil sık sık immünsitokimya ve floresan gazetecilere yoluyla aşağı analizi ile takip edilmektedir mikrodizinlerinde sürekli hücre yapışması ve kültürünü mümkün kılar. Hücre mikroarray&#39;ler verimli karaciğer hücre fenotip 23, 26, nöral prekürsör farklılaşma 27 mammar geliştirilmiş bir anlayış elde yönelik edilmiştiry progenitör kader kararları 28, embriyonik kök hücre bakım / farklılaşma 23, 29, 30, akciğer kanseri metastazı 31 ve melanom 32 tedavi yanıtı. Son zamanlarda endoderm tarifnamede 33, karaciğer progenitör farklılaşma 34, 35, ve akciğer tümör hücre tedaviye yanıt 36 hücre dışı matris (ECM) protein bileşiminin rolünü tanımlamak için hücre mikrodizileri kullanımını göstermiştir. Bu çalışmalarda, biz dizi platformunun kombinasyon yeteneklerinin artırılması ve hücre dışı matriks kompozisyonu ve biyomekanik ile hücre içsel sinyalizasyon kavşakları keşfetmeye odaklanmıştır. Ayrıca, yetenek kantitatif şekilde karakterize sağlamak için bu dizi platformda biyofizik readouts hayata geçirdikfarklılaşma hücre kontraktilite terize rolü 35 işler. Bunu yapmak için, biz hücre tarafından üretilen çekiş yüksek verimlilik değerlendirilmesini sağlamak için hücre mikroarray&#39;ler ile çekme kuvvet mikroskobu (TFM) entegre edilmiştir. TFM hücresi tarafından oluşturulan çekme kuvvetlerinin ölçülmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, bileşim ve yerel mikro-37, 38, 39, 40 biyomekanik tek-hücre ve doku düzeyinde işlev koordinasyonu ile ilgili önemli bilgiler sağlamıştır. Bu nedenle, hücre mikrodizileri ile TFM birleştiren temel fizyolojik olarak uygun biofiziksel parametreleri ölçmek için yüksek verimli bir sistem sağlar. Burada anlatılan hücre mikroarray platformu dört bölümden oluşmaktadır: poliakrilamid yüzeylerde, diziler, hücre kültürü ve tahlil okuma üretiminde ve verilerin analizi imalatı. Görmekİlk üç deney bölümleri şematik özeti Şekil 1 &#39;dir; immünofloresan verilerin analizi odaklanarak son bölümde bir şematik özeti için bakınız Şekil 2. Biyomekanik hücre alt-tabaka etkileşim çalışmalar hücre mikrodizi platformu adapte amacıyla, Wen et al başına ayarlanabilir Young modülü ama benzer gözenekli poliakrilamid substratlar kullanılır. 41. onların alt tabaka üzerinde hücreler tarafından uygulanan kuvvetlerin TFM ölçümleri etkinleştirmek için, biz sık sık diğer gruplar tarafından kullanılan slaytlar kalın cam mikroskop ek olarak cam alt Petri kabı biçimi uyguladı. Bu nedenle, bu hücre mikrodizi platformu ayrı cam alt yemekler TFM ile mikroskop lamı ve hücre tarafından üretilen kuvvetlerin immünofloresan ile hücre farklılaşmasının paralel ölçümler yeteneğine sahiptir. Biz de yaygın hücre mikroarray&#39;ler ile kullanılan analitik yaklaşıma çeşitli iyileştirmeler uyguladık. Özelly, yerine genel ada yoğunluğu parametrik Z-puanlama, biz tek hücreli yoğunluğunu ölçmek ve normal olmayan dağılımlar için hesap ve daha doğru hücresel davranışını tanımlamak için kantil normalleşme uygulayın. Biz bu gelişmeler biyokimyasal ve biyofiziksel hem ipuçları önemli, kesişen rol oynadığı biyolojik süreçlerin araştırılması yönünde özellikle yarar sağladığına inanıyoruz. Ayrıca, bizim analitik gelişmeler tek hücreli ve nüfus seviyesi davranışı sapmak hangi hücresel fonksiyonları bir dizi çalışmalara hücre mikroarray&#39;ler uygulanmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td></tr><tr><td>100 &amp;times; penicillin&amp;ndash;streptomycin solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 &amp;times; 60 mm coverglasses</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Store under inert gas per manufacturer&#039;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td><td>Cell E&amp;amp;G</td><td>GBD00002-200</td><td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td></tr><tr><td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>6-well polystyrene microplates</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>Collagen III, human</td><td>EMD Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV, human</td><td>EMD Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>Used as a marker for array location.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant JAG1, rat</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin, human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope, inverted</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (&lt;em&gt;i.e&lt;/em&gt;., 37 &amp;deg;C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;) is highly advisable for TFM.</td></tr><tr><td>Fluoromount G with DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, mouse</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Microarray scanner</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td></tr><tr><td>Microarrayer</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Micro</td><td>Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.</td></tr><tr><td>Microscope slides, 25 &amp;times; 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0.9 &amp;ndash; 1.1 mm thickness.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT15710</td><td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Protein A/G, recombinant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex drying tray, 2,000&amp;nbsp;mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>Rectangular 4-chambered culture dish</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Stealth pin for arraying</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&amp;ndash;450 microns) as suited to your particular application.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

