Biz Division genom bilim ve laboratuvar üyeleri teşekkür sistemleri Biyoloji ve tıp, RCAST, Tokyo Üniversitesi için. Biz özellikle teşekkür Dr H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, Tokyo Üniversitesi), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida ve Dr. A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co, Ltd) yararlı tartışmalar ve destek. Bu eser kısmen için genç bilim adamı (A) (26710005, T.O.), yenilikçi alanları (26116711 ve 16 H 01567, T.O.) bilimsel araştırma için Grant-in-Aid ve Grant-in-Aid için zorlu Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir Araştırmacı araştırma (16K 14605, T.O.) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya, Takeda Bilim Vakfı (to), kanser araştırmaları (to) Kobayashi temeli ve kanser araştırmaları için proje ve Terapötik evrim (P-oluşturma) ve yenilikçi kanserle savaş Japonya ajansı tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED (to) için pratik araştırma.

1. asidik kültür orta hazırlanması
<ol><li>
Denetim (pH 7,4) hazırlanması ve düşük-pH (pH 6.8) kültür orta
	<ol>
<li>4.75 g L-glutamin olmadan DMEM tozu 500 mL su içinde çözülür.</li>
		<li>0,33 M NaHCO3 çözüm basınç sıkı bir şişe hazırlayın. Dikkat: NaHCO3 ısıtmalı ve termal olarak çürümüş CO2 gaz yayar bu yana bir basınç sıkı şişe kullanmak önemlidir.</li>
		<li>Otoklav orta ve çözüm. Bu arabellekleri 25 ° C'ye soğutmak izin</li>
		<li>200 mM L-glutamin, penisilin-streptomisin, 5 mL 5 mL ekleyin ve 50 mL fetal sığır serum DMEM 500 ml bikarbonat olmadan.</li>
		<li>Denetim (pH 7,4) orta için 0,33 M NaHCO3 çözüm DMEM 100 mL bikarbonat olmadan başına 2,4 mL ekleyin. Düşük-pH (pH 6.8) orta için 0,33 M NaHCO3 çözüm DMEM 100 mL bikarbonat olmadan başına 0.6 mL ekleyin.</li>
		<li>Altında %5, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra orta pH kontrol CO2. Not: NaHCO3 çözüm miktarı kuluçka ve hava basıncı CO2 içeriğe bağlı olarak farklı olabilir orta pH bağlı olarak ayarlanması gerekir. İdeal olarak, ilk kez, NaHCO3 çözüm için DMEM eklemek için uygun miktarını belirlemek için çeşitli bikarbonat konsantrasyonu ile orta pH ölçmek daha iyi.<ol>
<li>Hemen CO2 kuluçka kültür çanak çıkardıktan sonra kültür orta toplamak ve pH metre kullanarak pH ölçmek. Orta sıcaklık bir su banyosu kullanarak 37 ° C'de tutun. Orta pH bağımsız olarak üç kez ölçmek. Not: NaHCO3 çözüm 4 ° C'de muhafaza edilmelidir ve her ortamın taze hazırlanmalıdır. Bu çalışmada kullanılan piyasada bulunan ürünler Malzemeler tabloiçinde listelenir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laktat kaynaklı veya HCl kaynaklı asidik kültür ortamı hazırlama
	<ol>
<li>74 µL laktat çözüm veya 1 M HCL 125 µL denetim orta (1.1.5 adımda hazırlanan) 100 mL ekleyin.</li>
		<li>Altında %5, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra orta pH kontrol CO2. Not: Laktat veya HCl bir çözüm de kuluçka ve hava basınç CO2 içeriğe bağlı olarak farklı olabilir orta pH göre ayarlanması gerekir. İdeal olarak, seri laktat veya HCl konsantrasyonu için ortamın pH istenen ayarlamak için uygun miktarını belirlemek ile orta pH ölçmek iyidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hasat ve hücreleri tedavi
<ol><li>Altında %5 CO2 gerçekleştirmeden önce en az 1 hafta deneyler 37 ° C'de hücreler yetiştirilmesi başlatın. Not: Bu çalışmada kullanılan hücre hatları Malzemeler tabloiçinde listelenir.</li>
	<li>% 70-90 confluency ulaştığınızda geçiş hücreleri. Hücreleri Konfluent olmak izin vermez. Orta 2-3 günde günlük ekimi sırasında değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri 5 mL PBS ekleyerek yıkayın. PBS Aspire edin ve 1 mL tripsin gibi ayırmayı enzim ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri yuvarlanır ve ayırmak başlamak kadar 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>5 mL kültür orta de müstakil hücrelere ekleme ve enzim devre dışı bırakın. 15 mL tüp ve 300 x g. aspiratı süpernatant adlı 3 dk santrifüj hücre süspansiyon aktarmak ve kültür orta hücrelerle yeniden askıya alma.</li>
