SVH Ghent Üniversitesi Sağlık Bilimleri Fakültesi Biyomedikal Moleküler Biyoloji bir araştırma yardımcısıdır. ERJ UniVacFlu tarafından desteklenen, hibe numarası 607690. KR EC-FP7 proje FLUNIVAC tarafından desteklenmektedir.

Bu çalışmada tanımlanan tüm hayvan deneyleri, ulusal (Belçika Yasası 14/08/1986 ve 22/12/2003, Belçika Kraliyet Kararnamesi 06/04/2010) ve Avrupa mevzuatı (AB Yönergeleri 2010/63 / AB ve 86 / 609 / EEC). Farelerdeki ve tüm hayvan protokolleri üzerindeki tüm deneyler, Ghent Üniversitesi Etik Kurulunca onaylandı (izin numaraları LA1400091 ve EC2016-027). 1. Hazırlık <ol><li> Lavaj sıvısı <ol><li> Dengeli bir tuz çözeltisi, 100 uM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile hazırlayın. NOT: BAL sıvısındaki protein düzeylerini ölçmek için, BAL sıvısında proteaz aktivitesini önlemek için proteaz inhibitörleri eklemek önerilir. </li></ol></li><li> sonda <ol><li> Şeffaf plastik polietilen 21 G tüpüne (iç çap: 0.58 mm, dış çap: 0.965 mm ve uzunluk: 0.5 cm) 23 G&#39;lik bir iğne sokarak kateter yapın. Prematüre kateterler de kullanılabilir. </li></ol></li><li> Anesthahlakı <ol><li> Bir terminal anestetik, solunum durmasına sebep olur, tercihen bir (fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde, örneğin, sodyum pentobarbital gibi bir barbiturat (&gt; 100 mg / kg) çözeltisi) hazırlayın. NOT: inhale anestezi BAL sıvısı içeriğine etkisi olabileceğini gibi, yerine solunan anestezi enjekte anestezi kullanılması önerilir. CO2, örneğin kan pH&#39;ına ve sonuç olarak farklı bileşiklerin 12 yeniden dağılımı üzerinde bir etkisi vardır. </li></ol></li><li> Amonyum klorür potasyum (ACK), kırmızı kan hücre parçalama tamponu <ol><li> NH4CI 8.29 g ve 100 uM EDTA ile H2O 1 L KHCO 3 1 g çözülmesiyle bir ACK lisiz tamponu hazırlayın; kırmızı kan hücre parçalama tamponu, aynı zamanda harici bir kaynaktan temin edilebilir. </li></ol></li></ol> 2. gerçekleştirme bronkoalveoler lavaj (BAL) <ol><li> trakea içine kateter Tanıtımı<ol><li> 26 G iğne kullanılarak bir kısa etkili barbitürat anestetik öldürücü dozda intraperitonal enjeksiyonu ile fare öldürülür. Uygun öldürücü anesthetization onaylamak için ayak refleksini kontrol etmek forseps ile fare arka pençesini çimdik. </li><li> Cerrahi bir tabakta sırtında hayvan koyun ve uzuvları aşağı iğneleyerek fareyi sabitleyin. </li><li> dezenfekte boyun% 70 etanol püskürtün. Bir neşter kullanılarak trake yakın boyun deride bir kesi olun. </li><li> tükürük bezleri ortaya çıkarmak için cildi açın. sternohyoid kas açığa çıkarmak için kerpeten kullanarak tükürük bezleri ayırın. trakea maruz için kıskaçlarını kullanarak trakea etrafında kas İnsizyon. </li><li> kıskaçlarını kullanarak trakea altındaki bir pamuk ipliği yerleştirin. </li><li> Dikkatli bir şekilde 26 G iğne ile iki kıkırdak halkaları arasında maruz trakeanın orta delinme. Başka trakea zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> trakea içine 0.5 cm&#39;lik sonda yerleştirin. Kateterizasyonu emin olunBu akciğer yapısının hasar görmesine neden olabilir olarak ter, çok uzak aşağı trakea içine takılmamış. </li><li> Adım 2.1.5 yerleştirilen pamuk ipliği ile kateter etrafında trakea bağlayarak kateteri stabilize. Kateter yeterince bağlı değilse, enjekte edilen dengeli tuz çözeltisi yerine aşağı akciğerlere solunum yolunun üst kısmına doğru akabilir. </li></ol></li><li> lavaj sıvısı toplayın <ol><li> 100 uM EDTA ile steril dengeli tuz çözeltisi 1 ml 1 ml şırınga yükleyin. </li><li> Kateterin 1 ml şırınga bağlayın ve yavaşça akciğer içine tuz / EDTA çözeltisi enjekte edilir. </li><li> fare göğüs kafesi masaj yaparken hafifçe çözüm aspire. aspire sıvı şırınga içinde görünmüyorsa, dikkatlice biraz daha aşağı veya trakea yukarı kateter yerleştirin. </li><li> iğne, şırınganın çıkarın ve buz üzerine yerleştirilmiş bir 15 ml tüp içine Toplanan lavaj sıvısı aktarın. Normal olarak, 700-900 ve# 181; BAL L enjekte solüsyonu 1 mL geri kazanılır. </li><li> 2.2.4 iki kez daha - Tekrar 2.2.1 adımları tekrarlayın. NOT: Amaç dışı hücresel içeriğini analiz etmek için ise, hassasiyetle sorunlar olduğunda toplanmış numuneleri konsantre önerilir. </li></ol></li></ol> 3. BAL sıvısının hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri Toplama <ol><li> 400 x g&#39;de, 7 dakika ve 4 ° C&#39;de lavaj sıvısı santrifüjleyin. </li><li> -80 ° C&#39;de, daha fazla analiz (örneğin, ELISA) ya da dondurularak için kullanmak hemen süpernatant toplayın ve. akciğerlerde hücresel akını analiz etmek hücre topağı tutun. </li><li> ACK yokedici tamponda 200 uL hücre pelletini. NOT: bozulmamış beyaz kan hücrelerini tutarken Bu adım eritrosidlerin erimesine sağlamaktadır. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. NOT: Kırmızı hücre erimesi nedeniyle varyasyonu azaltmak için, bu adım en fazla 2 dakika boyunca yapılmamalıdır. </li&gt; <li> ACK lizan tamponu seyreltmek için 1 mL soğuk PBS ekleyin. </li><li> 400 xg&#39;de ve 4 ° C&#39;de 7 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve aşağı doğru analiz için hücreleri yeterli miktarda PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirin (aşağıya bakın). NOT: PBS&#39;nin hacmi gerçekleştirilecek aşağı akış çalışmasına bağlıdır. </li></ol> 4. BAL Akışkanındaki Farklı Hücre Çeşitlerinin Akış Sitometresi ile Analizi NOT: Bir olasılık, akış sitometrisi uygulayarak BAL sıvısının mutlak ve göreli hücresel kompozisyonunu analiz etmektir. Bu yazının amacı BAL tekniğini geliştirmektir. Akış sitometresi, kendi başına özel bir tekniktir. Flow sitometri tekniği 13 , 14 , 15 , 16 , 17&#39;de uzmanlaşmış kağıtları okumak önerilir. Bir floroföre bağlanmış antikorlarşapka kullanılan belirli bir hücre tipi (lar) özel yüzey antijenlerini (Tablo 1 e bakınız) tanır. bir geçitleme stratejisi kullanılarak, BAL hücre fraksiyonu T hücreleri, makrofajlar, dendritik hücreler, B hücreleri, eozinofiller ve nötrofiller belirlemek mümkündür. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antijen </td><td> Hücre tipi </td></tr><tr><td> farklılaşma 3 küme (CD3) </td><td> T hücreleri üzerinde ifade edilen </td></tr><tr><td> farklılaşma 11c küme (CD11c) </td><td> En dendritik hücreler üzerinde değil, aynı zamanda monositler, makrofajlar, nötrofiller ve bazı B hücreleri üzerinde yüksek ifadesi. </td></tr><tr><td> farklılaşma 11b küme (CD11) </td><td> monositler, nötrofiller, doğal öldürücü hücreler, granülosit ve makrofajlar dahil olmak üzere birçok lökositlerin yüzeyi üzerinde ifade edilir. </td></tr><tr><td> SiglecF </td><td> birLüloz makrofajlar ve eozinofiller. </td></tr><tr><td> MHC II </td><td> Normalde sadece dendritik hücreler, mononükleer fagositler ve B hücreleri gibi antijen sunan hücrelerde bulunur. </td></tr><tr><td> CD19 </td><td> B-lenfosit antijeni </td></tr><tr><td> Ly-6G </td><td> Monositler, granülositler ve nötrofiller için bir markör </td></tr></tbody></table> Tablo 1: İmmün Hücre Yüzey Antijenlerinin Seçimi. Bu tablo, farklı hücre tiplerini karakterize etmek için kullanılan yüzey epitoplarının bir listesini