Bu çalışma Wellcome Trust hibe sayısı [077.108] tarafından desteklenmiştir GJW verilir.

1. Bait ve Prey Plazmid ifade Vektörler Kütüphanesi Derleme <ol><li> Hücre yüzey reseptörü ve etkileşimleri açısından taranmalıdır ilgi salgılanan proteinlerin bir listesini derleyin ve uygun bir protein dizisi veritabanından kendi sıraları almak. Bir N-terminal salgılayıcı sinyal peptit içeren Çoğu protein (bu tip I, GPI-bağlantılıdır ve salgılanan proteinlerin dahil) uygundur. Tipik olarak, bir protein familyası (örn. imünoglobulin süperailesine veya eritrosit gibi belirli bir hücre tipinde sınırlı tüm reseptörler) seçilir. </li><li> Protein özelliği tahmin yazılımı kullanılarak sinyal peptid ve transmembran bölge konumunu belirleyerek dışı bölgelerin ölçüde belirler. Biz genellikle SignalP v3.0 5 ve TMHMM v2.0 6 kullanın. </li><li> Her bir reseptör için tüm ectodomain parçasının büyütülmesi tasarım primer seti. Bir olup, bu amaç için uygun olan yem ve av vektörler bir takımdır sahipAddgene (gelen ULLANILABİLEN <a href="http://www.addgene.org/">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Bir Notl kısıtlama enzimi sitesi ve optimal bir Kozak sekansı dahil etmek metionin başlangıç ​​etrafında duyu primeri tasarlanması; Bu tam eşleme genin spesifik sekansı (Şek. 2A) ve 25 baz çifti tarafından takip edilir. </li><li> Hemen önceki tahmin transmembran bölgeyi çözünebilir bir rekombinant bir protein olarak tamamını ifade ectodomain şekilde tip I reseptör proteinler kesecek şekilde tasarlanması anti duyum primeridir. Daha sonra, bir C-terminali sıçan Cd4d3 4 proteini etiketi 7 (Şek. 2A) çerçeveye tercüme edilir Bu astar bir Asci sınırlandırma bölgesi içerir. </li><li> Bu primerler kullanılarak tüm genlerden ectodomain parçaları yükseltmek ve yem veya av vektör içine klonlamak. Biz bazen uygun bir memeli ifade vektörüne on klonlama sonrasında önce, biz pTT3 vektör 3,4 bir türevini kullanan ilk mekik vektörleri içine clone yararlı buluyor. Yem ve yırtıcı vektörler contai Hemaşağıdaki gibi n C-terminal protein etiketler (Şek. 2B). <ol><li> Yemler: E.coli Bira enzimi için substrat bir peptid sekansı tarafından takip ve bu nedenle belli bir lisin çökeltisinde üzerine monobiotinylated edilebilir sıçan CD4 (Cd4d3 4) proteinin etki 3 ve 4 içeren bir etiket (Şek. 2B) . Cd4d3 4 etiketi OX68 monoklonal antikoru tarafından fark edildi ve ELISA ile yem proteinlerinin ifadesini ölçmek için kullanılır. Dolayısıyla, monomer cinsi yem proteinler ve monobiotinylated vardır. Biotinylatable peptid saflaştırılması için bir 6-onun etiketi ile değiştirilir Ek yem proteini vektörler kullanılabilir. </li><li> Preys: kurbanlarına da sıçan kıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) ve bir C-terminali β-laktamaz enziminin bir peptid sekansı takiben bir sıçan Cd4d3 4 etiketi içerir. COMP peptid av formları pentamers kez (Şekil 2B) ifade sağlar. </li></ol></li></ol> 2. Prey ve Bait-protein İfade Biz kullanınBizim proteini kütüphaneleri üretmek için HEK293E hücre hattı 4 süspansiyonu kültürü, fakat herhangi bir memeli ekspresyon sistemi kullanılarak, uygun bir yüksek seviyeli ekspresyon sistemi uygun olmalıdır. Ticari olarak kullanılan bir alternatif Serbest sistemidir. Hücreler rutin 37 titreyen platformu (125 rpm) kültüre ° C olarak,% 5% 70 bağıl nemde CO 2. Pozitif ve negatif kontrol proteinler de ifade edilmelidir. Rat Cd4d3 +4 etiketi sadece bir parçası yem ve yırtıcı her ikisi de mevcuttur ve uygun negatif kontroller vardır. Benzer şekilde, bir pozitif kontrol kodlamak yem ve yırtıcı vektörler (Addgene) mevcuttur; biz genellikle sıçan Cd200-Cd200R etkileşimi 8 kullanın. <ol><li> Tohum HEK293E hücreleri 2.5 x 10 5 hücrelik bir yoğunlukta mL -1 az önce transfeksiyon için günde. Üreticinin önerilerini takip Freestyle293 medyada 50 ml hacimde Biz rutin kültür hücreleri. Verimli biyotinilasyon sağlamak için, t ekO hücre kültürü aracı maddesi 100 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek D-biotin ile yem proteinleri üretmek için kullanılır. Av proteinleri ifade etmek için kullanılan Orta ek D-biotin ile takviye edilmesi gerekmez. </li><li> Ertesi gün, transfekte hücreler (örneğin 293fectin), uygun bir reaktif kullanılarak Transfeksiyonlar. 