Yazarlar için Iowa State University Akım Sitometri Tesisi mali destek ve Dr Shawn Rigby için ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (Grant Numaraları W81XWH-09-1-0386 ve W81XWH-10-1-0806) teşekkür etmek istiyorum Onun uzman teknik yardım.

1. Akciğer Lavaj kullanarak Mouse Alveoler Makrofajlar (AMɸ) Hasat <ol><li> Böyle bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler, ve uygun göz koruması gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyiniz. </li><li> Hasat başlamadan önce tam AMɸ (cAMɸ) orta hazırlayın. Penisilin / streptomisin Dulbelcco en Modified Eagle Medium (DMEM) ile 222,25 mL (kalem / Strep) çözeltisi, β-merkaptoetanol, 250 uL (2-merkaptoetanol), ve ısı inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS) ve 25 ml 2.5 ml ilave edilir. Vakum altında 0.2 mikron gözenek büyüklüğüne şişe top filtre kullanarak cAMɸ orta Filtre-sterilize edin. </li><li> Bir euthanization odasında CO 2 boğularak sağlıklı bir fare Euthanize. Bir C57BL / 6 fare (6-8 haftalık) Proje amaçlar için kullanılmıştır, ancak bu akciğer lavaj tekniği fare herhangi suşu üzerinde gerçekleştirilebilir. Basınçlı gaz tüpleri kullanarak, ch fare vermeden önce 1 dakika için odasına gaz akışını izinodasının tamamen CO 2 ile dolu olduğundan emin olmak için sarı yanar. Fare euthanize için en az bir dakika boyunca odasında fare yerleştirin. Buna ek olarak, 1.4 &#39;te tarif edildiği gibi fare ölümü teyit etmek için bir yöntem, fiziksel olarak kalp ponksiyonu ile her fareden asıl bulbus olfaktoryusları alındı. </li><li> Arka (sırt tarafı),% 70 etanol ile sprey fare Lay, sternum bulup, karından 30 derecelik açıyla, göğüs boşluğuna 50 mm, 23 gauge iğne (1 ml şırınga bağlı) takın . Iğnenin doğru yerleştirilmesi ile, fare büyüklüğüne bağlı olarak kan 1-0,4 arasındaki mL toplamak için mümkün olacaktır. Vital bulguların kesilmesi için hayvan inceleyin. </li><li> Onun karın (ventral tarafı) yatıyor böylece laboratuarlarında Yeri fare. Çalışma ortamı sterilize etmek için% 70 etanol ile Sprey fare. Yaklaşık yarım fare omurga aşağı cilt Pinch. % 70 etanol ile sterilize edilmiştir diseksiyon makas kullanarak, deri yoluyla küçük bir kesi yapmak. &lt;/ Li&gt; <li> Kesi her iki tarafında cilt kap ve fare beyin-kaudal ekseni boyunca zıt yönlerde cilt çekme. Doğru yapıldığı zaman, cilt alttaki karkas silinecektir. </li><li> Fare boyun şimdi maruz kaslar ve bezlerin göstermelidir. Dikkatle bu doku kesme ve böylece fare gırtlak, soluk borusu, yemek borusu açığa forseps kullanarak fare öne doğru çekin. Juguler ven veya karotis arter kesme kaçının. </li><li> Trakea şimdi görünür ve çevresinde kıkırdak halkaları ile doku olarak tanımlanabilir. Hafif forseps ile trakea tutun ve yavaşça kaldırın ve sırt tarafında bulunan yemek borusu, gelen trakea ayırın. </li><li> Bir trakea ancak larinks posterior tuttuğu yerde küçük bir kesi anterior olun. Kesi yaklaşık 45 ° derecelik açıyla yapılmalıdır. Ayrıca, tamamen bu içine geri çekme önlemek olacak şekilde, trakea transect yokvücut boşluğu. </li><li> Trakea lümenine kateter eklemek için hazırlık steril PBS ile bir Tom Cat kateter takılmış 1 cc şırınga doldurun. Forseps kullanarak trakea tutun ve elinizle kontrolünü artırmak ve yavaşça trakeal kesi eklemek için yakın uç kateter tutun. Yavaşça 20 mm trakea içine kateter yerleştirin. Diğer taraftan serbest bırakarak, kateter tüpünün etrafında olan trakea boğulacak. </li><li> Kateter takılmış 1 ml şırınga yavaşça akciğerlere oda sıcaklığında, steril PBS 0.75 mL demini aldıktan sonra yavaşça PBS geri enjektöre aspire. Dışarıdan göğüs masaj yaparken bu işlemi üç kez tekrarlayın. Kateterden şırınga çıkarın ve 15 ml santrifüj tüpüne lavaj akıtın. Taze PBS 0.75 ml şırınga doldurma ve kateter için şırınga yeniden bağlamadan sonra, her bir fare için iki kez adımları 1.9 ve 1.10 tekrarlayın. Akışkan kurtarma az vo daha elde edilmesi, kısmi olabilirLume aşılamıştır. Birden fazla fareden hücreleri toplanması