sağlar. Belirli bir hücre türünü güvenilir bir şekilde tanımlamak için çeşitli belirteçlerin kombinasyonları gereklidir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Numuneler </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tüp </td><td> Hücrelere eklenecek anti-flüorofor </td&gt; <td> Antikor stok konsantrasyonu (mg / mL) </td><td> Antikor seyreltme </td><td> Toplam hacim (uL) </td></tr><tr><td></td><td> Sabitlenebilir canlılığı boya </td><td> 0.2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11c </td><td> 0.2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> SiglecF </td><td> 0.2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> örnek X </td><td> MHC II </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD19 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> Ly6G </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Gerilim kontrolleri </strong&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tüp </td><td> Antijen-florofor hücrelere eklenmesini </td><td> Antikor stok konsantrasyonu (mg / mL) </td><td> Antikor seyreltme </td><td> Toplam hacim (uL) </td></tr><tr><td> lekesiz hücreler </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Tek boyanmış hücreler </td><td> Sabitlenebilir canlılığı boya </td><td> 0.2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Tek boyanmış hücreler </td><td> CD11c </td><td> 0.2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Tek boyanmış hücreler </td><td> SiglecF </td><td> 0.2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Tek boyanmış hücreler </td><td> MHC II </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Tek boyanmış hücreler </td><td> CD3 </td><td> 00,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Tek boyalı hücreler </td><td> CD19 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Tek boyalı hücreler </td><td> CD11 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Tek boyalı hücreler </td><td> Ly6G </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Tazminat kontrolleri </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tüp </td><td> Boncuklara ilave edilecek anti-flüorofor </td><td> Antikor stok konsantrasyonu (mg / mL) </td><td> Antikor seyreltmesi </td><td> Toplam hacim (μL) </td></tr><tr><td> Renksiz boncuklar </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Tek boyalı boncuklar </td><td> CD11c </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td&gt; </tr><tr><td> Tek boyalı boncuklar </td><td> SiglecF </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Tek boyalı boncuklar </td><td> MHC II </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Tek boyalı boncuklar </td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Tek boyalı boncuklar </td><td> CD19 </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Tek boyalı boncuklar </td><td> CD11 </td><td> 0.2 </td><td> 1/400 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Tek boyalı boncuklar </td><td> Ly6G </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Dahil Edilecek Kontrol Listesi. Bu tablo, elde edilen sonuçların doğru bir şekilde yorumlanması için gerekli tüm kontrolleri göstermektedir. <ol><li> Hücre yüzey boyama NOT: Bu bir impoflow sitometri analizi için tüm kritik kontrolleri dahil etmek rtant. Üç takım tüp (bakınız Tablo 2) ihtiyaç vardır: (1) örnekleri içeren tüpler; (2) tek bir leke yapmak için, her bir antikor-fluorofor için BAL hücreleri ile tüpler; Bu akış sitometresinde her kanal için gerilimler belirlenmesi için olanak sağlar; ve (3) tek bir leke yapmak için, her bir antikor-fluorofor için boncuklar ile tüpler; Bu dengeleme matrisi belirlemektir. <ol><li> Uygun seyreltmelerde antikor ve Fc-blok PBS (anti-CD16 / CD32) &#39;in bir karışımını yapın (bakınız Tablo 2). Deney öncesinde her bir antikor için en uygun çalışma seyreltme belirlemek gereklidir. </li><li> örnek için antikor karışımı 50 uL hücrelerin tekrar ve kritik kontrol uygun şekilde seyreltilmiş antikor, 50 uL ekleyin. Not: boyama, 96 oyuklu, U biçimli bir plaka içerisinde gerçekleştirilebilir. Bu kolayca leke hacmi a azaltılması mümkün kılarnd numunelerin önemli miktarlarda çalıştırın. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 400 x g&#39;de, 7 dakika ve 4 ° C&#39;de santrifüje. Süpernatant atılır. </li><li> 200 uL nihai hacme PBS hücrelerin yeniden askıya. NOT: Bu son hacim flowsitometri erişebilir asgari hacmine bağlıdır. Bu makineler arasında biraz farklılık gösterebilir. Buna ek olarak, okuma hacimli numune akış sitometresinde çalışmasına alacak hücreleri ve / veya zamanın sayısına bağlıdır. </li><li> akım sitometri analizi için numune ve kontrolleri kullanın. NOT: Farklı hücre popülasyonlarının mutlak hücre sayısını belirlemek için, sayım boncuklar ilave edilmelidir. taneciklerin aynı sayıda ekleme hemen ölçüm öncesinde her bir numuneye (25,000 boncuk ±). Akış sitometrisi ile tespit edilebilir boncuklar sayma ileri kullanılarak ve yan saçılma ile (bakınız Şekil 1). Daha sonra, numune içinde hücrelerinin mutlak sayısı th karşılaştırılarak hesaplanabilirE boncuk olaylarının hücre olaylarına oranı. Aşağıdaki formül kullanılabilir: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55398/55398eq1.jpg" /></li></ol></li><li> Akış sitometrik analizi NOT: Boyama protokolünün tamamlanmasından hemen sonra akış sitometrik analiz yapılmalıdır. Sinyal saptama için uygun lazerler ve filtreler içeren bir akış sitometresi kullanılmalıdır. Tablo 3 , bu el yazmasında tanımlanan çalışma için gerekli lazerlere ve filtrelere genel bir bakış sunmaktadır. Akış sitometrik analiz hakkında daha fazla bilgi için bkz. Adan ve ark. 18 . <ol><li> Birincil kapılar, artıklar ve çiftler hariç, öne ve arkaya doğru dağılmaya dayalı olarak ayarlayın (bkz. Şekil 1 ). </li><li> Tekli lekelenmiş hücrelerin ve boncukların yardımıyla voltaj ve spektral örtüşme telafisini ayarlayın. NOT: Bu ayarlar her bir akış sitometresi için farklıdır ve her deneyden önce kontrol edilmesi gerekir. Fveya doğru akım analizi, öne ve yana saçılma gerilimleri kritiktir. Bir ileri doğru ve yana saçılım tanımlanması ve analiz hücre kimlik doğrulama de yardımcı olabilir. Bu voltajı belirlemek için, boyanmamış bir numune ilk çalıştırılmalıdır. </li><li> Yüzey antijeni için floresans kapıları ayarlama (bakınız Şekil 1) ve numune analiz eder. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Lazer tipi </td><td> Filtre kurulumu </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 505 LP </td><td> 525/50 </td></tr><tr><td> Mavi (488 nm) </td><td> 550 LP </td><td> 575/26 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td> 670 LP </td><td> 685/35 </td></tr><tr><td></td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr><tr><td> 405 nm menekşe </td><td></td><td> 450/50 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı 633 nm </td><td></td><td> 660/20 </td></tr><tr><td> 70 mW </td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Bu Çalışmada Kullanılan Akış Sitometresinin Lazerleri ve Filtrelerine Genel Bakış.