50 ml kültür transferinde yem veya av plazmid yapıları 25 mcg kullanın. Biyotinile yemler üretmek için, eş-transferinde plazmid kodlama yem E.coli protein biotin ligaz (bir salgılanan formu kodlayan bir plazmid ile inşa Addgene temin edilebilir Bira). Plazmid kodlama salgılanmış Bira bir protein 10:01 oranında (2,5 ug) de eş-transfekte yem plazmid. </li><li> İlk filtre 0.22 uM yoluyla süpernatan filtrasyon takiben 20 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri tarafından Hasat kültürler beş gün post-transfeksiyon. </li></ol> [İpucu: Yem ve yem proteins 4 ° C&#39;de sulandırılmadan ve genel bir kural olarak bir yıl içinde kullanılmalıdır olarak saklanmalıdır. Böyle 50 mcg / ml polimiksin B sülfat veya süpernatantları bakteri bulaşmasını önlemek için 10 mM NaN 3 olarak Bakteriyostatik ekleyin.] 3. Bait ve Prey Örnekleri Normalisation AVEXIS assay of önemli özelliklerinden biri, rekombinant proteinlerin salgılanan çünkü önceden deneyde kullanılan etmek kurulmuştur eşik aktiviteleri içinde seyreltilir veya (normalize) konsantre edilebilir olmasıdır. Büyüklükte 4 kadar siparişler - - ve böylece normalizasyon adımı sırasında önemli ölçüde ekranlarını yanlış sayısını azaltan We rekombinant proteinlerin ifade edildiği az düzeyde geniş bir aralık yayılma olduğunu bulduk. 3.1 Bait normalleşme Not: biyotinile bai ile yarışacak beri D-biotin Konjuge olmamış medya (genellikle diyaliz ile) kaldırılması gerekirbağlanma yerleri streptavidin bağlanmaktan t proteini. <ol><li> Diyaliz tüp, etiket içine yem süpernatantlar aktarın, güvenli klibi ve serbest biotin kaldırmak için böyle PBS gibi uygun bir tampon karşı yoğun diyaliz. </li></ol> [Tip: Bu yeterli diyaliz normal olarak bir 24 saatlik bir süre boyunca 4 değişikliklerle PBS 4.5 L&#39;lik bir hacme karşı 6 x 50 mL yem için süpernatan elde edilir olduğunu bulduk. Yetersiz diyaliz yem normalleşme adımı sırasında düşük dilüsyonlarda proteinlerine bağlanma inhibisyon tarafından görülebilir (Şekil 3A). <ol start="2"><li> Yem proteinleri ifade edildiği azından göreceli seviyelerini belirlemek için bir ELISA gerçekleştirmek. Biyotinile yem protein dilüsyon serisi hazırlayın ve bir streptavidin kaplı mikrotitre tabağa yakalamak. Bir monoklonal antikor (OX68) kullanarak yakalanan yem proteinleri tespit etmek ve ölçmek sıçan Cd4d3 +4 etiketi kullanın. Tüm biot doyurmak için gereken minimum miktarı yem proteinleri konsantre veya seyreltikBir streptavidin kaplı levhanın hem de birleştirici yerlerde. </li><li> Fosfat içeren bir streptavidin kaplı plaka kuyuları bloke saline/0.1% Tween-20 (PBST) /% 2 sığır için albumini (BSA) serum 15 dakika tamponlu. </li><li> Ayrı bir plakası, bir streptavidin kaplı plaka PBST /% 2 BSA ile kuyucuklara transfer yem proteinlerin bir inceltme serilerini göstermektedir (01:03, dört dilüsyonları genellikle yeterlidir) edin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> PBST 3x yıkayın. 2 ug / mL, oda sıcaklığında 1 saat boyunca fare anti-sıçan Cd4d3 4 IgG (OX68) inkübe 100 ul ekleyin. </li><li> PBST 3x yıkayın. PBST /% 2 BSA ile 1:5,000 seyreltide anti-fare alkalin fosfataz 100 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. </li><li> PBST 3x yıkayın ve kalan deterjan kaldırmak için PBS içinde son bir yıkama gerçekleştirin. 1 mg / dietanolamin tamponu (% 10 dietanolamin (v / v), 0.5mM MgCl2, 10 mM NaH3, pH9.8, 4 ışıktan korunan saklandığında, 104 mL Substrat 100 ul ekleme° C). </li><li> Bir saat sonra, 405 nm&#39;de absorbans ölçümü. Temsilci yem normalizasyon sonuçlar Şekil 3A &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Bir streptavidin kaplı plakanın her biyotin-bağlama bölgeleri doygun hale getirmek için yeterli olan seviyelerde ifade edilir yem proteinleri, seyreltilmemiş halde kullanıldığı zaman, Vivaspin yoğunlaştırıcılar (Vivascience, 10kDa MWCO) kullanılarak konsantre edilmelidir. Bir rehber olarak, tipik bir yem proteini (~ 80 kDa) ile ~ 5 mikrogram bir 96 plaka doyurmak için yeterli olduğunu tahmin ediyoruz. <ol><li> Yüksek seviyelerde ifade edilen