	<li>Bir hemasitometre ve Trypan-mavi kullanarak canlı hücreleri saymak.</li>
	<li>Tohum 5.0 x 105 hücreleri/iyi bir 10 cm tabak orta 10 ml. 37 ° c altında %5 24 h için hücreleri kuluçkaya CO2.</li>
	<li>Kültür orta Aspire edin, 5 mL PBS hücrelerle yıkama ve 10 mL asidik kültür orta bölüm 1'de hazırlanan ekleyin. 37 ° c altında %5 24 h için hücreleri kuluçkaya CO2.</li>
</ol>3. RNA izolasyon
<ol><li>Kültür orta Aspire edin ve hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. Hücrelerin RNA ayıklama reaktif ekleyerek bozabilir ( Malzemeleri tablolarıgörmek).</li>
	<li>Çanak kısaca kazımak, RNA ayıklama reaktif bir pipet ile kaldırın ve RNA ayıklama reaktif/hücre 1,5 mL tüp lysate mevduat. 5 min için oda sıcaklığında bırakın.</li>
	<li>250 µL kloroform ekleyin ve 5 min için oda sıcaklığında yaklaşık 15 s. bırak ve ≥8, 000 x g 5 min için santrifüj tüpü şiddetle çalkalanır.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak sulu faz dikkatli bir şekilde çıkarın. Sulu faz bırak. Başka bir 1,5 mL tüp içinde yerleştirin.</li>
	<li>Sulu faz 550 µL isopropanol ekleyin ve karışımı yavaşça. 5 dakika santrifüj (≥20, 000 x g) maksimum hızda süreyle oda sıcaklığında 4 ° C'de 20 dk için bırakın</li>
	<li>İsopropanol dökün ve 1 mL % 75 etanol DEPC su tedavi ekleyin. Hafifçe karıştırın. 8000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Etanol ve granül kurumasına izin pipet.</li>
	<li>DEPC yaklaşık µL 15-25 (verim) bağlı olarak su RNA Pelet tedavi ekleyin. İyice karıştırın.</li>
	<li>260 OD ölçerek izole RNA konsantrasyonu ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm.</li>
</ol>4. cDNA sentezi
<ol><li>PCR reaksiyon tüp içinde aşağıdaki parçaları birleştirmek: 5 µg toplam RNA, 1 µL Oligo dT (50 µM) veya astar karışımlarda (60 µM), 1 µL 10 mM dNTP ve 14 µL toplam hacmiyle nükleaz ücretsiz su.</li>
	<li>Mix ve kısaca bir küçük benchtop santrifüj kullanarak bileşenlerini santrifüj kapasitesi (~ 5 s). 65 ° C'de 5 min için örnek RNA/astar denatüre Kısaca spin (~ 5 s) küçük bir benchtop kullanarak santrifüj kapasitesi ve örnek derhal en az 1 dk. için buz koymak.</li>
	<li>Aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 4 µL 5 ters transkripsiyon arabellek x, 1 µL transkriptaz (200 U/µL), 1 µL RNase inhibitörü (40 U/µL). Not: Piyasada kitleri örnekleri Malzemeler tablo gösterilir
</li>
	<li>Tüp, kap mix ve kısaca belirtilen içeriğini bir küçük benchtop santrifüj santrifüj kapasitesi (~ 5 s). 10 dk 50-55 ° C kombine tepki karisimin kuluçkaya.</li>
	<li>Reaksiyon 10 dk 80 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
</ol>5. gerçek zamanlı PCR kullanarak asit duyarlı gen ekspresyonu ölçümü
<ol><li>Aşağıdaki bileşenler, 384-iyi tepki plaka birleştirmek: 1 µL şablon cDNA, 0,75 µL 10 N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine X 0.3 µL 50 µM ileri astar, 0.3 µL 50 µM ters astar, 1 µL Taq polimeraz, 2.5 µL 10 x Taq polimeraz arabellek, 2.5 µL 20 mM dNTP, 16.65 µL su. Not: Piyasada kitleri örneği Malzemeler tablogösterilmiştir. Astar listesi Tablo 1' de gösterilen. 96-iyi tepki plaka da bu adımda kullanılabilir. Diğer probları (örneğin, Taqman sonda) de kullanılabilir.</li>
	<li>Deneme ve gerçek zamanlı PCR sistemi aşağıdaki PCR programa ayarlayın: 50 ° C için 2 dk, 1 döngüsü; 10 dk, 1 döngüsü için 95 ° C; 95 ° C 15 s ve 60 ° C için 1 dakika, 40 döngüleri; 95 ° C 15 s, 1 döngüsü; 60 ° C 15 s, 1 döngüsü; 95 ° C 15 s, 1 döngüsü.</li>
	<li>Yer plaka qPCR alet. Programı başlatın. Not: pH duyarlı genlerin MSMO1Upregulation, INSIG1ve IDI1 tarafından protein düzeyleri ölçülebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