elastik hidrojel yüzeyinde biyomoleküllerin temas baskılı kombinasyonları oluşur microfabricated hücresel mikroarray&#39;ler, hücre farklılaşması üzerine dizilmiş biyokimyasal sinyallerin etkisini ölçmek için bir sıkı kontrol, yüksek verimli mühendislik sistem sağlamak. Hücre mikrodiziler kullanarak Son çalışmalar, birçok microenvironmental faktör paralel olarak sunulduğu kombinasyon çalışmaları için kendi programını ortaya koymuştur. Ancak bu çabalar hücre yanıtları biyokimyasal ipuçlarının etkilerini araştıran öncelikle odaklanmıştır. Burada, çekiş kuvveti mikroskobu ile immünofloresan ve biyomekanik hücre-substrat etkileşimleri hem hücre farklılaşması değerlendirmek için ayarlanabilir malzeme özelliklerine sahip bir cep mikroarray platformu sunuyoruz. Bunu yapmak için, biz ya mikroskop lamı veya cam alt Petri kapları üzerinde fabrikasyon Young modülü değişen poliakrilamid hidrojeller kullanan iki farklı biçimleri geliştirmişlerdir. Biz bes sağlamakBu hidrojel yüzeylerde microarrays imalat, mikrodizinlerinde sonraki hücre kültürü ve veri edinimi için t uygulamaları ve sorun giderme. Bu platform da biyokimyasal (örneğin, hücre dışı matris bileşimi) hem ve biyofiziksel (örneğin, alt-tabaka sertliği) işaretler rolleri kesişen önemli oynayabilir biyolojik proseslerin incelenmesi kullanılmak için çok uygundur.