proteinleri yem streptavidin kaplı plakası doygun hale getirmek için yeterli bir konsantrasyona PBST /% 2 BSA ile seyreltilir edilebilir. Yemler aktivitesi bunlar streptavidin kaplı levha bütün biyotin bağlanma yerleri doyurmak sağlamak için seyreltme veya konsantrasyonu sonra rechecked edilmelidir. </li></ol></li></ol> 3.2 Prey normalleşme <ol><li> Β-laktamaz kullanılarak av proteinleri ifade edildiği azından göreceli düzeylerini ölçmekenzim aktivitesi. </li><li> İlk olarak, PBST av protein /% 2 BSA ihtiva eden tampon süpernatan bir seyreltme dizi yapmak. Daha sonra, bir 242 uM (0.125 mg / mL) nitrosefin çözeltisi (Calbiochem), 60 uL için seyreltmeleri 20 uL ekleyebilir. </li><li> Derhal oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 485 nm dakikada bir absorbans ölçümü alır, bir mikrotitre plakası okuyucuya aktarma plakası. Temsilci av normalizasyon sonuçlar Şekil 3b&#39;de gösterilmektedir. </li><li> Santrifüj konsantratörü örnekleri kullanılarak Konsantre veya nitrosefin arasında ~ 2 nmol dk -1 cirosunun bir eşik aktivite ulaşmak için bunları PBST /% 2 BSA ile sulandırın. Tüm nitrosefin ~ 7 dakika içinde hidrolize edilir, uygulamada, bu elde edilir. </li></ol> 4. AVEXIS Eleme Usulü <ol><li> PBST bir streptavidin kaplı plaka yıkayın. </li><li> Her bir kuyuya PBST / 2% BSA 100 mcL ekleyin ve her zamanda içinde herhangi bir sahte proteinlerine bağlanma siteleri engellemek için 30 dakika inkübe edin. </li&gt; </ol> [İpucu: yıkama adım sonra herhangi bir kalıntı yıkama tamponu çıkarmak için, plaka tiplenmeden - şiddetle - kağıt havlu üzerine] <ol start="3"><li> Bir lavabo üzerinde plaka akıllı hareketiyle engelleme çözümü çıkartın ve uygun kuyulara 100 uL normalize biyotinile monomerik yem ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Plaka upturning ve akıllıca bir lavabo üzerine hafifçe vurarak plakadan yem örnekleri çıkarın ve PBST 3 kez yıkayın. </li><li> Normalize pentamerized yırtıcı 100 uL, her sıra için yapı ve 1 saat için oda sıcaklığında inkübe edilir, aşama 4,4 olarak yıkanması ve sadece PBS ile bir son yıkama gerçekleştirmek ekleyin. </li><li> 242 uM nitrosefin çözeltisi (500 uL DMSO içinde nitrosefin 5 mg çözülür, daha plakalara eklemeden önce filtre 0.22 uM ile 40 ml PBS içinde nitrosefin seyreltilmiş ve iyice geçmesi ve sonra karıştırarak), 60 uL ekleyin ve oda sıcaklığında inkübe . Olumlu etkileşimler görülebiliryılından bu yana gözle sarı nitrosefin kırmızı bir renk hidrolize olur. Bir plaka okuyucu kullanarak 485 nm&#39;de absorbans okuyarak ölçmek. Tipik bir plaka ve kantitatif Şek. 4. </li></ol> [Tip: plakaların tüm muhtemel etkileşimler tespit edilir sağlamak için 16 saat süreyle 4 ° C &#39;de yer almalıdır halde Pozitif etkileşimler, genellikle oda sıcaklığında 2 saat içinde gözlenmiştir. Biz de bu çizikler / parmak izi gibi mikrotitre plaka plastik üzerine çöken nitrosefin ve kusurları bazen hiçbir belirgin nitrosefin hidrolizi rağmen 485 nm artefactual yanlış pozitif yol bulduk. Bu görsel kuyularda nitrosefin ciro kayıt plakaların fotoğrafını çekmek için bu nedenle tavsiye edilir.] 5.. Temsilcisi Sonuçlar Bir temsili AVEXIS eleme plakası bir örneği, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. Bir de nitrosefin substrat hidroliz (kırmızı sarı) dikkat etmem gerekiryaklaşık on dakika içinde pozitif kontrol kuyuları (antikor-aracılı avını yakalama kontrolü ve aynı zamanda pozitif kontrol etkileşim hem de). Ekran içinde bazı etkileşimler de bu zaman dilimi içinde görülür, ama diğerleri daha uzun sürebilir (birkaç saat) görünür. Tipik olarak, yaklaşık% 0.4-0.6 (taranan her 150-250 etkileşim için olumlu bir etkileşim) bir isabet oranı taranan protein kütüphaneleri bağlı olarak tipiktir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig1.jpg" /> Şekil 1.. AVEXIS kullanılarak cep tanıma işlemlerine aracılık eden reseptör-ligand etkileşimlerinin belirlenmesi. Şematik membran-gömülü reseptör proteinler arasında yapılan etkileşimleri üzerinden bilgi alışverişi iki etkileşim hücreleri (A ve B) gösterir. AVEXIS özellikle çok zayıf bir etkileşim kuvvetleri ile karakterize edilir yeni reseptör-ligand