Bu çalışma Ulusal Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Enstitüsü Hibe R01AI079253 (BHS için) tarafından desteklenen edildi ve Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi Destek Hibe CA016056 tarafından Roswell Park Kanser Enstitüsü.

Bu çalışmada, hayvanlar üzerinde yapılan tüm işlemler Roswell Park Kanser Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve federal tüm devlet, uyulması ve Sağlık düzenlemeler National Institutes edildi. 1.. In vivo Makrofaj Etiketleme Not: PHK26 (iv) intravenöz olarak uygulandığında dolaşımdan ve dokularda hem fagositik hücreler tarafından alınacak bir lipofilik boyadır. PKH26 makrofaj hasat sonrası işleme miktarını en aza indirmek için in vivo etiketlenmesi için kullanılmıştır. PKH-26 sabit bir şekilde uzun süreler boyunca alveolar makrofajlar biriken avantajına sahiptir. 10 gün uygulanmasından sonra bekleme PKH26 8, 9 sadece alveolar makrofaj kararlı biçimde ayrılan işaretli dolaşımdan her etiketli hücrelerin temizlenmesi için olanak sağlar. PKH26 uyarma (551 nm) ve emisyon (567 nm) özellikleri uyumlu olan kırmızı florokromla olduğunurodamin veya fikoeritrin algılama sistemleri ile. Herhangi bir etiketleme prosedürü canlılığı kaybı da dahil olmak üzere, paraziti tanıtabilirsiniz. Biz farklı fare genotipleri makrofajların etiketleme için aynı yaklaşım kullanmak Ancak, (örneğin, WT vs NADPH oksidaz eksikliği), bu eserlerin etkileri düzgün olur. <ol><li> PKH26 stok solüsyonu (etanol içinde 1 x 10 -3 M) üretici tarafından sağlanan seyreltici C 01:05 sulandırmak. </li><li> Her bir fare için bir 1/2 ml insülin şırınga (29 G x 1/2 &quot;) ile seyreltilmiş PKH26 yükleyin 100 ul. </li><li> Hasat için en az 10 gün önce iv enjeksiyonu (kuyruk ven veya retro orbital ya) tarafından farelere yönetmek. </li></ol> Bronchoalveolar Lavage 2. Hasat Alveoler Makrofajlar (BAL) Bir deney için kullanılacak farelerin sayısı değişebilir. Bir uyarılmamış fareden tipik bir verim 3-5 x 10 5 alveolar makrofajlar aralığında, ancak bu sayı bas büyük ölçüde değişebilirbu lavaj yapan kişinin fare, deneyim boyutu ve lavaj sıvısı ve akciğer geri çekilen hacim instilasyon sayısı gibi faktörlere ed. Bu protokolde, akciğer yıkama tekrar 1 mi tabi tutulmuş yıkama sıvıları ile birlikte hücre verimini artırmak için yardımcı olan bir kapalı göğüs boşluğu ile gerçekleştirilir. <ol><li> Steril çözelti tutmak için aseptik koşullar kullanılarak avertin anestezik öldürücü bir doz (12.5 mg) intraperitoneal (ip) verilmesi ile fare Euthanize. </li><li> % 70 etanol ile iyice fare sprey. </li><li> Göğüs (Şekil 1A) açığa hayvanın kafatası ucundan cilt kaldırmak. <ol><li> Diyaframın hemen altında deri küçük bir kesim olun. </li><li> Kesim içine parmağınızı yerleştirin ve uzak hayvan (Şekil 1A) kranial ucundan cilt çekin. </li><li> Boynun ventral tarafı (Şekil 1A) uzanan kafasına hafifçe yukarıya doğru itilir. </li></ol></li><li> Göğüs kafesi ile küçük bir delik kestitoraks sağ tarafına akciğerlere söndürülmesi ve ayrıca aşağıdaki adımları sırasında akciğerlerin görüntülenmesine olanak vermek üzere. </li><li> Trakea bulun ve dikkatle çevresi dokuları uzak teşrih. <ol><li> Kavisli bir forseps ile tükürük bezleri, sternohyoid kasları ve gırtlak vb çıkarın. </li><li> Dikkatle kavisli bir forseps ile kaldırın ve makas ile yatan halkalı kıkırdak yapısını ortaya trakea (adventita) kapsayan ince dokuyu kesip. </li></ol></li><li> Trakea içine kateter yerleştirin. <ol><li> Kavisli bir forseps kullanarak, trakea (dorsal) arkasında bir sütür koyun ve açıklıktan 10 cm uzunluğa çekin. </li><li> Krikoid (kıkırdak kalınlaşmış halka) Yukarıdaki başlayarak dikkatlice trakea göğüs kemiğinin arkasında kaybolur nerede durdurma trakea aşağı bir 22 G kateter kılavuz. </li><li> Sıkıca oturması için trakea ve kateter çevresinde dikiş kravat. Kateter iğne çıkarılır. </li></ol></li><li> 4-yollu valf birleştirin. <ol><li> DoldurmakBir 6 ml DPBS,% 1 FBS ile şırınga ve Şekil 1B &#39;de gösterildiği gibi 4-yollu musluk ekleyin. </li><li> 4-yollu vana (Şekil 1 B) üzerinde gösterilen konumda bir boş 6 ml şırınga takın. </li><li> Kateter 4-yollu musluk (Şekil 1B) açık portu takın. Trakea kateteri çıkarmak için dikkatli olun. </li></ol></li><li> Akciğerlerden lavaj sıvısı toplayın. Not: Müfettişler dokuya hasar olasılığını en aza indirmek için lavaj sıvısının düşük miktarlar kullanmayı tercih edebilir. Aynı yaklaşım, sürekli olarak, tüm fare gruplarının uygulanabilir önemlidir. <ol><li> Böylece boş şırınga kapalı musluğu kolunu çevirin ve yavaş yavaş akciğerleri şişirmek için ~ 1 ml DPBS,% 1 FBS enjekte. Adım 2.4 delik kesme yoluyla akciğer enflasyonu gözlemleyin. </li><li> Akciğerleri overinflate için değil dikkatli olun. </li><li> Tam şırınga kapalı böylece musluğu kolunu açın ve dikkatlice grip çekilme<html> akciğerlerden gelen kimliği. </li><li> Akciğerler Adım 1.4 delik kesim aracılığıyla Söndür gözlemleyin. Kateter iyi bir beraberlik almak için biraz ileri veya geri hareket edilmesi gerekebilir. Trakea içinde kateteri tutmak için özel önlem alın. </li><li> Tekrar FBS% 1 enjekte ve akciğerlerden çekilmiş olan tüm DPBS&#39;de kadar 2.8.1-2.8.4 5-6x adımları. Not: akciğer sıvısının kurtarma enjekte edilen sıvının% 100 olmayacaktır. </li></ol></li><li> 50 ml konik tüp içine lavaj sıvısı ile boş şırınga. Oda sıcaklığında hücrelere tutun. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler ve süpernatant Pelet dökün. İstenirse bu sitokin analizi için kaydedilebilir. </li><li> % 10 FBS ile 1-5 ml RPMI 1640 hücreleri tekrar süspansiyon ve menositometrede saymak. Uyarılmamış fare olarak, BAL ile hasat hücrelerin&gt;% 95 sitolojisi ile teyit edilebilir makrofajlar, olması beklenmektedir. </li></ol> 3.. Kültüre ve Hasat Mantar &quot;&gt; Bu protokolde kullanılan Aspergillusfumigatus kendi yaşam döngüsünün tüm aşamalarında GFP ifade:. Sporlar, germlings ve hif Bu mantar gerginlik Dr Margo Moore, Simon Fraser Üniversitesi, Vancouver, BC, Kanada tarafından sağlandı. <ol><li> Kloramfenikol (0.05 g / L) ve gentamisin (0.5 g / L) ile yatık Sabouraud agar beyin kalp infüzyon (BHI) üzerine, GFP ifade eden bir Aspergillus fumigatus soyu Levha conidia. </li><li> Gevşek olarak oda sıcaklığında 7-10 gün boyunca kapatılmış karanlıkta inkübe edin. </li><li> DPBS içinde% 0.01 Tween 20 içinde 10 ml yıkama eğik Hasat conidia. Hafifçe gevşetmek için stripette ile mantar kazıyın. Verimi artırmak için Eğimli birkaç kez durulayın. </li><li> 50 ml konik içine 100 mikron hücre süzgecinden konidial süspansiyon geçmektedir. </li><li> 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ile pelet conidia. </li><li> Süspanse 50 ml DPBS&#39;de konidya ve Hemasitometre kullanarak saymak. </li><li> DPBS ile iki kez yıkanır ve arzu edilen konsantrasyon, seyreltinyon. </li></ol> 4. Mantar Mücadelesi ve Konfokal Mikroskopi Konak savunmasında makrofaj NADPH oksidaz rolünü araştırmak için, fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol etmek için üç genotip farelerden izole alveoler makrofaj kabiliyeti değerlendirildi. Bu çalışmada kullanılan genotipleri arasında; Doğal olarak meydana gelen mutasyona Ncf1 (Ncf1 olanağına NADPH oksidaz den yoksun bırakarak p47 pHOx, fagosit NADPH oksidaz gerekli bir bileşeni) için kodlayan ve 3) Ncf1 * / 1), vahşi tip fareler, 2) Ncf1 / * Mn-farenin * Mn + transjenik farenin NADPH oksidaz aktivitesi monosit / makrofaj nüfus 10, 11 içinde yeniden edilmiştir (MN insan CD68 promotörünün kontrolü altında yabani tip Ncf1 barındıran transgeni ifade eder.) Konfokal mikroskopi en nedeniyle varlığı Bu deneme için uygundurve slaytlarda olmayan fagosite Konidyumların büyüme. Konfokal mikroskop Z-ekseni içinde bireysel uçaklarının görselleştirme için izin ve makrofaj içeride ziyade çevresinde büyüyen mantar arasındaki farklılaşmayı sağlayacak. Tüm konfokal görüntüler 63X immersiyon yağı lens kullanılarak elde edilir. Z-yığınlar 2.5 elektronik zum faktörü ile elde edilir. Z-yığın kalınlığı alanın üst ve alt kısmını için DAPI ve parlak saha görüntüleri kullanılarak belirlenir. Z-yığınlar ~ 1 mikron kalınlığında 14 bireysel dilimleri ile 24 mikron arasında değişmektedir. Makrofaj ölçümü için, 1X elektronik zum tek taramalar genotipi için 10 alanları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bozulmamış makrofajlar, sırasıyla PKH26 ve membran ve çekirdeğin DAPI lekelemesi göre tespit edilmiştir. Konidya FITC ifadesi ve parlak bir alan görüntüye göre belirlenmiştir. <ol><li> Steril lamelleri ve tabak hazırlayın <ol><li> Bir Biyolojik Güvenlik Kabinesi altında,% 70 etano 22 x 22 mm cam lamelleri emmek5-10 dakika için l. </li><li> Steril PBS lamelleri durulayın. </li><li> Steril forseps kullanılarak, yumuşak, tek başına steril paketlenmiş 6 oyuklu plakanın her bir alt tek bir lamel yerleştirin. </li></ol></li><li> Tohum ~ 1 x 10 6 PKH26 her bir lamel üzerine alveolar RPMI 1640 300 ul içerisinde süspansiyon haline makrofajlar,% 10 FBS etiketli hasat edildi. Tam sayı hasat verimi bağlı olarak değişebilir. </li><li> Makrofaj gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilerek uygun izin verin. </li><li> Sonraki sabah, yaklaşık 1 x 10 7 GFP-ifade A. eklemek fumigatus conidia 100 ul önceden ısıtılmış (37 ° C) RPMI 1640,% 10 FBS içinde süspanse. </li><li> % 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör plaka dönün. </li><li> Hücreler, 4 ° C&#39;de ya da gece boyunca oda sıcaklığında 2 saat arasında, en az sabit olmalıdır Eşit her bir% 2 formaldehit hacmi de (nihai konsantrasyon% 1 formaldehit) ilave edilerek 3, 7 ve 14 saat düzeltme hücre. Için yer plakalarıgece boyunca 4 ° C &#39;de, erken zaman noktalarında. Son zaman noktasında (14 saat) için, 2 saat boyunca oda sıcaklığında hücreleri saptamak. </li><li> Fiksasyon sonra, yavaşça forseps kullanarak lamelleri kaldırmak ve DPBS&#39;de durulayın. </li><li> Katlanmış Kimwipe lamel kenarına koyarak fazla sıvıyı çıkarın. </li><li> Bir cam mikroskop lamı DAPI ile 6 ul floresan montaj orta uygulayın. </li><li> Slayt üzerinde lamel bir kenarını yatırın ve yavaşça montaj ortama hücre aşağı tarafı bırakın. Orta montaj yayılmış ve lamel altında düz bir tabaka oluşturacak. Lamel basın gerek yoktur. </li><li> Şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarları mühür ve kurumaya bırakın. </li><li> Mağaza konfokal mikroskopi ile analiz etmek için hazır olana kadar oda sıcaklığında (ışıktan korunarak) slayt kutu içinde hazırlanan slaytlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Reeves, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K++flux.">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416, 291-297 (2002).