Burada açıklanan protokol, hava kirletici ozona maruz kaldıktan sonra akciğer makrofajesitoz uyguluyor. Bu veriler ozon maruziyetinin alveoler makrofaj eferositozunun azaldığını ve bu nedenle ozon seviyesinin yükselmesinin akciğer hastalıklarının görülme sıklığını neden artırdığını gösteren bir mekanizma olabileceğini göstermektedir. Bu tekniğin en büyük avantajı, fenotip veya fonksiyonlarını değiştirebilecek makrofajların ex vivo manipülasyonları olmaksızın alveoler makrofaj eferositozun in vivo değerlendirilmesidir.
Bu teknik, akciğerin hava kirliliğine maruz kaldıktan sonra kendini onaramayacağı yeni bir mekanizmaortaya koymuştur. Ayrıca, bu teknik akciğerde eferositoz değiştirmek hedeflere yeni yollar ortaya çıkarabilir. Bu yöntem akciğer yaralanması veya iltihabı herhangi bir model uygulanabilir.
Ancak, kullanıcı akciğer hasarı sonrasında eferositoz değerlendirmek için en iyi zaman optimize etmek gerekir. Orofayngeal aspirasyon gerçekleştirmek teknik olarak zor olabilir. Bu işlemi gerçekleştirmek için tekniğinizi optimize ettiğinizden emin olmak için veteriner personeliniz ile çalışmanızı tavsiye ederim.
37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit el yazması yönlere göre takviye bazal hücre kültürü orta Jurkat T hücreleri kültürlenme ile başlayın. Jurkat T hücreleri, her üç günde bir önceden ısıtılmış kültür ortamına geçerek muhafaza edilebilen bir süspansiyon hücre hattıdır. Apoptotik hücreleri %90'a kadar büyüterek hazırlayın ve bu hücreler passiyetten sonra 3-4 gün sürer.
Bu protokol için yeterli sayıda hücre elde etmek için beş T75 şişesinde hücreleri büyütün. Hücreler hazır olduktan sonra, yaklaşık 24 mililitre lik şişe içeriğini aspire edin ve bunları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Trypan Mavi boyama ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
5 dakika boyunca 271 kez g santrifüj ile hücreleri pelet ve supernatant atın. Daha sonra, mililitre başına üç milyon hücre elde etmek için medya hücreleri resuspend. Aliquot hücreleri içine 100 tarafından 20 milimetre doku kültürü yemekleri çanak başına hücrelerin beş mililitre aktararak.
Yaklaşık dokuz kültür yemeği hazırlayın. Bir tabak bir kenara maruz kalmamış bir kontrol olarak koyun ve UV kalan yemekleri maruz. UV crosslinker'ı enerji düğmesine basarak ve sayı pedi ile 600'e girerek doğru enerji seviyesine ayarlayın. UV maruziyeti sırasında doku kültürü çanak üst kapağı kaldırmak için emin kontrol dışında hücreleri ile tüm yemekleri ışınlamak.
Sonra, bir hücre kültürü kuluçka makinesindeki tüm tabakları 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle dört saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, tüm ışınlanmış hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe birleştirin ve 271 kez g'de beş dakika santrifüj le peletleyin. Supernatant atın ve steril PBS 24 mililitre hücreleri resuspend.
Tüpü tekrar santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Uygun konsantrasyonda PBS onları resuspend tarafından dosing fareler için hücreleri hazırlayın. Fare düzgün bir şekilde anestezi edildikten sonra, yarı recumbent omurga pozisyonuna yerleştirin.
Maksiller kesici dişler tarafından fareaskıya eğimli akrilik levha levha üzerinde mandal arasında bağlı cerrahi dize kullanın. Fare dilini hafifçe kapmak ve çekmek ve p200 pipetile apoptotik hücreleri ağız boşluğuna sokmak için bir çift künt çıkıntılı olmayan forceps kullanın. Dozlama fareler dozu aldıktan sonra bir ila iki saniye çatırtı gürültü yapmak başarılı olur.
