Bu protokol, adsorbe protein tabakalarında kültürlenmiş muhabir makrofajlarda NF-kappa-B ve AP-1 aktivitelerinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini ve Toll benzeri reseptörler gibi hücre sinyal yollarının bu yanıta katkısını sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre kültürü supernatants hızlı bir şekilde NF-kappa-B ve AP-1 etkinliği için basit bir enzimatik test kullanılarak analiz edilmesine izin veren, basitlik olduğunu. PmMA kloroform bir 20 mililitre cam sintilasyon vial bir duman başlık içinde mililitre son konsantrasyon başına 20 miligram eriterek başlayın.
Şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve karışımı en az iki saat karıştırın. Tüm katımaddeler çözüldüğünde, PMMA çözeltisinin 400 mikrolitresini bir spin kaplamada planlanan koşul başına her borosilikat cam mikroskop kaydırağının merkezine aktarın ve PMMA'yı dakikada 3,000 dönüşte iki dakika boyunca slayta döndürün. Daha sonra spin kaplı slaytları %70 etanol püskürtülen temiz bir kutuda saklayın.
Daha sonra, biyolojik bir güvenlik kabininde, PMMA kaplı-slaytlara sekiz odalı yapışkan kuyular takmak için steril terlikler ve aseptik teknik kullanın, güçlü bir şekilde bağlı olduğundan emin olmak için her yapışkan kuyunun üstüne sıkıca bastırın. Mikroskop kaydırağının kenarlarıyla yapışkan kuyuları hizaya sokmaya özen lı olarak dikkat edin, böylece tüm kuyular slayta iliştirin ve sızdırmaz. Mühürleri sabitlemek için yapışkan iyi bağlanmış slaytları bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Sonra ertesi sabah mühürler test etmek için oda sıcaklığında 60 dakikalık bir kuluçka için her kuyuya hücre kültürü sınıf endotoksin içermeyen su 200 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, su aspire, PMMA kaplama rahatsız etmemeye dikkat. Kalan çözücüleri çıkarmak için kullanmadan önce her kuyuda üçer kez yıkama başına bir saat boyunca 300 mikrolitre taze endotoksiniçermeyen su ile yıkayın ve ardından bir 12 saat ve 24 saat yıkama yapın.
Sonra UV 30 dakika boyunca slaytlar sterilize. 3T3 hücre lisatları elde etmek için, 3T3 hücre kültürleri T150 kültür şişelerinde %70 birleştiğinde, her kültürü beş mililitre PBS ile yıkayın ve hücreleri şişe başına beş mililitre hayvan kökenliiçermeyen, rekombinant hücre ayrıştırma enzimi ile tedavi edin. Kuluçka sonunda, her şişeyi birkaç kez ileri geri yatırArak enzimi kültür başına beş mililitre PBS ile nötralize etmeden önce hücreleri ayırın.
Tek bir 50 mililitrelik santrifüj tüp içinde ayrık hücreleri havuz ve herhangi bir hücre kümeleri kırmak için bir pipet kullanın. Sayma sonra, santrifüj ile hücreleri toplamak. Supernatant aspire, ve taze PBS mililitre konsantrasyonu başına altı hücre ye bir kez 10 hücreleri askıya.
Daha sonra, dondurulmuş hücre çözeltisini 37 derecelik bir su banyosuna koymadan önce numune tamamen dondurulana kadar eksi 80 derecelik bir dondurucudaki hücreleri en az iki saat dondurun. Bir adsorbe protein tabakasının Toll benzeri reseptör aracılı NF-kappa-B/AP-1 aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, uygun büyüklükteki bir şişede muhabir makrofajları %70'e çıkardıktan sonra, hücreleri gösterildiği gibi uygun bir enzimatik ayrışma çözeltisi ile ayırın. Hücreleri 7.3 çarpı 10'da, asalitre konsantrasyonu başına beş hücreye yeniden askıya alın ve hücreleri üç tüp arasında eşit olarak eşit olarak tamamlayın.