<ol>
	<li>Stankunas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+protein+alleles+using+knockin+mice+and+a+chemical+inducer+of+dimerization.">Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization.</a> Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).</li><li>Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+immune+processes+in+the+human+lung+in+health+and+disease:+evaluation+by+bronchoalveolar+lavage.">Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage.</a> Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).</li><li>Gee, J. B., Fick, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage.">Bronchoalveolar lavage.</a> Thorax. 35 (1), 1-8 (1980).</li><li>Tornling, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+in+bronchoalveolar+lavage+in+rats+exposed+to+quartz.">Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz.</a> Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).</li><li>Henderson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bronchoalveolar+lavage+to+detect+respiratory+tract+toxicity+of+inhaled+material.">Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material.</a> Exp Toxicol Pathol. 57, 155-159 (2005).</li><li>Morris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+analysis+of+the+lung+microbiota+of+cynomolgous+macaques+during+long-term+SHIV+infection.">Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection.</a> Microbiome. 4 (1), 38 (2016).</li><li>Naessens, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+treatment+prevents+respiratory+syncytial+virus-induced+pulmonary+exacerbation+responses+in+postallergic+mice+by+stimulating+alveolar+macrophage+maturation.">GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation.</a> J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).</li><li>Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+cellular+analyses+in+conjunction+with+high-resolution+computed+tomography+imaging+as+a+diagnostic+intervention+for+patients+with+suspected+interstitial+lung+disease.">Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease.</a> Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).</li><li>Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage.+The+report+of+an+international+conference.">Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference.</a> Chest. 90 (1), 122-131 (1986).</li><li>Baughman, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uncertainties+of+bronchoalveolar+lavage.">The uncertainties of bronchoalveolar lavage.</a> Eur Respir J. 10 (9), 1940-1942 (1997).</li><li>Singletary, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+common+BAL+technique+to+enhance+sample+diagnostic+value.">Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).</li><li>Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+influence+of+CO2,+as+an+agent+for+euthanasia,+on+the+pharmacokinetics+of+basic+compounds+in+rodents.">The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents.</a> Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Rubio-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Characterization+of+Macrophages+from+Rat+Kidney+by+Flow+Cytometry.">Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li><li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas.">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+flow+cytometry+assay+to+measure+cytotoxic+activity.">Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity.</a> J Vis Exp. (82), e51105 (2013).</li><li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+basic+principles+and+applications.">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ELISA+method.">The ELISA method.</a> J Vis Exp. , (2016).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+fluorometric+immunoassay+testing+methodology+and+troubleshooting.">Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li><li>Song, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+bronchoalveolar+lavage+method+based+on+suction+frequency+number+and+lavage+fraction+number+using+rats.">Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats.</a> Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).</li><li>Seliger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+high-precision+flow+cytometry+based+technique+for+total+white+blood+cell+counting+in+chickens.">A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens.</a> Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).</li><li>Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage:+role+in+the+pathogenesis,+diagnosis,+and+management+of+interstitial+lung+disease.">Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease.</a> Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).</li><li>Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+endotoxins+during+sensitization+prevents+further+endotoxin-induced+exacerbation+of+airway+inflammation+in+a+mouse+model+of+allergic+asthma.">Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma.</a> Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).</li><li>Delayre-Orthez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+downregulates+airway+inflammation+induced+by+lipopolysaccharide+in+the+mouse.">PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse.</a> Respir Res. 6, 91 (2005).</li><li>Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+endotoxins+on+allergen+sensitization+and+challenge+in+the+mouse.">Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse.</a> Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).</li><li>Hachet-Haas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+neutralizing+molecules+to+inhibit+actions+of+the+chemokine+CXCL12.">Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12.</a> J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).</li><li>Ble, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+lung+S1P(1)+receptor+reduces+allergen-induced+plasma+leakage+in+mice.">Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).</li><li>Ble, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergen-induced+lung+inflammation+in+actively+sensitized+mice+assessed+with+MR+imaging.">Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging.</a> Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).</li><li>Reber, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissociated+glucocorticoid+receptor+modulator+reduces+airway+hyperresponsiveness+and+inflammation+in+a+mouse+model+of+asthma.">A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma.</a> J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).</li><li>Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+lactate+dehydrogenase+and+its+isoenzymes+as+indicators+of+lung+damage+or+inflammation.">Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation.</a> Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).</li><li>Henderson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bronchoalveolar+lavage+to+detect+lung+damage.">Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage.</a> Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).</li><li>Forget, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adherent+cell+perifusion+technique+to+study+the+overall+and+sequential+response+of+rat+alveolar+macrophages+to+toxic+substances.">An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances.</a> Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).</li><li>Sung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+from+welding-fume-exposure-induced+lung+fibrosis+and+pulmonary+function+changes+in+sprague+dawley+rats.">Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats.</a> Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).</li><li>Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+possible+role+of+proteasomes+in+the+bronchoalveolar+space+of+the+injured+lung.">Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung.</a> Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).</li><li>Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+rat+alveolar+macrophages+by+bronchoalveolar+lavage+under+normal+and+activated+conditions.">Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions.</a> Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).</li><li>Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+pulmonary+macrophage+and+neutrophil+function+in+sequential+bronchoalveolar+lavage+aspirates+in+sarcoidosis.">Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis.</a> Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).</li><li>Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+components+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+quartz+exposed+rats.">Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats.</a> Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).</li><li>Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-1-antitrypsin+content+in+the+serum,+alveolar+macrophages,+and+alveolar+lavage+fluid+of+smoking+and+nonsmoking+normal+subjects.">Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects.</a> J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