çiftleri tanımlamak için tasarlanmış bir ölçülebilir proteininin etkileşime tahlil oluşturmaktadır. Böylece RekombinantHer iki hücre hücre yüzey reseptör repertuarının tamamını ectodomain temsil luble protein kütüphaneleri (hücre tipi A) veya monomerik biyotin etiketli yemler (hücre tipi B) pentamerik β-laktamaz etiketli kurbanlarına olarak ya derlenmektedir. Avların pentamerisation bile çok geçici etkileşimler tespit edilebilir, böylece genel bir avidite kazancı etki etmek için ectodomains yerel konsantrasyonunu artırır. Yem kütüphane streptavidin kaplı plakalar üzerine dizilmiş ve sistematik av proteinleri ile etkileşimleri nedeniyle tahkikat edilir. Kısa bir yıkamadan sonra, herhangi bir yakalanan beslenmez av ile ilişkili β-laktamaz aktivitesi kullanılarak tespit edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig2.jpg" /> Şekil 2. Yem ve yem yapı tasarımı. (A) Sıçanlarda Cd200 reseptör protein hücre yüzeyi reseptör proteinler tamamını ectodomains tespit edilir ve primerler yem hem yapmak için tasarlanmış bir örnek olarak verilmiştirve yırtıcı ifade yapıları. CDNA ve çevrilmiş protein sekansı N-terminal sinyal peptidi ile sıçan Cd200 bir membran-kapsayan transmembran bölgeyi gösterilmiştir. Bir duyu primeri Cd200 cDNA sekansı için tam bir eşleşme dizisinin 25 bazlar takip eden bir 5 &#39;Notl kısıtlama enzimi sitesi ve optimal Kozak sekansı dahil etmek için tasarlanmıştır. Antisense astar bir Asci sitesi ve hemen yukarı seçilen ectodomain kesme kalıntı bulunan tam eşleşme dizisinin 25. üsleri içerir. Rat Cd4d3 +4 etiketi ile çerçeve içinde ectodomain tutmak için, Asci sitesi Gly-Ala-Pro olarak tercüme edilmelidir. (B) yem ve yırtıcı ifade yapıları şematik gösterimleri. Her Notl ve Asci siteleri ve Cd4d3 +4 etiketi ile çevrili reseptör ectodomains içerir. Yemler, özellikle bir plazmid bir salgılanmış Bira enzimi ile ifade kotransfeksiyonu ile monobiotinylated edilebilir bir C-terminali peptid sekansı içerirler. Kurbanlarına pentamerisation sırası tarafından takip edilmektedirkıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) ve β-laktamaz enzim. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig3.jpg" /> Şekil 3. Yem ve yırtıcı proteinlerin Normalisation. Yem normalleşme (A) Temsilcisi örnekler. Dört farklı diyaliz yem süpernatan bir inceltilmiş serileri bir anti-CD4 monoklonal antikoru etiketi kullanılarak ELISA ile tespit edildi. Dört yemler farklı düzeylerde 1&gt; 2&gt; 3&gt; 4 de ifade edilir. Yemler, her sıra içinde biyotin bağlanma yerleri doldurur bir eşik seviyesi normalize edilmesi gerekir. Yüksek-ifade yemler proteini muhafaza etmek için seyreltilmiş olabilir (örneğin yem 1 ~ 1:100 seyreltilmiş olabilir), ve kötü ifade yemler yoğunlaştı. Düşük dilüsyonlarda Azalmış okumalar bazen eksik diyaliz nedeniyle indirekt D-biotin varlığı atfedilebilecek bazı yemler (örneğin yem 2) gözlenir. (B) proteinler avlayan hangi seviyeleri eski vardırpreslenmiş bir β-laktamaz substrat, nitrosefin ile hidroliz hızı kullanarak ölçülür. Gösterilen örnekte, üç kurbanlarına farklı seviyelerde ifade edilir: av 1&gt; 2&gt; 3. Preys (örn. av 1) ~ 7 dakika içinde 14.5 nmol nitrosefin hidroliz tamamlamak için karşılık gelen ~ 2 nmol dak -1, bir aktivite normalize edilmesi gerekir. Bu örnekte, diğer kurbanlarına taramasında kullanımdan önce konsantre edilmelidir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig4.jpg" /> Şekil 4. Temsilcisi AVEXIS tarama sonuçları. (A) temsili bir AVEXIS eleme plakasının bir fotoğraftır. Bir av proteini 41 farklı yemler karşı probed ve olumlu bir etkileşim sıra E2 tespit edilir. Tarama plakalarda kullanılan kontroller şunlardır: Cd200R ile (yem)-Cd200R (av) eşik dilusyondaki kullanılan Kayalıklarında yırtıcı sıçan Cd200: bütün av protein yakalamak için bir biyotinile anti-CD4 antikoru iyi (G6), bir kontrol etkileşim eklendi (H3), 1:10 (H4) ve 1:100 (H5). Negatif kontroller vardı: Bir Cd4d3 +4 yem av protein (H1) taranan ile probed ve Cd200R avını (H2). (B) üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir, aynı ekranın absorbans değerleri Kantitasyonu. Veri noktaları ortalama ± SD vardır.