Bu platformu kullanarak, karaciğer atalarıdır 34, 35 kaderi şartnamede hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının rolünü araştırdık. Protein A / G-konjuge Çentik ligandlan poliakrilamid hidrojel (Şekil 3A), geliştirilmiş saklama ve kümelenme gösterdi ve safra kanalı, hücre kaderine (Şekil 3B) doğru karaciğer progenitörlerin farklılaşmasını sürüş Ayrıca sahip idi. Tek hücreli bir analiz kullanarak, liganda karaciğer progenitörlerinin tepkisi de bağlıdır bulgu, ECM proteinleri kolajen I, kolajen III, kolajen IV, fibronektin ve laminin (Şekil 3C) çentik ligandlarına yanıt sayısal ECM bağlam. Son olarak, ligandlar DLL1 ve Jag1 olmadan karaciğer atalarıdır oluşturmak için ShRNA demonte kullanılmaktadır. dizilmiş Notch bağına yanıt pr bağlı olarak değişiklikHer iki ligandın özünü, hücre dışsal liganda yanıt hücre iç ligand ifade (Şekil 3D) bir fonksiyonu da doğrular. Dahası, çift pozitif bir tat alt popülasyonunu gözlenmiştir (ALB + / OPN +) DLL1 demonte (Şekil 3D) hücreler. Birlikte, bu temsili sonuçlar göstermektedir: (1) tek tek ligandların devirme ile birden dizilmiş ECM proteinleri ve Çentik ligand eşleştirme ile gösterildiği üzere bir dizi formatı kombinasyon yetenekleri; (2) sadece bir işlevi ECM proteinlerini dizilmiş değil, aynı zamanda protein A / G-aracılı birleştirme aracılığı ile hücre-hücre ligand dizilmiş; ve (3) bizim tek hücreli analizi ve benzersiz alt popülasyonlar ayırt etme yeteneği uygulanması. Ayrıca karaciğer progenitörlerinin farklılaşma alt-tabaka sertliği ve ECM bileşimi (Şekil 4a, her iki bağımlı olduğu görülmektedir </str<html> fibronektin sadece sert yüzeylerde (Şekil 4B) üzerinde farklılaşma desteklerken ong&gt;), özellikle kolajen IV bulma hem yumuşak ve sert yüzeylerde farklılaşma destekleyicidir. TFM ölçümlerinin Temsilcisi ısı haritaları kollajen IV düşük substrat sertliği de sürekli çekiş stres safra yolu hücreleri (Şekil 4C), ortalama kök ortalama kare değerleri (Şekil 4D) tarafından teyit bir bulgu haline farklılaşmayı teşvik önerdi. Birlikte, bu temsili sonuçlar göstermektedir: (1) bir ayarlanabilir sertlik yüzeylerde hücre mikroarreyleri ile TFM başarılı entegrasyon hücre fenotipi ve çekiş stres hem değerlendirmek için; (2) matris bileşimi ve alt tabaka sertlik hem karaciğer progenitör hücre kaderinin koordinasyonu; ve (3) hücre mikrodizilerinde bizim TFM analizi ve tipik bir gerilim profillerini uygulanması. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: İlk Üç Deneysel Bölümler gösteriliyor Özet şematik. Bölüm 1, cam yüzeylerde temizlenmeli ve poliakrilamid hidrojeller fabrikasyon kolaylaştırmak için Silanlanmış edilir. Bölüm 2&#39;de, ilgi konusu biyomolekülün kombinasyonları 384 kaynağı mikro-hazırlanır. Bir robot arrayer sonra hidrojeller üzerinde diziler imalatı, temiz pimleri, kaynak mikroplaka ve poliakrilamid hidrojeller ile yüklenir ve başlatılır. Bölüm 3, hücreler dizilmiş alan üzerine ekilip ilgi kültür protokolü uygulandı, bundan sonra, uygun izin verilir. uç noktada, hücreler ya TFM kullanarak immünsitokimya / Immünofloresan için sabit veya analiz edilir. Ölçek çubukları 75 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> = &quot;1&quot;&gt; sayfa içinde <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Şekil 2: İşleme ve Diziler gelen İmmünofloresan Verilerin Analizi. (A) Karo, kompozit 32 bit RGB görüntüleri ilk binned ve daha sonra tek tek 8-bitlik kanallara ayrılır. dizilmiş floresan belirteçler ve hücre adaların bir arada kullanarak, dizinin üç köşesi otomatik yönlendirme ve dizilerin gridding sağlamak için belirlenmiştir. (B) tek-hücreli veri giriş dizilerinin her kanal için oluşturulur. Deneysel sürüklenme hesaba amacıyla, kantil normalleştirme tüm çoğaltır genelinde tek bir paylaşılan dağıtım üreten, biyolojik tekrarında uygulanır. Quantile normalize veri sonradan ya da tek hücreli dağılımlarının doğrudan analizi (bir etiket için pozitif yüzde hücre yoğunluğu ortalama örneğin, hücre / ada) çizilen ve topluluk ölçümlerinin hesaplanması yoluyla yorumlanır.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Şekil 3: Notch Ligand Sunum Aracılık Karaciğer Progenitör Farklılaşma. (A) Fc-rekombinant Çentik ligandları Jagged-1 (JAG1) ve Delta gibi 1 (DLL1) Protein A / G ile dizilmiş gelişmiş tutma ve kümelenme sergiledi. Ölçek çubuğu 50 mm. (B) Karaciğer ataları Notch ligand ile ibrazı üzerine safra yolu hücrelerine diferansiye. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer bir etiket, albümin (ALB) bir karaciğer hücre belirteci olduğu ve osteopontin (APN) olan bir safra kanalı, hücre belirtecidir. Ölçek çubuğu 150 mm. (C) ECM proteinleri üzerinde çentik ligandlar JAG1, DLL1 ve Delta gibi 4 (DLL4) için APN için pozitif hücrelerin yüzdesi miktarının belirlenmesi I kollajenin, collagen III, kolajen IV, fibronektin ve laminin. Student t-test P &lt;0.05 (*) için belirtilen P-değerleri, her ECM proteininde içinde her dizilmiş Çentik ligand için kontrol IgG karşı yapıldı. Notch ligandları JAG1, DLL1 ve DLL4 mevcuttur kollajen III hücreler için ALB ve APN (D) Görüntüleme sitometri. Çentiksiz karaciğer progenitörler DLL1 ve Jag1 (yani, shDll1 ve shJag1) shRNA demonte kullanılarak elde edilmiştir ligandları. Ortalama ± sem Bu rakam Kaylan&#39;ın ark tadil edilmiş olduğu (C) &#39;de veriler sunmuşlardır. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Şekil 4: The Matrix Kompozisyon ve Yüzey Sertlik CooKaraciğer Progenitör Farklılaşma rdinate. Kanal hücreleri safra (A) Karaciğer progenitör farklılaşma ECM kompozisyon ve alt tabaka sertlik hem bağlıdır. DAPI ALB bir karaciğer hücre işaretleyici ve APN bir safra kanalı, hücre işaretleyici, nükleer bir etikettir. (B) Young modülü alt tabakalar 30 kPa, 13 kPa, kollajen 4 kPa I (C1), kolajen IV (C4), fibronektin (FN), ve iki yönlü kombinasyonları ile ilgili APN için pozitif hücrelerin yüzdesi kantifikasyonu bu ECM proteinleri. (C) Celi bir gerilim alt-tabaka sertliği ve ECM bileşimin hem bağlıdır. (D) Young modülü alt tabakalar 30 kPa ve kollajen 4 kPa I (C1), kolajen IV (C4), fibronektin (FN), ve bu her iki yollu kombinasyonları, çekiş stres kök-ortalama-kare değerlerinin miktarının belirlenmesi ECM proteinleri. (B) ve (D) &#39;de, veriler SEM ve Student t-test, ortalama ± olarak sunulduP &lt;0.05 (*) p &lt;0.01 (**) için belirtilen P-değerleri, her ECM kombinasyonu için 30 kPa karşı gerçekleştirilen edildi ve p &lt;0.001 (***). Ölçek çubukları 50 mikron. Bu rakam Kourouklis ark modifiye edilmiştir. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Bölüm </td><td fo:width="1.5in"> Sorun </td><td fo:width="1.5in"> potansiyel Nedenler </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td rowspan="3"> Poliakrilamid Yüzey 1. Fabrikasyon. </td><td> Coverglass hidrojelden kaldırılamaz. </td><td> Overpolymerization. </td><td> &lt;10 dakika (4 W / m 2) polimerizasyon süresini azaltın. UV crossli kontrolnker çıkış beklenen aralığı içindedir. </td></tr><tr><td> Kötü poliakrilamid hidrojel polimerizasyon. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Polimerizasyon süresi&gt; 10 dakika (4 W / m 2) artırmak. UV çapraz bağlayıcı çıkışı beklenen aralıkta olup olmadığını kontrol edin. </td></tr><tr><td> Poliakrilamid hidrojellerin coverglass çıkarıldıktan sonra zarar görmektedir. </td><td> Yumuşak poliakrilamid hidrojeller zarar kolaydır. </td><td> Biz özellikle (yani, 4 kPa) hidrojeller yumuşak hidrojel üretim verimi (~% 50) azalan gözlemlemek. nazikçe hidrojeller Kulp ve istenilen verimi elde etmek için başlangıç ​​sayısını artırmak. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Diziler 2. Fabrikasyon. </td><td rowspan="2"> Kötü veya tutarsız nokta morfolojisi. </td><td> Tutarsız nemlendirici fonksiyonu. </td><td> Bu nemlendirici kontrol edin ve her yazdırma çalışması boyunca işlevsel reometre ve% 65 RH korumak. </td></tr><tr><td> baskı kafası veya takunya sıkışmış pimleriged. </td><td> ücretsiz pim hareketine izin vermek için yazıcı kafasını temizleyin. iyice önce veya her baskı çalışmasından sonra temiz iğneler pim kanallarından agrega kaldırmak için. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Hücre Kültürü ve Tahlili Yürütme. </td><td rowspan="2"> İlk eki sonra diziler Hücre dekolmanı ya da ölüm. </td><td> Overseeding ve aşırı çoğalması. </td><td> İlk tohumlama yoğunluğu ve süresini azaltın. hücre çoğalmasını azaltmak için dizi kültürü sırasında &quot;bakım&quot; veya &quot;farklılaşma&quot; ortamını kullanın. </td></tr><tr><td> hidrojel toksik akrilamid Yayın. </td><td> Akrilamid difüzyon / tahliyesine imkan vermek ve hücre toksisitesini azaltmak için en az 3 gün boyunca dH 2 O hidrojeller bekletin. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Hücreler diziler eklemek gerekmez. </td><td> Underseeding. </td><td> İlk tohumlama yoğunluğu ve süresini artırın. Bir daha güçlü yapışık hücre türünü kullanın. </td></tr><tr><td> Zayıf birikimimatris veya Biyomoleküllerin durum. </td><td> Parçacıkların ve agrega temiz iğne, baskı parametrelerini onaylamak ve floresan belirteçler, örneğin, rodamin-konjuge dekstran lekelenme değerlendirir. </td></tr><tr><td> hücre-matris etkileşimlerinin spesifikliği. </td><td> Farklı hücre tipleri, bazı ancak diğer ECM proteinleri spesifik olarak yapışır. senin hücreleri ile birden fazla farklı ECM proteinleri test edin. </td></tr><tr><td> imalattan sonra suboptimal dizi depolama. </td><td> Biz dondurma sırasında faz değişiklikleri önlemek için kısmen,% 65 RH ve oda sıcaklığında gece boyunca fabrikasyon dizileri saklamak öneririz. Hücre yapışması, her iki nem, sıcaklık ve depolama süresi karşı duyarlıdır; Bu parametreler deneyler için optimize / tutarlı olduğundan emin olun. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Hücre kültürü sırasında cam alt tabakadan hidrojel dekolmanı. </td><td> Kötü slayt temizleme ve silanizasyon. </td><td> slayt temizliği için çalışan çözümler değiştirin vesilanizasyon. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hidrojel. </td><td> daha uzun 15-30 dakika süreyle sıcak bir plaka üzerinde kurutucu hidrojeller bırakmayın. </td></tr><tr><td> Verilerin 4. analizi. </td><td> tekrarlanan noktalar ve slaytlar arasında yüksek değişkenlik. </td><td> Dizi üretiminde değişkenliği. </td><td> pim ve yazıcı kafası temiz olup olmadığını kontrol edin. nemlendirici işlevi onaylayın. Görselleştirmek ve floresan işaretlerini kullanarak spot ve dizi kalitesini ölçmek. olarak saklayın dizileri yukarıda önerilir. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Sorun Giderme.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