durumunda bütün akciğer yıkamasına yapılıncaya kadar, buz üzerinde toplanmış hücreleri ile 15 ml yerleştirilir. </li></ol> 2. Akciğer Lavaj AMɸ Hasat İşleme <ol><li> 4 azından 10 dakika için 250 ° C. x g&#39;de santrifüje akciğer lavaj </li><li> Bir biyogüvenlik kabini içinde uygun bir atık kabı içine steril tekniği, aktarmak süpernatant kullanma. Hafifçe bir test tüpü raf üstünde santrifüj tüpüne yan yatan tarafından hücre pelletini. Hücreleri yeniden süspanse etmek cAMɸ ortamın 1 ml ilave edilir. </li><li> Coulter sayacı flakonda ISOTON II Diluent 10 ml içine hücrelerin 20 uL pipetleme bir Coulter Partikül Sayıcı Z1 kullanarak hücrelerin numaralandırılamıyor. , Şişeye Zap-oglobin II Parçalayıcı reaktif, 3 ila 4 damla yavaşça çevirin 3 ila 4 kez ve daha sonra bir hücre konsantrasyonunu elde etmek için tezgahın üzerine örnek şişesine yükleyin. Görüntülemek için 2 x 10 4 bir seyreltme faktörü ile karşı programlamak emin olunmL başına hücre sayısı olarak hücre konsantrasyonunu. </li><li> CAMɸ orta kullanarak ml başına 2.5 x 10 5 hücreleri sulandırınız. </li><li> Bir 6-de doku kültürü çanağı her oyuğuna 2.5 x 10 5 hücre / mL &#39;lik 2 mL dağıtın. </li><li> Hücrelerin hem alt yapışma sağlamak için 6 saat süreyle% 5 CO2 içeren bir atmosfer 37 ° C nemlendirilmiş inkübatöründe içindeki AMɸ, inkübe kültür tabakları zenginleştirmek. Hafifçe yapışık hücreleri bozmayacak şekilde süpernatant aspire. </li><li> Yapışmaz hücreleri ve enkaz kaldırmak için steril PBS (kalsiyum ve magnezyum ücretsiz) kullanarak kuyu durulayın. Her bir kuyucuğa cAMɸ orta 2 ml ilave edilir. </li><li> Uyarıcılar ilave edilmeden önce, bir% 5 CO2 içeren bir atmosfer 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör içerisindeki bir gece boyunca inkübe hücreleri. Bu zenginleştirme adımdan sonra, hücreler, yaklaşık% 87 makrofaj belirteçler CD11b ve F4/80 (Şekil 2C) pozitiftir. </li></ol> 3. Polyanhydrid ilavesie Nanopartiküller ve Kontrol Tedaviler <ol><li> Polianhidrid anti-solvent nanoencapsulation 15 ile nanopartiküller imal. Bu süreçte, polimer metilen klorür içinde çözülmüştür (4 ° C&#39;de 25 mg / mL &#39;lik bir konsantrasyonda) ve pentan (a oranı 1:200 metilen klorür az -20 ° C: pentane) içinde çökeltilmiştir. </li><li> Sterilize doğru mikrogram miktarda ölçebilen bir denge kağıt ağırlığı kullanılarak polianhidrid nanopartiküller dışarı tartılır. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne parçacıkları ekleyin. </li><li> Buz cAMɸ yılında nanopartiküller yeniden süspanse edin. Hesaplamalar ortamın fazla 0.3 &#39;den mL Nanopartiküllerin istenen bir konsantrasyon elde etmek için, her oyuğa ilave edilir öyle yapılır. Nanopartiküller de kültüre eklenene kadar buz içinde tekrar süspanse edilir partikülleri tutmak. </li><li> Önce AMɸ kültürlere nanopartiküller ekleyerek, bir mikrotip bir tezgah üstü sonikatör kullanarak parçacıkların ses dalgalarına maruz. % 70 Etanol ve wipin püskürterek mikrotip sterilizesonikasyon steril bir Kimwipe ile g. Buz üzerine tüp tutarken 30-45 s için 10-20 jul azından sonikasyon. Makroskopik nanoparçacık süspansiyon gözlemleyin. Parçacıklar yeterince dağılmış değilse, süspansiyon nanopartiküller 30-45 sn için tekrar sonicating önce polimerin cam geçiş sıcaklığının altında olmasını sağlamak için 1-2 dakika boyunca buz üzerinde ayarlamak için olanak sağlar. Bu sonikasyon adımın hedefi yeterince 50:50 CPTEG olarak, nanopartiküller dağıtmak için olan: sulu bir ortamda maruz kaldığında CPH nanopartiküller toplam eğilimindedir. Ancak, Nanopartiküllerin bazı küçük agrega hala askıda kalabilir. </li><li> Nanopartikül süspansiyon (yeterince dağılmış) buz üzerinde tutulmalıdır ve erken yüzey erozyonu veya toplama önlemek için hemen kullanılmalıdır. </li><li> Inkübatör gelen AMɸ ve biyogüvenlik kabini yer içeren kültür kaplarına çıkarın. Medi miktarı kapalı yaklaşık 45 derecelik bir açı ve pipet de Tilt plakaum olduğu nanoparçacık süspansiyonu (it 0,3 mL