<ol>
	<li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+human+membrane+proteome.">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome research. 18, 622-622 (2008).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, e9-e9 (2002).</li><li>Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Prediction+of+Signal+Peptides:+SignalP+3.0.">Improved Prediction of Signal Peptides: SignalP 3.0.</a> Journal of molecular biology. 340, 783-783 (2004).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> Journal of molecular biology. 305, 567-567 (2001).</li><li>Brown, M. H., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunoglobulin+and+scavenger+receptor+superfamily+domains+as+chimeric+proteins+with+domains+3+and+4+of+CD4+for+ligand+analysis.">Expression of immunoglobulin and scavenger receptor superfamily domains as chimeric proteins with domains 3 and 4 of CD4 for ligand analysis.</a> Protein engineering. 7, 515-515 (1994).</li><li>Wright, G. J., Puklavec, M. J., Willis, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid/neuronal+cell+surface+OX2+glycoprotein+recognizes+a+novel+receptor+on+macrophages+implicated+in+the+control+of+their+function.">Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes a novel receptor on macrophages implicated in the control of their function.</a> Immunity. 13, 233-23 (2000).</li><li>Dustin, M. L., Golan, D. E., Zhu, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+affinity+interaction+of+human+or+rat+T+cell+adhesion+molecule+CD2+with+its+ligand+aligns+adhering+membranes+to+achieve+high+physiological+affinity.">Low affinity interaction of human or rat T cell adhesion molecule CD2 with its ligand aligns adhering membranes to achieve high physiological affinity.</a> The Journal of biological chemistry. 272, (1997).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society transactions. 38, (2010).</li><li>de Wildt, R. M., Tomlinson, I. M., Ong, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+receptor-ligand+pairs+by+capture+of+long-lived+multivalent+interaction+complexes.">Isolation of receptor-ligand pairs by capture of long-lived multivalent interaction complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (2002).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129, 55-55 (2010).</li><li>Urech, D. M., Lichtlen, P., Barberis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+selection+system+to+detect+extracellular+and+transmembrane+protein+interactions.">Cell growth selection system to detect extracellular and transmembrane protein interactions.</a> Biochimica et biophysica acta. 1622, 117-117 (2003).</li><li>Voulgaraki, D., Mitnacht-Kraus, R., Letarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115, 337-337 (2005).</li><li>Wojtowicz, W. M., Wu, W., Andre, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vast+repertoire+of+Dscam+binding+specificities+arises+from+modular+interactions+of+variable+Ig+domains.">A vast repertoire of Dscam binding specificities arises from modular interactions of variable Ig domains.</a> Cell. 130, 1134-1134 (2007).</li><li>Martin, S., Sollner, C., Charoensawan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+Large+Extracellular+Protein+Interaction+Network+and+Its+Resolution+by+Spatiotemporal+Expression+Profiling.">Construction of a Large Extracellular Protein Interaction Network and Its Resolution by Spatiotemporal Expression Profiling.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 2654-2654 (2010).</li><li>Crosnier, C., Bustamante, L. Y., Bartholdson, S. J., Bei, A. K., Theron, M., Uchikawa, M., Mboup, S., Ndir, O., Kwiatkowski, D. P., Duraisingh, M. T., Rayner, J. C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum.">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480, 534-537 (2011).</li><li>Sollner, C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+surface+interaction+network+of+neural+leucine-rich+repeat+receptors.">A cell surface interaction network of neural leucine-rich repeat receptors.</a> Genome biology. 10, R99-R99 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Canlı hücreler in vivo olarak incelenirse, bunların plazma membranları son derece dinamik davranışları sergilerler: onlar ulaşın ve komşularıyla 2 ile iletişim olarak uzanan ve kesintili olarak membran prosesleri. Bu temasların birçok arabuluculuk membran-gömülü reseptör proteinler arasındaki fiziksel etkileşim bu son derece hareketli davranış izin verecek şekilde son derece zayıf olduğu için evrim geçirmiştir. Bu 50 uM olarak zayıf gibi monomerik etkileşimi son derece güçlü 2,10 meydan roman etkileşimleri tespit yapar fizyolojik reseptör yoğunlukları 9 spontan etkileşimleri sürmek için yeterli olabileceği tahmin edilmiştir. Düşük yalancı pozitiflik oranı ile ölçeklenebilir bir şekilde uygulanabilir protein etkileşimleri: Burada anlatılan AVEXIS yöntemi geçici ekstraselüler proteini tespit için hassas bir