Yazar Ayano Kondo bir çalışandır, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

Burada, bir basit asidik pH kültür sistemi ve değerlendirme sürecinin açıklanan. Orta asitleştirme, Yani, düşük bikarbonat konsantrasyonu, laktat ek ve HCl ek olarak, üç yöntemlerin bileşimini pH-yanıtlama mekanizması iyice araştırmak ve hücresel yanıt diğer tümör olarak karşılaştırmak için bize etkin hipoksi veya besin açlık gibi microenvironmental koşulları.
Bu yöntem, kültür orta uygun konsantrasyonlarda bikarbonat, laktat ve HCl belirlemek için ...

Tümör microenvironment tümör ilerleme ve kanser hücre metabolizması1,2,3kritik rol oynar. Kanser hücreleri genellikle hipoksi, besin yoksunluğu ve asidik ekstrasellüler pH (pHe) gibi koşullara maruz kalır. Ancak, tümör ilerleme pHe rolü gibi kapsamlı açıklık olmuştur değil hipoksi veya besin açlık olduğu gibi. Tümör dokusunda pHe yaklaşık pH 6.84,5ulaşan asidik hale gelebilir. Asidik pH aerobik ve anaerobik glycolytic atılımı proton (H+) doğar ve laktat Proliferasyona kanser tarafından5,6hücreler.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya o asidik pHe kaynaklı Histon deasetilasyonu, yağ asidi oksidasyon ve ağır asidik ortamı7,8,9,10adaptasyon için asidik organellerin ekzositozu. Ancak, mekanizmalar aracılığıyla hangi hücre dışı asitleştirme kanser davranış ve düzenleyiciler asidik pH tümör microenvironment içinde tam olarak tespit anahtar kimliğini etkiler. Ayrıca, çeşitli raporlar bikarbonat, Tris, borular ve HEPES tampon veya laktat ve HCl belirsiz konsantrasyonları kullanarak çeşitli asidik pH medya açıklanan, ancak kararlılığını ayarlanan orta ne de kapsamlı göstermek için birkaç rapor vardır: birkaç farklı asidik kültür media7,8,9,10 karşılaştırılması
Anahtar düzenleyiciler ve kanser hücrelerinin hücre dışı asitleştirme bağlamında metabolik değişiklikler aydınlatmak için kurulan bir asidik pHe korumak için basit vitro kültür manken ve pHe kanser hücreleri11' deki rolü inceledi. Bu yöntemi kullanarak, biz tutulan 37 ° c altında %5 6,8 pHe ile asidik bir kültür orta düşük bikarbonat konsantrasyonu kültür ortamı kullanarak CO2. pH 7.4 normal olarak kullanılan ve orta kontrol. Orta pH en az 24 saat sürekli ve 72 h PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücre kültür sırasında yavaş yavaş azaldı. Gelişmiş Glikoliz sadece da laktat7,8,9proton atılımı hızlandırır çünkü aynı zamanda asidoz laktat kaynaklı yerine laktat ekleme azaltarak tarafından taklit eden bir kültür yöntemi kurdu bikarbonat konsantrasyonu. Ayrıca, HCl kaynaklı asidik pHe orta asidik pH kültür ortamına hücresel yanıt bikarbonat azaltılmış bir konsantrasyon nedeniyle değildir olasılığını dışlamak için bize izin verir. Ayrıca, 6.4-7,4 farklı bikarbonat konsantrasyonu ile pH ile çeşitli medya kullanarak, biz ölçüde hücresel yanıt pHe efektleri değerlendirebilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium&amp;ldquo;Nissui&amp;rdquo; 