</li><li>Bianchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2622 (2009).</li><li>Vethanayagam, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NADPH+oxidase+versus+neutrophil+proteases+in+antimicrobial+host+defense.">Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-+and+Macrophage-Targeted+NADPH+Oxidase+Mediates+Antifungal+Host+Defense+and+Regulation+of+Acute+Inflammation+in+Mice.">Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice.</a> The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes.">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li><li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates.">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li><li>Cornish, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase-independent+resistance+to+Aspergillus+fumigatus+in+alveolar+macrophages.">Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages.</a> J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).</li><li>Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+recruited+to+the+lungs+of+mice+during+immune+inflammation+ingest+apoptotic+cells+poorly.">Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).</li><li>Davidson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCRIMINATION+OF+RESIDENT+AND+INFILTRATED+ALVEOLAR+MACROPHAGES+BY+FLOW+CYTOMETRY+IN+INFLUENZA+A+VIRUS-INFECTED+MICE.">DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE.</a> Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).</li><li>Gelderman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+suppress+T+cell+responses+and+arthritis+development+in+mice+by+producing+reactive+oxygen+species.">Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species.</a> J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).</li><li>Pizzolla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+produced+by+the+NADPH+oxidase+2+complex+in+monocytes+protect+mice+from+bacterial+infections.">Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections.</a> J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).</li><li>Luther, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+phagocytic+uptake+of+Aspergillus+fumigatus+conidia+by+macrophages.">Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages.</a> Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).</li><li>Geunes-Boyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Protein+D+Increases+Phagocytosis+of+Hypocapsular+Cryptococcus+neoformans+by+Murine+Macrophages+and+Enhances+Fungal+Survival.">Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival.</a> Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).</li><li>Garc&#237;a-Rodas, R., Gonz&#225;lez-Camacho, F., Rodr&#237;guez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interaction+between+Candida+krusei+and+Murine+Macrophages+Results+in+Multiple+Outcomes,+Including+Intracellular+Survival+and+Escape+from+Killing.">The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing.</a> Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).</li><li>Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+from+C3H/HeJ+mice+show+sensitivity+to+endotoxin.">Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+polarization+of+alveolar+macrophages+and+bone+marrow-derived+monocytes+following+chemically+and+pathogen-induced+chronic+lung+inflammation.">Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation.</a> J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+spores+depends+on+the+anatomical+source+of+the+macrophage.">Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage.</a> Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).</li><li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells.">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Birlikte in vivo fungal okuma ile makrofaj antifungal aktivitenin ex vivo analiz için, bu yaklaşımı kullanarak, daha önce makrofajlarda NADPH oksidaz A&#39;ya karşı savunmasında önemli bir rol oynadığını göstermiştir fumigatus 4. Izole alveolar makrofaj kullanılması, in vivo olarak Aspergillus karşı savunmak için diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, nötrofiller işe) yokluğunda, mantarlarla mücadele etkinlikleri odaklanma sa...