BAL, enfeksiyonlara veya ilaçlara yanıt olarak sitolojik ve biyokimyasal bilgi elde etmek için yararlı bir tekniktir. Başlangıçta, BAL, fosgen toksisitesi 3 olan insan hastalarda aşırı mukus üretimini yönetmek için kullanıldı. Günümüzde bu teknik, insanlarda 3 , 24 hastalıkların akciğer patogenezi, tanı ve terapötik yönetimini araştırmak için kullanılmaktadır. Laboratuvar hayvanlarında, BAL, inflamatuar cevapları, bağışıklık mekanizmalarını ve pulmoner hava yolları 1 , 2&#39;de ortaya çıkan bulaşıcı hastalık süreçlerini izlemek için sıklıkla kullanılır. Solunum yolu hastalığı modellerinde inflamatuvar hücresel paternin çalışılması için BAL mutlak ve diferansiyel hücre sayımı ile izlenmelidir. Mutlak hücre numarasına ek olarak, ilgili hücre sayıları da ilgilidir. Örneğin, onarım ve kanser modelleri vBAL hücre sayımı artar veya azalmaz. Bu modelde, hücresel kompozisyonun değerlendirilmesi faydalıdır. Işık mikroskopisi ile kombine edilmiş hücre boyaması kullanarak, eozinofiller, nötrofiller, makrofajlar ve limfositler gibi farklı hücre tipleri, morfoloji 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30&#39;a dayalı olarak tanımlanabilir. Akış sitometrisi, farklı T-hücresi fenotiplerini 7 , 31 belirlemek gibi spesifik değerlendirmeler için kullanılabilir. Farklı infiltre hücre popülasyonlarının tanımlanmasına ek olarak, akciğerin hücresel olmayan kompozisyonu BAL kullanılarak araştırılabilir. BAL sıvısında sitokinler, büyümeyi belirlemek için ELISA, immünoblot, sitokin boncuk dizilimi, immünohistokimya ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu gibi yöntemler uygulanırFaktörler ve diğer enflamatuar bileşenler. Akciğer hasarını belirlemek için BAL sıvısındaki toplam protein ve laktat dehidrogenaz seviyeleri 32,33 olarak ölçülebilir. Yeni teşhis aletlerinin geliştirilmesi ile yakın gelecekte BAL bileşenlerinin genomik ve proteomik karakterizasyonu mümkün olacaktır. Hesaplama yeteneklerini ve yüksek verimli gen ekspresyon teknolojilerini genişleten kombinasyon, çeşitli hastalık durumları için spesifik gen ifade profillerini tanımlamayı mümkün kılacaktır. Bu teknikleri BAL sıvısı üzerinde gerçekleştirmek, akciğer hastalıklarının farklı evrelerinde yer alan önemli molekülleri tanımlamak için gen ve protein ifade kalıpları sağlayabilir. BAL akışkanından elde edilen verilerin temel sınırlaması, farklı araştırma çalışmaları 3 , 9 arasında karşılaştırılabilirlik eksikliğidir. Yüksek derecedeLavaj tekniği değişkenliği ve BAL sıvısının sonraki işlem. Her BAL deneme karşılaştırmak mümkün olması için, damlatılır lavaj sıvısının türü, instilasyon sitesi ve hücresel ve hücresel olmayan bileşim için analiz edilecek olan bir kısmını standardize etmek için gereklidir. Bir 14 kez 34, 35, 36 arasında değişen farklı denemeler arasında lavaj kısımların sayısı önemli farklılıklar vardır. Bu fark akciğerlerde tahmini toplam hücre sayıları üzerinde etkisi olabilir. BAL sıvısı kesir hücrelerinin çoğunluğu içeren bilmek önemlidir. Song ve ark. toplam hücre sayısının yaklaşık% 70, üç ila 22 fraksiyon bir de elde edildi göstermiştir. Ancak, diğer raporlar ikinci lavaj, 38 ilkinden 37 daha fazla hücre içerdiğini öne </sup&gt;. Bu çalışmalardan sadece bir fraksiyonlu bir lavajın tüm akciğeri temsil etmediğini ve sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açtığını söyleyebiliriz. BAL sıvısının hücre dışı kompozisyonu akciğer 33 , 39 , 40&#39;ın sağlık durumu hakkında değerli bilgiler içerir. BAL sıvısının seyreltilmesindeki değişiklikler, çözünür fraksiyonun miktarının belirlenmesindeki farklılığa ve dolayısıyla denemeler arasındaki sonuçların farklılığına katkıda bulunur. Song ve ark. Her lavaj fraksiyonunun protein ve laktat dehidrojenaz seviyelerini karşılaştırdı ve birinci lavaj fraksiyonunun ikinci fraksiyonun iki ila üç katı fazla olduğu sonucuna vardı. Analiz için temsilci BAL örneğini almak için bazı teknik hususlar çok önemlidir. Bunlardan biri doğru anestezi uygulamaktır. Ayak refini kontrol etmek çok önemlidir.Terminal sedasyon sağlamak için fare lex. Bu yalnızca etik nedenlerden ötürü değil, aynı zamanda, fare düzgün anestezi altına alındıysa kateterin doğru konuma getirilmesi ve tutulmasının zor olması nedeniyle de önemlidir. İkinci önemli teknik husus, kateterin trakeadaki pozisyonudur. Kateter çok derin yerleştirildiğinde, akciğer yapısına zarar verebilir. Kateterin distal ucu BAL işlemi sırasında akciğerlere ulaşmamalıdır. Kateter aynı zamanda stabilize edilmeli ve pamuklu bir ip ile bağlanmalıdır. Kateter stabilize edilmemişse, enjekte edilen tuz çözeltisi akciğerlere değil, burun boşluğuna yukarı akabilir. Salin solüsyonunun enjeksiyonu ve aspirasyonu sırasında, kateteri sabit tutmak önemlidir. BAL sıvısından elde edilen veriler, fare atesindeki tüm akciğerini temsil etmelidir. Bu nedenle, yeterli bir hacimde tuz tamponu ( örn.1 mL her biri) 3 alikoya bölünmüş 3 mL,. hücre verimi ve BAL sıvısı verimi arasında doğrusal bir ilişki vardır. Fare göğüs kafesi masaj yaparken hafifçe çözüm toplamak için önemlidir. kesme kuvvetleri çok güçlü ise, solunum yolları ve BAL sıvısında hücrelerin canlılığı, fonksiyon ve yapı çalınmış olabilir. Aspire edilen sıvı şırınga içinde görünmüyorsa, dikkatlice kateter derin veya daha yüksek trakea hareket eder. Özel uyarı BAL işleme ve analiz belirli yönleriyle verilmelidir. Bu BAL örneklerinden tutulan bilgiyi maksimize edecek. BAL sonra, hücreler, bir besleyici-zayıf bir tuz ortamında bulunmaktadır. BAL örnekleme sonra 1 saat içinde örnekleri işlemek için bu nedenle çok önemlidir. uzun süreli depolama gerekli ise, bir besin takviye ortamın kullanılması gerekmektedir. hücre canlılığını korumak için, yüzeye hücre yapışmasını teşvik tüpleri kaçının. ce kaçınınHücre süspansiyonlarının hücre bütünlüğünü tehlikeye atacak veya alınan BAL hücrelerinin üniform tekrar süspansiyonunu önleyecek hızda n-santrifüjlenmesi. BAL sıvısı içeren hücreler 7 dakika boyunca 400 xg ve 4 ° C&#39;de santrifüje tabi tutulmalıdır. İşlem sırasında hücre süspansiyonlarının 4 ° C&#39;de tutulması gerektiğini akılda tutmak önemlidir.