geçmemelidir) eklenecektir. Orta çıkartırken yapışmış olan hücrelerin rahatsız etmeyin. </li><li> Vorteks önce uygun kuyulara eklemenin kısaca polianhidrid nanoparçacık süspansiyon. Belirli bir zamanda (s) içine nanoparçacık süspansiyonu (en fazla 0.3 &#39;den mL) miktarı Pipeti, ancak kadar Pipeti ve aşağı karıştırılması. Bu eylem kuyudan AMɸ yapışık kesebilirsiniz. Parçacıklar iyi dibe ve hücreler temas edecek. Bu rapor özetlenen çalışmaları için, Nanopartiküllerin son konsantrasyon AMɸ ile birlikte kültüre 125 ug / ml olmuştur. Sonraki kuyular ve istenilen tedavi grupları ile devam edin. Bu tür tek orta ve 200 ng / mL lipopolisakkarid (LPS) tayin kuyucuklara olarak pozitif ve negatif kontrol gruplarına içerir. </li><li> 37 ile kültür tabaklarında dönmek ° C&#39;de 48 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe atmosfer ile nemlendirilmiş. Bizim Laboratuvar kinetik çalışmalarıy bu transkripsiyon ve meydana protein sentezi için yeterli bir zaman izin olarak hücre yüzey işaretleyici ifade ve sitokin salgı hem değerlendirmek için uygun kültürü periyodu olarak 48 saat göstermiştir. Sitokinlerin büyük seviyede uzun bir kültür dönemi (yani, 72 saat) boyunca biriktikçe, ancak bu zaman noktasında hücre yüzey işaretleyici ifade değerlendirilmeden sitokin seviyesi yüksek katkısı karmakarışık hale edilebilir. Yüzey işaretleyici ifadesinde değişiklikler nanopartiküller kendileri ile uyarılması ile doğrudan ilişki olmayabilir gözlenmiştir. </li></ol> 4. Akım Sitometri kullanarak AMɸ Aktivasyon Değerlendirilmesi <ol><li> Floresans-aktive hücre ayırma (FACS) tamponu (% 0.1 sodyum azit ve% 0.1 sığır serum albümini (BSA)) içinde 0.1 M fosfat önceden nanopartiküller o ile eş-kültüre edilmiştir kaplama makrofajlar hasat etmek (pH 7.4) tamponlu tuzlu hazırlamakr uyarıcılar. </li><li> Engelleme tampon ve monoklonal antikor çözeltileri çalışma hazırlayın. Blok tampon hazırlamak için, FACS tampon içinde, sırasıyla, sıçan IgG (Sigma) ve anti-CD16/32 (eBioscience) için 1 mg / ml ve 10 ug / mL seyreltik. Üreticinin tavsiye konsantrasyonu veya kullanıcı optimize konsantrasyonu birine FACS tampon yüzey işaretleyici antikor paneli sulandırınız. Bu çalışma sunulan sonuçlar için, işaretleyici yüzey paneli MHC II, CD86, CD40 ve Cire (CD209) karşı antikorlar oluşur. Makrofaj işaretleri F4/80 ve CD11b karşı anti-fare antikorları da olumlu veri analizi sırasında makrofaj fenotipi belirlemek için panel dahildir. Kendilenmiş fare suşları genellikle kendi MHC II haplotipleri farklı olarak, MHC II moleküllerine karşı antikorlar seçerken dikkatli olunmalıdır. Seçilen antikorlar ilgi fare suşu tarafından ifade spesifik MHC antijenlerdir ile reaksiyona gerekir. </li><li> 48 nanopartiküller ile inkübasyondan h ve / veya sonrauyarıcılar, 20 dakika boyunca buz üzerinde yer hücre kültürü yemekleri. Plakalardan yapışık makrofajlar kaldırmak için hafifçe 24 cm hücre kazıyıcı ile kuyu kazıyorum. </li><li> Bir 5 mL serolojik pipet kullanılarak, yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek beş kez aşağı hücreleri ve orta yukarı ve aspire. Ayrı 5 ml polistiren tüpler içine bireysel kuyuların içeriğini Pipeti şekilde farklı deneysel tedaviler hücreleri birbirine karıştırmak değil. </li><li> Her tüpe FACS tamponu 2 ml ilave edilir. </li><li> 10 dakika süre ile 4 ° C&#39;de 250 x g&#39;de santrifüje hücrelerinin tüpler. </li><li> Durusu bir test tüpü raf üstünde tüpler yan yatan tarafından kalan sıvı içinde yüzen ve yavaşça Pastör pipetiyle hücre pelletini. </li><li> Monoklonal antikorların spesifik olmayan bağlanma önlemek için, hücreler her tüpe bloke edici tamponun 10 uL (4.2 &#39;de hazırlanan) ilave edilir. Vorteks tüpler ve 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe. </li><li> Her bir tüp ve incub seyreltilmiş monoklonal antikorlar uygun hacimde ekle15 dakika süreyle buz üzerinde karanlıkta yedi. Analiz edilecek örnekleri içeren tüpler polycromatic paneli (önceki antikorlar bileşimlerini