Hücrelerin ilk tüpünü oda sıcaklığında 60 dakika boyunca mililitre başına bir mikrogram TLR4 inhibitörü ile tedavi edin, ikinci tüpü mililitre başına 50 mikrogram anti-TLR2 antikor ile oda sıcaklığında 30 dakika süreyle tedavi edin ve üçüncü tüpü tedavi edilmeden oda sıcaklığında bırakın. Hücreler kuluçkaya yatarken, her koşulda üç yapışkan kuyuya 200 mikrolitre lysat e ve %10 fetal büyükbaş serum ekleyin. Proteinlerin, her bir kuyu için yeni bir Pasteur pipeti ile protein çözeltilerini azarlamadan ve yapışkan kuyu yüzeylerini yıkama başına beş dakika boyunca kuyu başına 250 mikrolitre PBS ile üç kez yıkamadan önce uygun deneysel süre için 37 santigrat derecede adsorb'a izin verin.
Muhabir makrofaj tedavisinin sonunda, her kuyuya 200 mikrolitre hücre çözeltisi ekleyin. Pam3CSK4'ü şematikte gösterildiği gibi TLR2 pozitif kontrolü olarak mililitre başına 150 nanogramlık son konsantrasyona ekleyin. BIR TLR4 pozitif kontrol için, iki kuyu mililitre başına 1,5 mikrogram son konsantrasyoniçin lipopolisakkarit ekleyin.
37 santigrat derece 20 saat sonra, plaka 20 mikrolitre supernatant her kuyudan bir 96-iyi plaka içinde yinelenen, üç kuyu lar da dahil olmak üzere 20 mikrolitre istibak orta başına ve arka plan kontrolü. Daha sonra, her kuyuya 200 mikrolitre SEAP muhabiri teşele reaktifi ekleyin ve 37 santigrat derecede 2,5 saatlik bir kuluçka için plakayı yapışkan bir mühürle kaplayın. Yapışkan kuyu başına bir 1.5 mililitrelik tüp supernatant geri kalanı aktarın ve santrifüj ile enkaz tortu.
Daha sonra süpernatants yeni 1.5 mililitrelik tüpler için eksi 80 derece santigrat depolama için ELISA tarafından downstream proinflamatuar sitokin analizi aktarın. Kuluçka sonunda, yapışkan mührü plakadan çıkarın ve 635 nanometre de bir plater okuyucu üzerinde emiciokuyun. PMMA kaplı mikroskop kızaklarBir saat boyunca %70 etanolle ıslatılması PMMA kaplamayı kaldırırken, ne %70 etanol ne de UV sterilizasyonu fPTFE kaplı kapakların su temas açısını etkilemez.
3T3 lysates batı leke analizi hem HMGB1 ve ısı şok proteini 60, iki iyi belgelenmiş hasar ilişkili moleküler desenler varlığını ortaya koymaktadır. TLR ligandların polimer yüzeylere adsorpsiyonu, protein-adsordi polimer yüzeylerde 20 saat boyunca muhabir makrofajların ekspertiz edilmesi ve daha sonra nf-kappa-B/AP-1 aktivitesinin enzimatik bir tetkik ile dolaylı olarak değerlendirilmesi ile doğrulanabilir. Bu aktivite TLR2 veya TLR4 sinyallerinin inhibisyonu sonrasında azalır.
Ayrıca, muhabir makrofajlar adsorbe fbs veya plazma ve pre-adsordi protein ile karşılaştırıldığında adsordi lysate yanıt olarak NF-kappa-B/AP-1 aktivitesini önemli ölçüde artmıştır. Buna ek olarak, serumda seyreltilmiş az miktarda lisat, sadece seruma göre NF-kappa-B/AP-1 yanıtlarını önemli ölçüde artırırken, polimer yüzeye bağlı en düşük etkili seyreltme dir. Kaplamalı yüzeylerin endotoksin kontaminasyonunu önlemek için, temiz alanlarda çalışın, kullanılmadığında yüzeyleri kapatın ve durulamalar için hücre kültürü sınıfı su ve tamponlar kullanın.
Bu işlemden sonra protein salgısını değerlendirmek için kalan süpernatantlar üzerinde immünoasi yapılabilir ve makrofajlar akış sitometrisi ve qPCR gen ekspresyonu analizi ile analiz edilebilir.