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td><td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>Lactic acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368702&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell lines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0432</td><td></td></tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Cell Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Hipoksi veya besin açlık gibi tümör microenvironment şartları kanser ilerlemesi ve malignite kritik rol oynarlar. Ancak, asidik ekstrasellüler pH tümör saldırganlık ve onun altında yatan mekanizma rol kapsamlı hipoksik veya besin açlık koşulları ile karşılaştırıldığında araştırılmamıştır. Buna ek olarak, asidik ekstraselüler tümör microenvironment taklit etmek için iyi tanımlanmış kültür yöntemi tam olarak bildirilmemiştir.
Burada asidik ekstrasellüler pH kullanarak bikarbonat ve artan laktat veya HCl konsantrasyonu kültür orta azaltılmış korumak için basit vitro kültür yöntemi mevcut. Orta pH en az 24 saat sürekli ve yavaş yavaş 72 kültür PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücrelerinin takip h tarafından azalmıştır. Bu çalışmada üç ayrı asidik ortam koşullarında son derece hipoksi ya da besin açlık. MSMO1, INSIG1ve IDI1 gibi upregulated pH-yanıt veren genler göre Bu genlerin upregulation asidik pH bir işareti olarak kullanılabilir. Bu basit teknikler asidik tümör microenvironment altında tümör malignite temel mekanizmaları aydınlatmak yararlıdır. Bu nedenle, hücre dışı asidik pH kültür sistemimiz hücresel asidik pH yanıt sadece kanser hücrelerinin zamanda kadar asidik diğer bozukluklar da dahil olmak üzere, Diyabetik ketoasidoz ile ilgili olarak renal tübüler hücreler gibi Primer hücre keşfi sağlar, Laktik asidoz, renal tübüler asidoz ve solunum asidozu.

Uygun bikarbonat konsantrasyonu belirlemek için DMEM aralığı 0 - 8 mM NaHCO3 (kültür orta son konsantrasyonu) hazırlanmış ve 6.4-7.4 (şekil 1) arasında değişen pH ile Kültür medya hazırlanmasında başarılı oldu. DMEM ile 8 mM NaHCO3 (pH 7,4) olarak bir denetim orta ve asidik pH ile 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) bir ortam olarak ekstrasellüler pH pH 6.8 solid tümör4,<sup class="xr...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Asidik tümör microenvironment tümör ilerlemesinde önemli rol oynar. Kanser hücreleri in vitro olarak asidik ekstrasellüler pH etkilerini değerlendirmek için basit asidik kültür sistemleri kuruldu.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

SCIENTISTS IN ACTION

14.6K Görüntüleme.  Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Asidik tümör microenvironment tümör ilerlemesinde önemli rol oynar. Kanser hücreleri in vitro olarak asidik ekstrasellüler pH etkilerini değerlendirmek için basit asidik kültür sistemleri kuruldu.