Hava yolları, inflamasyon, patojen istilası veya habis transformasyona yol açabilen çok sayıda hakaretle karşılaşır. Akciğer lümenini hizalayan epitel hücreleri, memeli vücudunun başlıca engellerinden birini oluşturur. Alveolar makrofajlarla birlikte, çevresel tehditlerin solunum yolu yoluyla sistemik sisteme girmesini önler. Bu tür tehditlere örnek olarak organik ve inorganik kimyasallar, bakteri ve virüsler verilebilir. Aynı şekilde, spesifik aşılar veya terapötik müdahaleler akciğerleri hedef alacak şekilde tasarlanabilir. Bütün bu örneklerde, uyarılmış yanıtın detaylı bir analizi, solunum sistemi içerisinde gerçekleşen biyolojik süreçleri anlamak, müdahale etmek veya önlemek için önemlidir. Bronkoalveoler lavaj (BAL), bu tür yanıtları analiz etmek için paha biçilemez bir yöntemdir; sonuçtaki örnekler, inflamatuar yanıtlar, bağışıklık mekanizmaları ve bulaşıcı hastalık progresyonu hakkında önemli bilgiler içermektedirpulmoner solunum yolları 1, 2 oluşabilir. BAL kullanılarak, infiltre hücrelerini inceleme mümkündür. Bu, pek çok ölü ve yapışkan hücreler ile, bir &quot;kirli&quot; hücre popülasyonu vermek sindirilmiş akciğerler, ters düşmektedir. BAL terminal bronşiyollere bir tuz çözeltisi verilmesi ve daha sonra bu çözeltinin geri kazanılması ile gerçekleştirilir. alınan çözelti daha sonra ölçmek ve fenotipik yerleşik akciğer ve infiltratif inflamatuar hücrelerin analiz etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, genellikle, örneğin astım gibi solunum yolu hastalık modelleri, hücresel akını çalışma uygulanır, Kronik Obstrüktif Akciğer Hastalığı (KOAH) ve enfeksiyon hastalık modelleri. Yanı sıra hücre bileşiminden, akciğer solunum yolları moleküler bileşim ayrıca BAL sıvısında yansıtılır. Bu analiz için, enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA), immünoblot ve sitokin kordon dizisi tarafından çok sayıda sitokin aynı anda analiz edilebilirSitokinler ve kemokinler varlığının değerlendirilmesi için yapıldı. BAL inflamatuar solunum yolu hastalığı hayvan modellerinde inflamatuvar hücrelerin akını incelemek için iyi bilinen bir yöntemdir. Değişik bir hücresel akının gözlenmesi ( örneğin artmış lenfosit, eozinofiller veya nötrofiller düzeyleri), hastalığa daha iyi kavrayışlara yol açabilir ve terapötik müdahalenin performansını değerlendirmek için objektif bir parametre olabilir. BAL hücresel analizinin doğru ve tekrarlanabilir yorumu, BAL&#39;nin doğru bir şekilde uygulanmasını ve toplanan sıvının düzgün bir şekilde işlenip işlenmesini gerektirir. &quot;Bronş lavajı&quot; terimi seksen yıl önce Stitt 3 tarafından tanıtıldı. 1961&#39;de Myrvik, tavşan akciğerlerinin lavaj sıvısından alveolar makrofajlar elde etti. BAL, şimdi fare modelinde akciğerleri analiz etmek ve izlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olmasına rağmenbilimsel literatürde 4, 5 de standardize BAL prosedürünün hiçbir rapor hala tekrar gönderilebilir. Ayrıca, muhtemelen tekniği 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11 kullanılarak araştırma laboratuarları olarak orada BAL gerçekleştirmek için pek çok yol vardır. BAL elde edilen veriler tüm fare akciğer temsil eder ve akciğerin sadece bir parçası olması önemlidir. değişkenlik Bu tür yorumlanması ve farklı denemeler arasındaki sonuçların karşılaştırılmasını zorlaştırmaktadır. Burada, temel, ucuz ve yeniden üretilebilir bir BAL prosedürü fare hava yolu lümeninde var olan hücre ve çözünebilir fraksiyon toplama sağlayan tarif edilmektedir. Kısaca, bir kateter maruz trakea o altindaFa terminally anestezi fare. Katetere bir şırınga bağlanır ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren tamponlu salin solüsyonu akciğerlere verilir. Akciğer lümeni, dalgıç çözeltinin dalgıç kullanılarak tekrar tekrar akıtılması ile örneklenir. Bu adım esnasında uygulanan negatif basınç, hava yolu çöküşünü önlemek için minimaldir. Toplama işlemini takiben, elde edilen BAL, akış sitometrisi ile hücrelerin numaralandırılması ve tanımlanması için daha da işlenmelidir.