optimize bireysel Labs yapılmalıdır) ve antikor kombinasyonu almalıdır. Ek kontrol gruplarına doğru ayrı ayrı tek renk kullanarak etiketli hücreleri karşılık etiketli değildi hücrelerin bir tüp dahil akış sitometresinde satın parametreleri, ve tazminat tüpler ayarlamak için dahil edilmelidir. Doğru akım sitometri analizi için kapıları ayarlamak için, Floresans Eksi Bir (FMO) kontrol edinimi sırasında dahil edilmelidir. FMO kontroller, kendi ilgili izotip kontrolü ile değiştirilir biri dışında panel üzerinde kullanılan tüm florokrom-konjuge antikorları ile etiketlenmiş hücreler vardır. Pozitif ve negatif popülasyonları (yani, tek başına bir pozitif kontrol uyarıcı ve orta ile tedavi edilen hücrelerin bölüntülerin ayrılması) da, FMO ve kompanzasyon kontrolü tüpler dahil edilmelidir. </li><li&gt; 10 dakika süre ile 4 250 x g hızında her bir tüp, girdap ve santrifüj ° C ila FACS tamponu 2 ml ilave edilir. </li><li> Bir test tüpünün raf üstünde tüpler yan yatan tarafından rezidüel sıvı Durusu süpernatan ve Pastör pipetiyle hücre pelletini. </li><li> Antikor paneli, bir florokrom doğrudan konjuge olmayan bir antikor oluşur ancak biyotin yerine konjuge olup, bir florokrom-konjuge streptavidin yüzey görsel işaretleyici için gereklidir. Bu adımda, seyreltilmiş florokrom-konjuge streptavidin uygun bir hacmi ekleyin ve buz üzerinde 15 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. 4.2 &#39;de olduğu gibi, streptavidin Üretici tarafından tavsiye bir konsantrasyona ya da kullanıcı tarafından optimize edilmiş bir ila seyreltilmiş edilecektir. Bu adım sadece biyotinile primer antikorları içeren paneller için gereklidir. </li><li> 4,10 olarak tanımlanan bir yıkama adımı gerçekleştirmek. </li><li> BD deiyonize su içinde sabitleştirici 01:03 stabilize uygun bir hacim sulandırınız. Her tüpe seyreltilmiş sabitleştirici 100 uL ekle hafifçe vo sürehücrelerinin topaklanma önlemek için rtexing. Etiketli ve sabit hücrelerin stabil ° C Akış sitometresiyle satın alınmadan önce yaklaşık bir hafta boyunca 4 karanlıkta saklanabilir. </li></ol> 5.. Temsilcisi Veri Adım 3.1 &#39;fabrikasyon Nanopartiküller 163 ortalama çapı ± 24 nm ve daha önceki çalışmalarda elde edilen 5,16 ile tutarlı bir morfoloji vardı. Önceden sonikasyon ile ve sonra çözelti içinde Nanopartiküller partiküllerin sağlanması için yeterli bir dağılma sonication için ihtiyaç gösteren Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Akciğer lavaj yoluyla elde edilen hasat AMɸs akış sitometrik analizi Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Anti-fare CD11b ve anti-fare antikoru F4/80 yanı sıra, karşılık gelen kontrol FMO bir kombinasyonu ile etiketlenmesi hücreleri daha fazla analiz için AMɸs ve perdeleme tanımlanması, arka etiketleme olanak sağlamaktadır. Polianhidrid alveolar makrofajların TedavisiMHC II, CD40, CD86, ve Cire (Şekil 3) arasında yüksek ortalama floresans yoğunluğunu tarafından gösterildiği gibi nanopartiküller aktivasyon arttırır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Şekil 1 50:50 CPTEG: CPH önce (A) ve sonication (B) 30 sn sonra nanopartiküller. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> Şekil 2. Flow sitometrik (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b ve PE-Cy7 FMO Kontrol, (B) Alexa Fluor 700 FMO Kontrol ve PE-Cy7 anti-F4/80 etiketli hasat alveoler makrofajların analizi ve (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b ve PE-Cy7 anti-F4/80. Sağ üst köşedeki sayısı çift pozitif hücrelerin yüzdesini temsil eder. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> Şekil 3. Histogramlar floresans kütüphane olduğu söylenebilir bir artış gösteren50:50 CPTEG ile makrofaj eş-kültürden sonra MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) ve Cire (D) yüzey ifade sity: CPH polianhidrid 48 saat boyunca nanoparçacıklar. Histogramlar FMO kontrol olarak etiketlenmiş AMɸ sonuçları (tasvir <img alt="Grafik Satır 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), Tedavi edilmemiş AMɸ tüm hücre yüzey belirteçleri karşı antikorlar ile işaretli ( <img alt="Grafik Satır 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) Ve AMɸ nanopartiküller ile kültüre ve tüm hücre yüzey belirteçleri karşı antikorlar ile işaretli ( <img alt="Grafik Satır 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