Video: Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Biyokimya

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

<meta charset="utf8"></head><body>Hücre Dışı pH'ın Gerçek Zamanlı İn vitro İzlenmesi

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

Laboratuvar ortamında Hücre dışı pH'ın gerçek zamanlı olarak izlenmesi

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

<meta charset="utf8"></head><body>DHNA ile Lactiplantibacillus plantarum'da EET'nin kronoamperometri analizi

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron acceptor. This electron acceptor can be an electrode and electrons can be delivered indirectly via a redox-active mediator molecule. Here, we present a protocol to study mediated EET in Lactiplantibacillus plantarum, a probiotic lactic acid bacterium widely used in the food industry, using a bioelectrochemical system. We detail how to assemble a three-electrode, two-chambered bioelectrochemical system and provide guidance on characterizing EET in the presence of a soluble mediator using chronoamperometry and cyclic voltammetry techniques. We use representative data from 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)-mediated EET experiments with L. plantarum to demonstrate data analysis and interpretation. The techniques described in this protocol can open new opportunities for electro-fermentation and bioelectrocatalysis. Recent applications of this electrochemical technique with L. plantarum demonstrated an acceleration of metabolic flux towards producing fermentation end-products, which are critical flavor components in food fermentation. As such, this system has the potential to be further developed to alter flavors in food production or produce valuable chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Here we present a protocol for characterizing mediated extracellular electron transfer (EET) in lactic acid bacteria using a three-electrode, two-chamber bioelectrochemical system. We illustrate this method with Lactiplantibacillus plantarum and the redox mediator 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid and provide a thorough description of the electrochemical techniques used to evaluate mediated EET.

Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its complex nature, and its diverse association with mammalian components. The goal of this protocol is to culture the gut microbiota in vitro, which allows for the study of the gut microbiota dynamics, without having to consider the contribution of the mammalian milieu. Using in vitro culturing technology, the physiological conditions of the gastro intestinal tract are simulated, including parameters such as pH, temperature, anaerobiosis, and transit time. The intestinal surface of the colon is simulated by adding mucin-coated carriers, creating a mucosal phase, and adding further dimension. The gut microbiota is introduced by inoculating with the human fecal material. Upon inoculation with this complex mixture of bacteria, specific microbes are enriched in the different longitudinal (ascending, transverse and descending colons) and transversal (luminal and mucosal) environments of the in vitro model. It is crucial to allow the system to reach a steady state, in which the community and the metabolites produced remain stable. The experimental results in this manuscript demonstrate how the inoculated gut microbiota community develops into a stable community over time. Once steady state is achieved, the system can be used to analyze bacterial interactions and community functions or to test the effects of any additives on the gut microbiota, such as food, food components, or pharmaceuticals.

Here, we present a protocol for culturing the gut microbiota of the colon in vitro, using a series of bioreactors that simulate the physiological conditions of the gastro intestinal tract.

Uygulama gelişmiş teknoloji insan Gut Microbiota Eğitim Kültür Vitro

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Biyomühendislik

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

Balık Pituitaries bir yüksek kaliteli birincil hücre kültürü hazırlanması

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Nörobilim

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in overall pH homeostasis. We describe protocols for ratiometric measurement of pH in vivo using pH-sensitive fluorophores localized to the vacuole or cytosol. Vacuolar pH is measured using BCECF, which localizes to the vacuole in yeast when introduced into cells in its acetoxymethyl ester form. Cytosolic pH is measured with a pH-sensitive GFP expressed under control of a yeast promoter, yeast pHluorin. Methods for measurement of fluorescence ratios in yeast cell suspensions in a fluorimeter are described. Through these protocols, single time point measurements of pH under different conditions or in different yeast mutants have been compared and changes in pH over time have been monitored. These methods have also been adapted to a fluorescence plate reader format for high-throughput experiments. Advantages of ratiometric pH measurements over other approaches currently in use, potential experimental problems and solutions, and prospects for future use of these techniques are also described.

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH can be measured in live yeast (S. cerevisiae) cells using ratiometric fluorescent dyes localized to specific cellular compartments. We describe procedures for measuring vacuolar pH with BCECF-AM, which localizes to the vacuole in yeast, and cytosolic pH with a cytosolic ratiometric pH-sensitive GFP (yeast pHluorin).

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi

Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü

Laboratuvar ortamında Hücre dışı pH'ın gerçek zamanlı olarak izlenmesi

Laboratuvar ortamında Hücre dışı pH'ın gerçek zamanlı olarak izlenmesi

Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Uygulama gelişmiş teknoloji insan Gut Microbiota Eğitim Kültür Vitro

Balık Pituitaries bir yüksek kaliteli birincil hücre kültürü hazırlanması

Vakuolar ve sitosolik pH Ölçümü