<table><tbody><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>ethyleendiaminetetra acetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>irritating</td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 needle</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>size: 0.60 x 30 mm</td></tr><tr><td>26 G x 1/2 needle</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004512</td><td>size: 0.45 x 12 mm</td></tr><tr><td>plastic tubing</td><td>BD medical technology</td><td>427411</td><td>Polyethylene Tubing, I.D. 0.58 mm (0.023&quot;) O.D. 0.965 mm (0.38&quot;) 30.5 m (100&#039;)</td></tr><tr><td>sodium pentobarbital</td><td>Kela NV</td><td>514</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; or phenol red; sterile filtered</td></tr><tr><td>1 mL syringes</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td>nonpyrogenic and nontoxic</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools GmbH&amp;nbsp;</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH&amp;nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge tube 50 mL</td><td>TH.Geyer</td><td>7696705</td><td>Free from Rnase/Dnase/endotoxin</td></tr><tr><td>centrifuge tube 15 mL</td><td>TH.Geyer</td><td>7696702</td><td>Free from Rnase/Dnase/endotoxin</td></tr><tr><td>microcentrifuge tube 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0030 120.094</td><td>polypropylene</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>sterile-filtered</td></tr><tr><td>live/dead - efluor 506</td><td>ebioscience</td><td>65-0866-18 &amp;nbsp;</td><td>fixable viability dye</td></tr><tr><td>CD11c-PE-cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF-PE</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>552126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MHCII-APCefluor780</td><td>Biolegend</td><td>107628&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE-cy5</td><td>VWR</td><td>55-0031-U100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE-cy5</td><td>eBiosciences</td><td>15-0193-83&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-V450</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>560455&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G-AF700</td><td>Biolegend</td><td>127621</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Counting Beads</td><td>Life Technologies Europe B.V.&amp;nbsp;</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>96-well 340 &amp;micro;l storage plate plate</td><td>Falcon</td><td>353263</td><td>V-bottom, natural polypropylene</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>catheter</td><td>BD Biosciences</td><td>393202</td><td></td></tr></tbody></table>

bronchoalveolar lavage of murine lungs to analyze inflammatory cell infiltration

Bronkoalveolar Lavaj (BAL), devam etmekte olan bir hastalık halini anlamaya yönelik olarak ex vivo olarak akciğer lümeninin hücresel ve hücresel içeriğini incelemek için kullanılan deneysel bir prosedürdür. Burada, özel alet veya ekipmana ihtiyaç duymadan, fare atıkları üzerinde BAL&#39;yi gerçekleştirmek için basit ve etkili bir yöntem tarif edilmiştir. BAL sıvısı, terminal anestezi uygulanmış farelerin trakeasına bir kateteri sokarak izole edilir; buradan bronşiollere bir tuz çözeltisi damlatılır. BAL sıvı alımını en üst düzeye çıkarmak ve kesme kuvvetlerini en aza indirgemek için, damlatılmış sıvı hafifçe çekilir. Bu teknik havayollarında ve BAL sıvısındaki hücrelerin canlılığı, fonksiyonu ve yapısının korunmasını sağlar. Akciğer hastalık durumunun daha iyi anlaşılması için birçok teknik uygulanabilir. Burada, farklı türlerde bağışıklık hücrelerinin tanımlanması ve numaralandırılması için yaygın olarak kullanılan bir tekniktarif edilen, burada sitometrisi floresan etiketli hücre yüzeyi özgü işaretlerin seçilmiş bir panel ile birleştirilir akış. Burada sunulan BAL prosedür de murin akciğerlerde enfeksiyon maddeleri, sıvı bileşenleri ya da nefesle çekilmiş olan parçacıklann analiz etmek için kullanılabilir.