Eldivenli bir parmakla, dil geri çekilirken nefes alana kadar farenin burnunu nazikçe kapatın. Ağız boşluğunda sıvı görünmeyene ve fare iki veya daha fazla teneffüs edilene kadar burnu kapalı tutun. Fareyi aşı panosundan çıkarın ve enkazın nares'i engellemesini önlemek için fareyi sırtına yerleştirmeyi sağlayan anesteziden kurtulmasını sağlamak için kafese geri verin.
Tüm fareler anestezi uyandıktan sonra, alveoler makrofajlar apoptotik hücrelerin akını yutmak için izin vermek için 90 dakika bekleyin. Lavaj sıvısı toplamak için, el yazması talimatlara göre ötenazi fare hazırlamak. PBS'yi yavaşça akciğerlere doğru iterek şişirmelerini bekleyin, sonra pbs'nin burun deliklerinden çıkmadığından emin olmak için aynı hacmi geri çekin.
15 mililitrelik bir tüp her fareden havuzlu lavaj toplamak. Bronkoalveoler lavaj veya BAL'ı 610 kez g'de dört santigrat derecede altı dakika bekleyin, süpernatantı 1,5 mililitrelik bir tüpe alın ve eksi 80 santigrat derecede dondurun. Pelet bronkoalveolar uzaydan hücreleri temsil eder.
Kalıntı kırmızı kan hücrelerini kaldırmak için pelet ack kırmızı kan hücresi lisis tampon bir mililitre ekleyin. Girdap ve buz üzerinde bir dakika lyse, sonra lysis reaksiyonu durdurmak için PBS dört mililitre ekleyin. Hücreleri 610 kez g'de dört santigrat derecede altı dakika santrifüj edin ve süpernatantı vakum aspiratörlü aspire edin.
Daha sonra, %10 FBS ile bir mililitre PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve Trypan Blue olmadan hemositometredeki hücreleri sayın. Orta ivme ve sitosantrifüj kullanarak 12 kez g'de her numunenin 120 mikrolitresini üç dakika boyunca kaydıraklarüzerine santrifüj edin. Slaytları bir gecede kurumaya bırakın.
Ertesi gün, hem eferositik hem de diferansiyel hücre sayılarını hesaplamak için slaytları hematoksilin ve eozin le lekelayın. Ardından, 20X veya 40X hedefi kullanarak biyolojik bir mikroskop üzerinde Brightfield ayarı altında slaytları görüntüleyin. Apoptotik Jurkat T hücrelerini apoptotik hücre alımı olmadan alveoler makrofajlara fagositli alveoler makrofajların oranına göre eferositik indeksini hesaplayın ve her slayttan en az 200 hücre sayın.
Bu protokol ozon maruziyetinin akciğer iltihabı üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılmıştır. Ozon maruz fareler filtrelenmiş hava kontrol grubuna göre hava alanında makrofajlar ve nötrofiller bir artış gösterdi ve BAL proteinbir artış vardı, alveoler epitel disfonksiyonu bir belirteç. Farelerin dosing önce, Jurkat T hücrelerinde apoptosis akış sitometri ile doğrulandı.
60 milli joule UV maruz kalma düzeyi ve dört saatlik kuluçka süresi yaklaşık% 75 apoptotik hücrelerin tekrarlayan sonuçlar sonuçlandı. Eferositik makrofajlar, normal alveoler makrofajlara göre Jurkat T hücresini içine alan makrofajlar olarak tanımlandı. Ozon maruzkalan grubun eferositik indeksinde ozon kaynaklı pulmoner inflamasyonun apoptotik hücrelerin azalması ile ilişkili olduğunu gösteren filtrelenmiş hava kontrollerine göre anlamlı bir azalma saptandı.
Detaylara dikkat etmek ve gözlenen farklılıkların yazılması bu işlem sırasında çok önemlidir. Ayrıca analiz için örnekleri kör ve iki farklı kişi makrofajlar saymak için tavsiye edilir. İzolasyondan sonra BAL hücreleri mRNA analizi için kullanılabilir, immünoresans tarafından ek belirteçler için boyanabilir ve/veya henotik değişiklikleri ayırt etmek için akış sitometresi üzerinde çalıştırılabilir.