yöntem sağlar. Diğer yöntemler ölçülebilir, hücre dışı etkileşimler 11-15 algılamak için geliştirilmiştir ikenAVEXIS bir avantaj gibi yem ve av faaliyetleri gibi deneysel parametrelerin düşük yalancı pozitiflik oranı 3 korurken bile (t 1/2 ≤ 0,1 s) etkileşimlerin zayıf algılamak için sayısal edilmiş olmasıdır. Buna ek olarak, akıcı ve sağlam numune hazırlama usul diğer testlere göre çok daha büyük ölçekte uygulanacak bu testte sağladı ve biz son ~ 16,500 potansiyel etkileşimleri üzerinde 16 toplam sistematik bir etkileşim ekranı tarif var. Tahlil, bir çözünür rekombinant protein parçası ifade etmek mümkün olduğu için herhangi bir proteini üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu nedenle bu tip I, GPI-bağlantılıdır ve salgılanan proteinler gibi bir N-terminal sinyal peptit içeren protein içerir. Yakın zamanda şimdi bize yemler 17 olarak tip II proteinleri ifade edebilecekleri vektörler bir paketi tasarladık. Deneyi, genellikle bu tür iyon taşıyıcı olarak multipass zar proteinleri için uygun değildirs ya da doğru bir plazma zarı bağlamı dışında katlanmış olması olası değildir beri pompalar. Biz zebrabalıkları 3,16,18, insan, fare ve P. hücre dışı proteinler farklı bir sistem çeşitliliği için bu başvurmuş ve başarıyla ifade ettiler etkileşim ekranlar için falciparum. Bir AVEXIS ekran kurmak için gerekli kaynakları açısından, biz önemli bir darboğaz seçimi, inşaat, ve ifade plazmid dolu sıralama olduğunu bulduk. Yöntemi bu yönü ~ 100 yem ve yırtıcı yapılar yapmak için bir yıl kadar sürebilir, ancak, gen sentezi azalan maliyet, şimdi projenin bu yönü dış kaynak ticari lehine. Büyük bir titreme doku kültürü inkübatör (biz bir INFORS HT Multitron Hücre kullanın) ile birlikte memeli ekspresyon sistemi ifade ve ~ 100 yem ve yırtıcı proteinleri bir ay kadar normalleştirmek için tek bir araştırmacı sağlar. Proteinler üretilen ve s, normalize edilir kezetkileşimleri için creening rahatlıkla günlük işlenen on iki kadar 96-plakaları ile hızlıdır. Bu tür proteinleri çok sayıda üretimi kolaylaştırmak için geliştirilmiş ki yalnızca ısmarlama ekipmanı paralel bir 0.22μm filtre ile beş süpernatanlar kadar geçmesi için kullanılan bir sıkıştırılmış hava tazyikli bir piston. Bu etkileşimlerin bazıları 3 tespit edilebilir ancak literatürde (yanlış negatif) beklenen etkileşimleri göre cevapsız olabilir etkileşimlerin ana sınıfı, homophilic etkileşimleri vardır. Beklenen etkileşimleri tespit edilmez durumlarda, bu daha sonra immobilize yem proteinleri ile daha fazla etkileşim engeller av proteinler (bir av &quot;maskeleme&quot; etkisi) tarafından homophilic etkileşimlerin oluşumundan dolayı olduğuna inanıyorum. Etkileşimler tespit edilir frekansı taranan proteini kütüphanesinin içeriği bağlıdır. Okuyucu için bir rehber,&gt; 30 bir ekran olarak, Zebrabalıkları immünglobülin süper ailesi içinde 000 etkileşimleri 188 pozitif sonuçlandı -% 0.6 3,16,18 bir frekans. Herhangi bir olumlu hit doğrulamak için yapılabilir çok çabuk kontrol etkileşimi yem-av yönelimleri hem de tespit edilebilir olup olmadığını belirlemek için;, aynı etkileşimi bir yem ya olarak bağlayıcı proteinlerin mevcut olup olmadığına bakılmaksızın tespit edilebilir olduğunu ya da bir av. Bu davranış gözlemledik ileri geri çalışma zaman, bağlayıcı sonradan yüzeysel plasmon rezonans kullanılarak saflaştınlmış protein bağlayıcı doğrudan doyabilen göstererek spesifik olarak gösterilmiştir. Bizim yapay yem proteinleri pentamerising tarafından bağlanma isteğini artırmak, çünkü biz nicelik etkileşim gücünü karşılaştırmak için uygun tahlil düşünmüyoruz olduğu vurgulanmalıdır. Biz monomerik proteinler ve yüzey plazmon rezonans kullanmak etkileşimlerin biyofiziksel bağlama parametrelerini elde etmek. Son olarak, bir kez bir etkileşim tespit edilmiştir, hitestin gh throughput doğası, antikorlar veya etkileşimi engellemek küçük moleküller gibi reaktifler için ekrana test uyum nispeten kolay hale getirir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Cat. Numara </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Freestyle medya </td><td> Invitrogen </td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrosefin </td><td> Calbiochem </td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SA kaplı mikrotitre plakalar </td><td> Nunc </td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68 antikoru </td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td> Diyaliz boru </td><td> Delmek </td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td> Polimiksin B </td><td> Sigma </td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-biotin </td><td> Sigma </td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td> Yüzey-104 </td><td> Sigma </td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20 santrifüj konsantratörü </td><td> Sartorius </td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um filtreler </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