tamponlu tuz çözeltisi 3x 1 mL BAL yaptıktan sonra, 2 ve 3 mL arasında bir hacmi geri alınmış olmalıdır. Bu BAL sıvısı hücresel ve hücresel olmayan içerik karakterize etmek daha da analiz edilebilir. Bir sitokin boncuk dizisi 21 ile sitokinlerin ve kemokinlerin, ELISA 19, immunoblot 20 varlığını ve birçok sitokinin aynı anda analiz araştırmak için gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, bu sıvının albümin ve toplam protein içeriği 22 tespit edilebilir. Bir örnek olarak, bu yazının akış sitometrisi ile BAL sıvısının hücre içeriğini analiz açıklamaktadır. bunlar intratekal olarak lipopolisakkarid damlatıldı 24 saat sonra muayene: analiz BAL sıvısı dişi Balb / cAnNCrl fareler (7 haftalık) toplanmıştır. Aşağıdaki antikorlar, w flüorofora bağlıFarklı hücre tiplerini belirlemek için kullanılmıştır: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g ve CD11b (bkz. Tablo 1 ve Malzeme Tablosu ). Düzeltilebilir canlılık boyası da kullanıldı. Farklı hücre popülasyonlarının yüzeylerindeki antijenlerin diferansiyel ifadesine dayalı bir geçiş stratejisi kullanarak ( Şekil 1 ), makrofajları, dendritik hücreleri, B hücrelerini, T hücrelerini, nötrofilleri ve eozinofilleri tanımlamak mümkündür. İlk olarak, artıklar ve çiftler ileri ve yan saçılma parametrelerine dayanarak kapatıldı. Bir yaşayabilirlik boyası canlı hücreler üzerinde kapıyı kolaylaştırdı. Daha sonra, CD11c yüksek hücreleri ve CD11c düşük hücreleri tanımlandı. CD11c yüksek popülasyonunda makrofajlar ve dendritik hücreler sırasıyla MHCII ve SiglecF ifadesine dayalı olarak tanımlandı. CD11c düşük popülasyonunda sırasıyla CD3ε ve CD19 ekspresyonuna dayalı T hücreleri ve B hücreleri belirlendi. InciGeriye kalan hücre popülasyonu, nötrofiller ve eozinofiller sırasıyla CD11b ve Ly-6G markeri ekspresyonuna dayalı olarak tanımlandı. Boncuk olaylarının hücre olaylarına oranını karşılaştırarak farklı hücre popülasyonlarının mutlak hücre sayılarını belirlemek için sayım boncukları eklendi 23 . Bu sayma boncukları ileri ve yan yayılım özelliklerine göre tespit edildi ( Şekil 1 ). Tablo 4 , naif fare ve 5 mikrogram lipopolisakkarit ile 24 saat uyarılmış bir fare BAL sıvısındaki farklı hücre popülasyonlarının mutlak hücre sayılarına genel bir bakış sunmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55398/55398fig1.jpg" /> Şekil 1: Makrofajların, Dendritik Hücrelerin, T Hücrelerinin, B Hücrelerinin, Nötrofillerin ve Eozinofillerin Akım Sitometrik Tespiti İçin Gating Stratejisi iN BAL Akışkan. BAL hücreleri tarif edilen BAL protokolü kullanılarak izole edildi. Hücreler, lipopolisakkarit&#39;in intrakrakeal instilasyonundan 24 saat sonra farelerden izole edildi. Sayma boncukları ve hücreler ileri ve yan yayılım özelliklerine dayalı olarak tespit edildi. Hücre kapısında, tek hücreler ileri ve yan saçılım kullanılarak tanımlandı. Bu son popülasyonda canlı hücreler tanımlandı. Daha sonra CD11c yüksek hücreleri ve CD11c düşük hücreleri tanımlandı. CD11c yüksek popülasyonunda makrofajlar ve dendritik hücreler sırasıyla MHCII ve SiglecF ifadesine dayalı olarak tanımlandı. CD11c düşük popülasyonunda sırasıyla CD3ε ve CD19 ekspresyonuna dayalı olarak T hücreleri ve B hücreleri belirlendi. Kalan hücre popülasyonunda nötrofiller ve eozinofiller sırasıyla CD11b ve Ly-6G ekspresyonuna dayalı olarak tanımlandı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55398/55398fig1large.jpg" target="_blank">Görüntülemek için lütfen tıklayınız.</a>Bu rakamın daha büyük versiyonu. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Hücre popülasyonu </td><td> Naif farelerde mutlak hücre sayısı </td><td> LPS uyarılmış farelerde mutlak hücre sayısı </td></tr><tr><td> makrofajlar </td><td> 79612 </td><td> 25439 </td></tr><tr><td> dentritik hücreler </td><td> 495 </td><td> 671 </td></tr><tr><td> T hücreleri </td><td> 45271 </td><td> 28089 </td></tr><tr><td> B hücreleri </td><td> 4164 </td><td> 2926 </td></tr><tr><td> nötrofiller </td><td> 632 </td><td> 566716 </td></tr><tr><td> eozinofiller </td><td> 3483 </td><td> 4332 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: TemsilNaif ve LPS ile uyarılan Farelerin BAL Akışı Üzerindeki Flow Sitometri Analizinin Bulguları.

Watch this Scientific Journal Video about Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration at JoVE.com

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

bronchoalveolar-lavage-murine-lungs-to-analyze-inflammatory-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

67.1K Görüntüleme.  VIB.  Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz. 