a-high-throughput-cell-microarray-platform-for-correlative-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K Görüntüleme.  University of Illinois at Urbana–Champaign.  Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar. 

Video: A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Tıp

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

PDMS kullanarak yüksek verim çekiş kuvveti mikroskobu dönüşüm büyüme faktörü-β epitelyal-mezenkimal geçiş üzerinde doz bağımlı etkileri ortaya çıkarır

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, function at both the cellular and tissue levels,and regulate the mechanical systems in the body. Numerous biological processes are force-dependent, including motility, adhesion, and division of single-cells, as well as contraction and relaxation of organs such as the heart, bladder, lungs, intestines, and uterus. Given its importance in maintaining proper physiological function, cellular contractility can also drive disease processes when exaggerated or disrupted. Asthma, hypertension, preterm labor, fibrotic scarring, and underactive bladder are all examples of mechanically driven disease processes that could potentially be alleviated with proper control of cellular contractile force. Here, we present a comprehensive protocol for utilizing a novel microplate-based contractility assay technology known as fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS), that provides simplified and intuitive analysis of single-cell contractility in a massively scaled manner. Herein, we provide a step-wise protocol for obtaining two six-point dose-response curves describing the effects of two contractile inhibitors on the contraction of primary human bladder smooth muscle cells in a simple procedure utilizing just a single FLECS assay microplate, to demonstrate proper technique to users of the method. Using FLECS Technology, all researchers with basic biological laboratories and fluorescent microscopy systems gain access to studying this fundamental but difficult-to-quantify functional cell phenotype, effectively lowering the entry barrier into the field of force biology and phenotypic screening of contractile cell force.

This work presents a flexible protocol for utilizing fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS) Technology in microwell format for simplified, hands-off quantification of single-cell contractile forces based on visualized displacements of fluorescent protein micropatterns.

Mikrodesenli Elastomerler Kullanarak Tek Hücreli Kasılmanın Basitleştirilmiş, Yüksek Verimli Analizi

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...