Alveoler makrofajlar inhale mikropları karşılaşmaya ilk basamak fagositik hücrelerdir. Makrofajlar, patojen tanıma reseptörleri tarafından Aspergillus motiflerini tanımak yemek ve teneffüs sporlar (konidia) büyümesini sınırlamak ve enflamatuar cevabı başlatabilir. Fagosit NADPH oksidaz, süperoksit anyon ve aşağı doğru, reaktif oksijen ara (ROI) moleküler oksijen dönüştürür. Kronik granülomatöz hastalık (ÇGD) ciddi bakteriyel ve fungal enfeksiyonlar ve aşırı inflamatuar yanıtlar ile karakterize NADPH oksidaz kalıtsal bir hastalıktır. NADPH oksidaz kritik olmasına rağmen nötrofil aracılı konakçı savunması için 1-3, makrofajlarda NADPH oksidaz önemi iyi tanımlanmış değildir. Önceki çalışmalar nötrofiller esas hifal sahne 5 hedef ise alveolar makrofajlar, yemek ve Aspergillus sporlar öldürmek olduğunu göstermiştir. Ancak, çelişkili resul olmuşturA. büyümesinin kontrolünde makrofajda NADPH oksidaz rolüne olarak ts fumigatus 6, 7 sporlar. Bu yöntemin amacı, bir ev sahibi savunma A&#39;ya karşı aracılık makrofajlarda NADPH oksidazın belirli bir rolü olduğunu tanımlamak için fumigatus sporlar. Biz, alveoler makrofajlar içinde NADPH oksidaz fagosite A. büyümesini kontrol bulundu fumigatus 4 sporlar. En yakından inhale mantarlara konak yanıtı modellemek için, uyarılmamış farelerin hemen kurban aşağıdaki bronkoalveoler lavaj ile hasat alveol makrofajlar kullanılır. İzole Alveoler makrofaj kullanımı in vivo Aspergillus&#39;a karşı savunmak, diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, işe nötrofiller) yokluğunda kendi antifungaldir odaklanmak sağladı. Bu yöntemde, alveolar makrofajlar hasat sonrası işleme miktarını en aza indirmek için hasattan önce in vivo olarak boyandı. &#39;/ P&gt; Bu protokol için diğer bir avantajı, bir GFP-ifade A. kullanılmasıdır fumigatus suşu. Bu mantar hifal aşamasında konidial aşamasından GFP ifade ve daha fazla boyanma ihtiyacı yok. Daha ayrıntılı görüntüler elde etmek için, elde edilen görüntülerin üç boyutlu yapıların yeniden sağlayan konfokal mikroskopi seçti. Üç boyutlu rekonstrüksiyon hif bir makrofaj veya yoluyla çevresinde büyüyen ziyade ayırt yeteneği verir. Konidya ayrıca ekstraselüler karşı hücre içi gibi hassas ayırt edilebilir.