Video: Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models of ALI are key in enhancing our understanding of disease pathogenesis. Lipopolysaccharide (LPS) derived from gram positive bacteria induces neutrophilic inflammation in the airways and lung parenchyma of mice. Efficient pulmonary delivery of compounds such as LPS is, however, difficult to achieve. In the approach described here, pulmonary delivery in mice is achieved by challenge to aerosolized Pseudomonas aeruginosa LPS. Dissolved LPS was aerosolized by a nebulizer connected to compressed air. Mice were exposed to a continuous flow of LPS aerosol in a Plexiglas box for 10 min, followed by 2 min conditioning after the aerosol was discontinued. Tracheal intubation and subsequent bronchoalveolar lavage, followed by formalin perfusion was next performed, which allows for characterization of the sterile pulmonary inflammation. Aerosolized LPS generates a pulmonary inflammation characterized by alveolar neutrophilia, detected in bronchoalveolar lavage and by histological assessment. This technique can be set up at a small cost with few appliances, and requires minimal training and expertise. The exposure system can thus be routinely performed at any laboratory, with the potential to enhance our understanding of lung pathology.

We describe a method for inducing neutrophilic pulmonary inflammation by challenge to aerosolized lipopolysaccharide by nebulization, to model acute lung injury. In addition, basic surgical techniques for lung isolation, tracheal intubation and bronchoalveolar lavage are also described.

Aerosolize Lipopolisakarid kullanma Yaratma Pulmoner nötrofilisi için bir yöntem

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

Havayolu Direnci Ölçümleri ve Fare Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı Örnekleme için, geri dönüşümlü, Non-invaziv Yöntemi

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biyoloji

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or fungal) inflammatory conditions. An overwhelming host response may result in compromised respiration and acute lung injury, which is characterized by lung neutrophil recruitment as a result of the patho-logical host immune, coagulative and tissue remodeling response. Sensitive microscopic methods to visualize and quantify murine lung cellular adaptations, in response to low-dose (0.05 ppm) ozone, a potent environmental pollutant in combination with bacterial lipopolysaccharide, a TLR4 agonist, are crucial in order to understand the host inflammatory and repair mechanisms. We describe a comprehensive fluorescent microscopic analysis of various lung and systemic body compartments, namely the broncho-alveolar lavage fluid, lung vascular perfusate, left lung cryosections, and sternal bone marrow perfusate. We show damage of alveolar macrophages, neutrophils, lung parenchymal tissue, as well as bone marrow cells in correlation with a delayed (up to 36-72 h) immune response that is marked by discrete chemokine gradients in the analyzed compartments. In addition, we present lung extracellular matrix and cellular cytoskeletal interactions (actin, tubulin), mitochondrial and reactive oxygen species, anti-coagulative plasminogen, its anti-angiogenic peptide fragment angiostatin, the mitochondrial ATP synthase complex V subunits, &#945; and &#946;. These surrogate markers, when supplemented with adequate in vitro cell-based assays and in vivo animal imaging techniques such as intravital microscopy, can provide vital information towards understanding the lung response to novel immunomodulatory agents.

Combined ozone and bacterial endotoxin exposed mice show wide-spread cell death, including that of neutrophils. We observed cellular adaptations such as disruption of cytoskeletal lamellipodia, increased cellular expression of complex V ATP synthase subunit &#946; and angiostatin in broncho-alveolar lavage, suppression of the lung immune response and delayed neutrophil recruitment.

Kombine Ozon ve LPS kaynaklı Murine Akut Akciğer Hasarı Sırasında Akciğer Hücresel Adaptasyonlarının Görselleştirilmesi

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while suppressing unwanted reactions to environmental antigens. Lungs host several populations of innate and adaptive immune cells that provide immune surveillance but also mediate protective immune responses. These cells, which keep the healthy pulmonary immune system in balance, also participate in several pathological conditions such as asthma, infections, autoimmune diseases, and cancer. Selective expression of surface and intracellular proteins provides unique immunophenotypic properties to the immune cells of the lung. Consequently, flow cytometry has an instrumental role in the identification of such cell populations during steady-state and pathological conditions. This paper presents a protocol that describes a consistent and reproducible method to identify the immune cells that reside in the lungs of healthy mice under steady-state conditions. However, this protocol can also be used to identify changes in these cell populations in various disease models to help identify disease-specific changes in the lung immune landscape.

In this study, we present an effective and reproducible protocol to isolate the immune populations of the murine respiratory system. We also provide a method for the identification of all innate and adaptive immune cells that reside in the lungs of healthy mice, using a 9-color-based flow cytometry panel.

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Farelerde öksürük duyarlılığı için noninvaziv gerçek zamanlı tüm vücut pletismografisi

Methods for Detecting Cough and Airway Inflammation in Mice

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge socioeconomic burden and a marked decrement in quality of life. Animal models can mimic the complex pathophysiology of the cough and are important tools for cough research. The detection of cough sensitivity and airway inflammation is of great significance for studying the complex pathological mechanism of cough. This article describes the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples (including blood, lung, spleen, and trachea) of mice. It introduces some methods to assess airway inflammation, including pathological changes in hematoxylin and eosin (HE)-stained lung and trachea sections, the total protein concentration, the uric acid concentration, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant of bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and the leukocytes and differential cell counts of BALF. These methods are reproducible and serve as valuable tools to study the complex pathophysiology of cough.

Yazar Spotlight: Kronik Öksürüğün Patofizyolojisinin Araştırılması

Here, we describe the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples of mice and introduce some methods to assess airway inflammation.

Farelerde öksürük ve hava yolu iltihabını tespit etme yöntemleri

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge ...

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

Aerosolize Lipopolisakarid kullanma Yaratma Pulmoner nötrofilisi için bir yöntem

Havayolu Direnci Ölçümleri ve Fare Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı Örnekleme için, geri dönüşümlü, Non-invaziv Yöntemi

Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Kombine Ozon ve LPS kaynaklı Murine Akut Akciğer Hasarı Sırasında Akciğer Hücresel Adaptasyonlarının Görselleştirilmesi

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

Farelerde öksürük ve hava yolu iltihabını tespit etme yöntemleri

Farelerde öksürük ve hava yolu iltihabını tespit etme yöntemleri