avidity-based extracellular interaction screening (avexis) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions

Hücre dışı protein: salgılanan veya membran-gergin proteinler arasındaki protein etkileşimleri Çok hücreli organizmalarda hem de hücreler arası iletişimi başlatma ve uyum sağlamak için önemlidir. Proteinler hücre dışı etkileşimlerin insan genlerinin 1 yaklaşık dörtte bir oranında kodlanmış oluşturmak için tahmin edilen, ancak önemi ve bolluğuna rağmen, bu proteinlerin çoğunluğu hiçbir bağlayıcı ortağı belgelenmiştir. Öncelikle, bu onların biyokimyasal inatçılığı nedeniyle: membran-gömülü proteinler kendi doğal yapısındaki çözünebilmesi zordur ve yapısal-posttranslasyonel önemli değişiklikler içerir. Ayrıca, reseptör proteinler arasındaki etkileşimi akrabalıklar genellikle çok sık kullanılan, yüksek verimlilik yöntemleri 2 ile tespit engelleyen son derece düşük etkileşimi güçlü (yarılanma ömrü &lt;1 saniye) ile karakterizedir. Burada, AVEXIS (avidite tabanlı ekstraselüler, bir deneyi tarifdüşük yalancı pozitiflik oranı 3 ile çok zayıf protein etkileşimleri (t 1/2 ≤ 0.1 sn) tespiti sağlayan bu teknik zorlukların üstesinden lar Etkileşimi Ekran). Assay genellikle uygun bir mikrotitre plakası biçiminde etkileşimler (Şekil 1) binlerce sistematik tarama sağlamak için yüksek bir verim biçimde uygulanmaktadır. Bu etkileşimler için taranması için, içinde hücre yüzey reseptörü veya salgılanan proteinlerin ectodomain parçaları içeren çözünür rekombinant protein üretime kütüphaneleri dayanır, bu nedenle, bu yaklaşım tipi için uygun olan I, tip II, GPI-bağlı hücre yüzey reseptörleri ve salgılanmış proteinler değil, iyon kanalları ya da taşıyıcı olarak multipass membran proteinleri için. Rekombinant protein kütüphaneler gibi glycosyla gibi önemli posttranslasyonel değişiklikler sağlamak için, uygun ve yüksek seviyeli memeli ifade sistem 4 kullanılarak üretilmektedirTION ve disülfit bağları eklenir. Taraması için uygun bir streptavidin kaplı bir katı faz üzerinde yakalandı edilebilir bir biyotinile yem, ve bir pentamerised enzim-etiketli (β-laktamaz) av: ifade edilen rekombinant proteinlerin, orta ve iki formda üretilen salgılanmaktadır. Yem ve av proteinleri geleneksel bir ELISA (Şekil 1) &#39;e benzer bunlar arasında doğrudan etkileşimler, tespit etmek için bir ikili şekilde birbirine sunulmaktadır. Av in proteinlerin pentamerisation kıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) bir peptid sekansı ile gerçekleştirilir ve böylece daha çok geçici etkileşimler tespit edilebilir sağlamak için önemli bir avidite kazancı sağlanması ectodomains lokal konsantrasyonunu artırır. Yem ve tarama öncesinde önceden belirlenen seviyelere av hem de faaliyetlerini normalleştiren, biz 0.1 sn monomerik yarı ömrü olan etkileşimleri düşük yanlış pozitif oranları 3 ile tespit edilebilir olduğunu göstermiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS hücresel tanıma süreçlerinde roman dışı reseptör-ligand çiftleri için sistematik ekran için geliştirilmiş bir yüksek verimlilik protein etkileşim testtir. Bu özellikle diğer yüksek verimlilik yaklaşımları kullanarak tespit etmek zordur geçici protein etkileşimleri tespit etmek için tasarlanmıştır.