<ol>
	<li>Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+biomaterials.">Immunomodulatory biomaterials.</a> Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).</li><li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms.">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li><li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres.">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).</li><li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release.">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li><li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+Protective+Single-Dose+Intranasal+Nanoparticle-Based+Vaccine+Platform+for+Respiratory+Infectious+Diseases.">Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases.</a> PLoS ONE. 6, e17642 (2011).</li><li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells.">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li><li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants.">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li><li>Torres, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation.">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li><li>Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+transport+pathogens+to+lung+draining+lymph+nodes.">Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes.</a> J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).</li><li>Barletta, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+compartments+in+the+mouse+lung:+Distinguishing+between+marginated,+interstitial,+and+alveolar+cells+in+response+to+injury.">Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury.</a> J. Immunol. Methods. , (2011).</li><li>Rubins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages:+wielding+the+double-edged+sword+of+inflammation.">Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).</li><li>Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Murine+Genetic+Predisposition+to+Pneumococcal+Infection+Reveals+a+Critical+Role+of+Alveolar+Macrophages+in+Maintaining+the+Sterility+of+the+Lower+Respiratory+Tract.">Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract.</a> Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).</li><li>Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+that+Phagocytose+Apoptotic+Neutrophils+Produce+Hepatocyte+Growth+Factor+during+Bacterial+Pneumonia+in+Mice.">Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres.">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles.">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li><li>Irvin, C. G., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+lung+function+in+the+mouse:+the+challenge+of+size.">Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size.</a> Respir. Res. 4, 4 (2003).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Tek doz rejimleri 5 intranazal uygulandığında polianhidrid nanoparçacık aşı platformları etkinliğini göstermiştir. Bu aşı dağıtım platformu tarafından uyarılan akciğerlerde ikamet fagositik hücre popülasyonlarının aktivasyon Ölçme potansiyel yeteneğinin değerlendirilmesi sonuçta adaptif bağışıklık yanıtları teşvik etmek için izin verir. Özellikle akciğer lavaj sıvısında makrofaj hasat ve nanopartiküllerin farklı formülasyonları ile onl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> CAM Medya </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM 2-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ml </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin 10,000 ug / ml solüsyon </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACS Tampon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum fosfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum fosfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Bovine Serum Albumin) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Azid </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Antikorlar </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms MHC II haplotip floresein izotiyosiyanat (FITC) IA / IE, klon M5/114.15.2, konjuge </td><td> eBioscience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-CD86, allophycocyanin ile konjuge klonu GL-1, (APC)-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> APC konjuge anti-fare CD40, klon 1C10, </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Biotin için konjuge anti-fare CD209, klon 5H10, </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 700 konjuge anti-fare CD11b, klon M1/70, </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Phycoerythrin ile konjuge edilmiş anti-fare F4/80, klon BM8, (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Texas kırmızı konjuge Streptavidin </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Diğer Sarf Malzemeleri ve Reaktifler </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> 70% (v / v) olarak kullanıldı </td></tr><tr><td> Sıkıştırılmış CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Şırınga </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Egemen 3 ½ &quot;Fr Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Biyogüvenlik Kabini </td><td> NUAIRE </td><td> Series 22 </td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon Makas </td><td> Balıkçı </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1X </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> Vida Kapaklı 15 ml Santrifüj Tüpleri </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Altı sıra Doku Kültürü Tabaklar Tedavi </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Plastik Boru Raflar </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre Kazıyıcı 24 cm </td><td> DYP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml Polistiren Yuvarlak Alt Tüp </td><td> Şahin </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetleyin yardım XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, ve 2 mL Pipetler </td><td> Balıkçı </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ve 10 uL micropipettors </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ve 10 uL pipet uçları </td><td> Balıkçı </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD DengeleyiciSabitleştirici </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> ISOTON II Dilüent </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II Parçalayıcı Reaktif </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter Sayaç Polistiren Flakon </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Test Tüpleri </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Ekipman </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soğutmalı Santrifüj </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Nemlendirilmiş İnkübatör CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> Model Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto Akış Sitometresi </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter Partikül Sayacı Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Mikrotip ile Sonicator Sıvı İşleme Ekipmanları </td><td> Misonix </td><td> Model No S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles

Biyobozunur nanopartiküller solunum yolu enfeksiyon hastalıklarına karşı yeni aşıların intranazal tasarlanması ve uygulanması için çok yönlü bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Spesifik olarak, polianhidrid alifatik sebasik asit (SA), aromatik 1,6-bis (p-karboksifenoksi) heksan (CPH), ya da amfifilik 1,8-bis (p-karboksifenoksi) -3,6-dioxaoctane oluşan nanoparçacıklar (CPTEG) benzersiz toplu ve yüzey erozyonu kinetik 1,2 gösterilecek ve yavaş yavaş in vivo 3,4,5 fonksiyonel biyomoleküllerin (örneğin, protein antijenleri, immünglobulinler, vb) serbest bırakmak için kullanılabilir. Bu onlara bir aşı dağıtım platformu 6,7,8 için mükemmel bir seçim yapmak, aynı zamanda sahip oldukları içsel adjuvan aktivite nanoparçacıklar. Burun içi mukozal aşılamayı takiben doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonu düzenleyen mekanizmaları aydınlatmak üzere, bir antijen p moleküler ve hücre yanıtları değerlendirilmesi gerekirbağışıklık yanıtı başlatmadan sorumlu alınıyoruz hücreler (APC). Alveoler makrofajların (AMɸ) akciğer parankimi 9,10,11 baskın sırasında dendritik hücreler, hava yollarında yürütülmesi bulunan başlıca APC&#39;ler vardır. AMɸ mikrobiyal patojenler ve hücre artıkları 12,13 akciğerlerinde temizlenmesi son derece verimlidir. Ayrıca, bu hücre tipi bir adaptif bağışıklık yanıtının 9 başlamasında önemli bir ilk adımdır lenf düğümleri için mikrobiyal antijenlerin taşıma değerli bir rol oynar. AMɸ da doğuştan örüntü tanıma ve çöpçü reseptörleri, salgılar pro-enflamatuar mediatörler ve başbakan naif T hücrelerinin 12,14 yüksek seviyelerde ifade. AMɸ (ör., daha az% 80) arasında göreceli olarak saf popülasyonunun, laboratuarda çalışma için akciğer lavaj yoluyla elde edilebilir. AMɸ immün yetenekli hayvanlar hasat Resident encounte olacak makrofajların temsilcisi fenotipi sağlamakin vivo r parçacık tabanlı aşı. Bu yazıda, farelerden alınan hasat ve kültür AMɸ için kullanılan protokolleri tanımlamak ve in vitro polianhidrid nanopartiküller ile tedaviyi takiben makrofajların aktivasyonu fenotipi inceleyin.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles at JoVE.com

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

harvesting-murine-alveolar-macrophages-evaluating-cellular-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.7K Görüntüleme.  Iowa State University. Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.

Video: Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Biyomühendislik

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea (ureolysis) in naturally occurring environments through secretion of an enzyme urease. This process of ureolysis, through a chain of chemical reactions, leads to the formation of calcium carbonate precipitates. This is known as Microbiologically Induced Calcite Precipitation (MICP). The proper culture protocols for MICP are detailed here. Finally, visualization experiments under different modes of microscopy were performed to understand various aspects of the precipitation process. Techniques like optical microscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-Ray Photo-electron Spectroscopy (XPS)&#160;were employed to chemically characterize the end-product. Further, the ability of these precipitates to clog pores inside a natural porous medium was demonstrated through a qualitative experiment where sponge bars were used to mimic a pore-network with a range of length scales. A sponge bar dipped in the culture medium containing the bacterial cells hardens due to the clogging of its pores resulting from the continuous process of chemical precipitation. This hardened sponge bar exhibits superior strength when compared to a control sponge bar which becomes compressed and squeezed under the action of an applied external load, while the hardened bar is able to support the same weight with little deformation.

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Mikrobiyolojik Kalsit Yağış Bağlı tarafından Aracılı<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Sıvılardaki Darbeli Lazer-Ablasyonuyla Metal Nanopartikül Üretimi: Nanopartiküllerin Antibakteriyel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Alet

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Anyonik Seryum oksit nano tanecikleri tarafından bitki reaktif oksijen türleri içinde Vivo katalitik kayıt atma

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...