<table><tbody><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Used to make AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>Used to make AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;#039;s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>22 G x 1.00 inch i.v. catheter</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard Winged</td></tr><tr><td>Insulin syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 ml Syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-way stopcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>Suture thread</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gauze sponges (4 inch square)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>heat inactivated</td></tr><tr><td>Hema 3 Stain Set</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td><td>BD</td><td>297252</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aspergillus fumigatous&lt;/em&gt; strain expressing green fluorescent protein</td><td></td><td></td><td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m Cell strainers</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet Class II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM1000 light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td>37 &amp;deg;C, 5%&amp;nbsp; CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>22 x 22 mm micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>glass coverslips</td></tr><tr><td>6-well Cell culture plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP2 system with a laser point scanner</td><td></td><td></td><td>Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope</td></tr></tbody></table>

assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy

Akciğer konak hücreler rutin mikropların ve mikrobiyal ürünlere maruz bir arayüz. Alveoler makrofajlar inhale mantar ve diğer mikropları karşılaşmaya ilk basamak fagositik hücrelerdir. Makrofajlar ve diğer bağışıklık hücreleri, patojen tanıyan reseptörler ile Aspergillus motifleri tanımak ve alt-enflamatuar cevap başlar. Phagocyte NADPH oksidaz reaktif oksijen ara ürünleri (ROI) üretir ve konak savunma için önemlidir. NADPH oksidaz kritik olmasına rağmen nötrofil aracılı konakçı savunması için 1-3, makrofajlarda NADPH oksidaz önemi iyi tanımlanmış değildir. Bu çalışmanın amacı A&#39;ya karşı konak savunmasını arabuluculuk makrofajlarda NADPH oksidaz belirli bir rol tasvir oldu fumigatus. Biz, alveoler makrofajlar içinde NADPH oksidaz fagosite A. büyümesini kontrol bulundu fumigatus 4 sporlar. Burada, fare yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem tariffagosite Aspergillus sporlar (conidia) büyümesini kontrol etmek için lveolar makrofajlar (AMS). Alveol makrofajlarının, in vivo olarak, lekeli ve on gün sonra, bronkoalveoler lavaj (BAL) ile farelerden izole edilmiştir. Makrofajlar, cam kapak slipleri üzerine plakalanmıştır, daha sonra yeşil floresan protein (GFP)-ifade eden A ile tohumlandı fumigatus sporlar. Belirtilen zamanlarda, hücreler sabitlenir ve fagosite sporlarla sağlam makrofaj sayısının konfokal mikroskobu ile tespit edilir.