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

avidity-based-extracellular-interaction-screening-avexis-for-scalable

Research

JoVE Journal

Biology

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

21.5K Görüntüleme.  Wellcome Trust Sanger Institute. AVEXIS hücresel tanıma süreçlerinde roman dışı reseptör-ligand çiftleri için sistematik ekran için geliştirilmiş bir yüksek verimlilik protein etkileşim testtir. Bu özellikle diğer yüksek verimlilik yaklaşımları kullanarak tespit etmek zordur geçici protein etkileşimleri tespit etmek için tasarlanmıştır.

Video: Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Biyoloji

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native receptor and the ligand are challenging since the ligand of a specific receptor may be unknown and experimental procedures with the native ligand can be technically complicated. To address these obstacles, we describe a reporter system to detect the binding and activation of a specific receptor by a ligand of interest. In this reporter system, the extracellular domain of a specific receptor is conjugated to mouse CD3&#950; and this chimeric protein is then expressed in mouse BW cells. These transfected BW cells can then be incubated with different targets (e.g., cells or antibodies). Activation of a transfected receptor leads to the secretion of mouse interleukin-2 (mIL-2) which can be detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This reporter system has the advantages of being sensitive and specific to a single receptor. In addition, the activation level of a specific receptor can easily be quantified and can be used even in cases where the ligand of the receptor is unknown. This system has been implemented successfully in many of our studies to characterize receptor-ligand interactions. We have recently employed this system to study the activation of human Fc&#947; receptors (Fc&#947;Rs) by different monoclonal anti-CD20 antibodies in clinical use.

This protocol describes how to establish a reporter system that can be used to identify and quantify receptor-ligand interactions.

Reseptör-Ligand etkileşimleri çalışmak için bir BW muhabir sistemi

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular communication in various research fields; cancer biology, neuroscience, and drug delivery. Many EV uptake assays have been reported in the literature; however, there is a lack of practical, detailed experimental methodology. EV uptake can be assessed by fluorescently labeling EVs to detect their location within cells. Distinguishing between internalized EVs in cells and the superficial EVs on cells is difficult, yet critical, to accurately determine the EV uptake. Therefore, an assay that efficiently quantifies EV uptake through three-dimensional (3D) fluorescence confocal microscopy is proposed in this work. Fluorescently labeled EVs were prepared using a nano-filtration-based microfluidic device, visualized by 3D confocal microscopy, and then analyzed through advanced image-processing software. The protocol provides a robust methodology for analyzing EVs on a cellular level and a practical approach for efficient analysis.

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular vesicles (EVs) contribute to cellular biology and intercellular communications. There is a need for practical assays to visualize and quantify EVs uptake by the cells. The current protocol proposes the EV uptake assay by utilizing three-dimensional fluorescence imaging via confocal microscopy, following EV isolation by a nano-filtration-based microfluidic device.

Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Veziklin Alımı Analizi

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Methods Article

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)