<html> Stimüle edilmemiş farelerden BAL ile alveolar makrofajlar Toplama sitoloji göre bir&gt;% 95 saf bir nüfus neden olur. 3 ve 7 saat (Şekil 2) saat puan fungal büyümenin hipal aşamasını önüne ve genotipler arasında konidia fagositik etkinliğinin karşılaştırılmasına olanak sağlar. Genotipleri doku invazif hipal aşamasına fagosite konidianın geçişi (Şekil 3) inhibe etme yeteneği ile ilgili karşılaştırılabilir burada 14 saat bir zaman noktasıdır. Bozul...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy at JoVE.com

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Konfokal mikroskopi tarafından fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol için izole edilmiş fare alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Görüntüleme.  Roswell Park Cancer Institute.  Konfokal mikroskopi tarafından fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol için izole edilmiş fare alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem. 

Video: Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Biyomühendislik

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

Tıp

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

Ozon Maruziyetinden Sonra Alveoler Makrofaj Eferositozun Vivo Değerlendirilmesi

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and immunological tolerance, while in immunocompromised patients, conidia can colonize airways and cause severe invasive respiratory disorders. Various cells in different airway compartments are involved in the immune response that prevents fungal invasion; however, the spatio-temporal aspects of pathogen elimination are still not completely understood. Three-dimensional (3D) imaging of optically cleared whole-mount organs, particularly the lungs of experimental mice, permits detection of fluorescently labeled pathogens in the airways at different time points after infection. In the present study, we describe an experimental setup to perform a quantitative analysis of A. fumigatus conidia distribution in the airways. Using fluorescent confocal laser scanning microscopy (CLSM), we traced the location of fluorescently labeled&#160;conidia in the bronchial branches and the alveolar compartment 6 hours after oropharyngeal application to mice. The approach described here was previously used for detection of the precise pathogen location and identification of the pathogen-interacting cells at different phases of the immune response. The experimental setup can be used to estimate the kinetics of the pathogen elimination in different pathological conditions.

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

We describe the method for quantitative analysis of the distribution of Aspergillus fumigatus conidia (3 &#181;m in size) in the airways of mice. The method also can be used for the analysis of microparticles and nanoparticle agglomerate distribution in the airways in various pathological condition models.

Tüm Mount Optik Olarak Temizlenmiş Fare Akciğerinde Aspergillus fumigatus Conidia Dağılımının Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Tabanlı Nicel Analizi

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

Makrofajların Mantar Temizleme Etkinliği

Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial phagocytosis is a key process that allows for the investigation of the cytoplasmic and molecular events involved in macrophage-pathogen interactions, as well as for the determination of the time of death of internalized conidia. The technique involving the phagocytosis of fungal conidia by macrophages is widely used for studies evaluating the modulation of the immune responses against fungi. The evasion of phagocytosis and escape of phagosomes are mechanisms of fungal virulence. Here, we report the methods that can be used for the analysis of the phagocytosis, clearance, and viability of T. stromaticum conidia, a fungus which is used as a biocontrol and biofertilizer agent and is capable of inducing human infections. The protocol consists of 1) Trichoderma culture, 2) washing to obtain conidia, 3) the isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the polysucrose solution method and the differentiation of the PBMCs into macrophages, 4) an in vitro phagocytosis method using round glass coverslips and coloration, and 5) a clearance assay to assess the conidia viability after conidia phagocytosis. In summary, these techniques can be used to measure the&#160;fungal clearance efficiency of macrophages.

Yazar Spotlight: Trichoderma stromaticum ve Memeli Bağışıklık Sistemi Arasındaki Etkileşimin Çözülmesi

The technique involving the phagocytosis of fungal conidia by macrophages is widely used for studies evaluating the modulation of the immune responses against fungi. The purpose of this manuscript is to present a method for evaluating the phagocytosis and clearance abilities of human peripheral blood mononuclear-derived macrophages stimulated with Trichoderma stromaticum conidia.

İnsan Periferik Kanı Mononükleer Kaynaklı Makrofajlar İçinde Trichoderma stromaticum Conidia'nın Canlılık Testi

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial ...