Pseudomonas aeruginosa Bir BSL-2 düzeyi patojendir. Bu organizmayı kullanırken tüm BSL-2 düzeyinde güvenlik uygulamalarını takip etmeyi unutmayın. Burada farelerde primer hücre izolasyonu, in vitro fagositoz, fagositik yol analizi, in vivo fagositoz ve bakteriyel klirens değerlendirmesi göstereceğiz.
Başarılı intratrakeal doğum master uygulama gerektirir. Mikrosprayer düzgün yüklü olduğundan emin olun, iğne iki ses kıvrımları arasında, ve piston hızı düzgün kontrol edilir. Kağıt havlularla kaplı bir diseksiyon tahtasına yayılmış uzuvları ile supine pozisyonda fareyi güvence altına alarak başlayın ve ön dişlerin altında bir ip bağlayarak başın altına çekerek trakeadüz ve düz bir konuma getirin.
Fareyi %70 etanol ile dezenfekte edin ve vücudun orta hattındaki deriyi yukarı çekmek için düzenli çerkedikler kullanın. Karından boğazın üst kısmına kadar cildi kesmek için cerrahi makas kullanın. Dikkatle boğaz kas ve bağ dokuları incelemek için standart cerrahi makas künt ucunu kullanın.
Göğüs kafesinin altındaki karın duvarını aç. Diyaframı kesin ve göğüs kafesinin alt kısmını kesilerek akciğerleri kısmen açığa çıkar. Trakea ortaya çıkarmak için bahar makası kullanın ve bir kıkırdak halkası kavramak için çiflik kullanın.
Dikkatle trakea ventral yüzünde yaklaşık 1,5 milimetrelik bir kesi yapmak için mikro makas kullanın. Trakeanın altına kısa bir dikiş ipliği uzunluğunu dikkatlice dizin ve trakeaya 18 gauge kanül yerleştirin. Kanül yerinde olduğunda, yavaşça yıkama başına taze PBS bir mililitre ile akciğer üç kez lavaj, yavaşça tekrar akciğer içine üç kez arka arkaya geri dizginlemeden önce şırınga içine sıvı çekilmesi.
Her lavajdan sonra, toplanan bronkoalveoler lavaj sıvısını veya BALF'ı toplam hasat edilen sıvının santrifüjü için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. İkinci bir santrifüj için taze PBS bir mililitre pelet resuspend ve Dulbecco's Modifiye Eagles Orta veya DMEM iki mililitre içine yıkanmış alveoler makrofajlar resuspend 10% ısı-inaktive olmayan fetal sığır serum uymaktadır. Daha sonra birincil alveoler makrofajları bir hücre kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede iki günlük kültürleri için cam dipli Petri kabına aktarın.
48 saat sonra, kültürü iki mililitre taze orta ile beslemeden önce bir mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra, bir hücre kuluçka 37 santigrat derece bir saatlik kuluçka için kültüre hücre başına 50 iki mikrometre çapında karboksinize lateks FITC konjuge boncuk ekleyin. Kuluçka sonunda, ekstrasellüler boncukları çıkarmak için tabağı yıkama başına bir mililitre taze PBS ile beş kez kapsamlı bir şekilde yıkayın ve hücre içi boncukları içeren hücreleri saymak için rastgele 100 hücreyi görüntüleyin.
Bir opsonizasyon tahlili için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tavşan anti-SRBC immünglobulin M veya IgM 50 mikrolitre ile sekizinci koyun kırmızı kan hücreleri veya SRBCs iki kez 10 kuluçka. Daha sonra, IgM kaplı SRBC'lerde C3b ve C3b inhibitörü kompleman parçalarını onarmak için 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede 50 mikrolitre C5 eksikliği olan insan serumu ile opsonize Edilmiş SRBC'leri kuluçkaya yatırın. Daha sonra, medya aspire ve bir kez 10 mikrolitre ekleyin yedi opsonized SRBCs orta mililitre başına bir 96-iyi plaka her kuyuya bir kez 10 içeren dördüncü gecede kültürlü ürinen makrofajlar başına.
SRBC fare makrofaj coculture bir saat için 37 santigrat derece ve sonra bir dakika için amonyum klorür potasyum lisis tampon 100 mikrolitre ile yıkayarak bağlanmamış SRBCs kaldırın. Bağlanmamış SRBC'ler çıkarıldıktan sonra, 100 mikrolitre ortamla durulanın. Kalan hücreleri %0.1 sodyum dodecyl sülfat ile inceleyin ve lysatları %3 hidrojen peroksit ve altı molar üre ile takviye edilmiş 50 mikrolitre 2, 7-diaminoflorene ile tedavi edin.
Daha sonra 620 nanometre de bir spektrofotometre üzerinde hemoglobin katalize flormavi oluşumunun absorbe ölçmek. Fagosirize opsonized SRBCs sayısını belirlemek için SRBCs bilinen sayıda 620 nanometre absorbans değerleri standart bir eğri kullanın. Desen tanıma reseptör aracılı fagositoz değerlendirmek için, PBS bir mililitre ile iki günlük kültürlü fare birincil alveoler makrofajlar yıkayın ve 100 Alexa flor-488 konjuge Zymosan-A-biyotaneleri içeren taze orta 500 mikrolitre ile hücreleri tedavi.
37 santigrat derecede bir saat sonra, 500 mikrolitre buz gibi PBS ile fagositozun durulayın ve hücreleri yıkama başına bir mililitre PBS ile beş kez kapsamlı bir şekilde yıkayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile hücreleri düzeltmek ve gösterildiği gibi hücreleri beş kez daha yıkayın. Son yıkamadan sonra, zymosan-A-biyopartikül içeren alveoler makrofajların sayısını ölçmek için 488 nanometredidiferdiyal girişim kontrastı ve floresan kanal altında görüntüleme için 500 mikrolitre taze PBS ile hücreleri kaplayın.
In vivo alveolar makrofaj fagositoz değerlendirmesi için, anestezili bir farede parmak kıskacına yanıt eksikliği ile sedasyon uygun düzeyde onaylamak ve üst kesici dişleraltında plastik bir tel ile düz bir tahta üzerinde fare yerleştirin. Fareyi 45 derecelik bir pozisyonda, ventral yüzey yukarı bakacak şekilde yarı recumbent bir bükükle yerleştirin ve dili çıkarmak ve bastırmak için kavisli forceps kullanın. Daha sonra ses kıvrımları arasında bir mikrosprayer yerleştirin intratrakeal beş kez 50 mikrolitre yönetmek için 10 anestezi lihayvanın akciğerlerine P.aeruginosa GFP altı koloni oluşturan birimleri.
Mikrosprayer iğne trakea olduğunu doğrulamak için, yavaşça şırınga hareket ve iğnenin her iki tarafında ses kıvrımları gözlemlemek. Enfeksiyondan bir saat sonra lavaj sıvısını az önce gösterildiği gibi toplayın ve alveoler makrofajları santrifüj le peletleyin. Bir cam slayt üzerine sitosantrifüj için taze PBS 100 mikrolitre üçüncü hücrelere bir kez 10 resuspend.
Sonra farklı alveoler makrofajlar, nötrofiller ve lenfositler için sitospun slaytlar leke, standart histokimyasal protokollere göre. Rastgele 100 alveoler makrofajlar seçin bu fagositoz bakterilerin hücrelerin yüzdesini ölçmek için. In vivo bakteri temizleme denemesinde, intratülal olarak yaklaşık 2,5 ila beş kez bir sublethal dozu enjekte 10 P.aeruginosa mililitre başına beşinci koloni oluşturan birimleri anestezi vahşi tip ve mutant fareler içine ve altı gün boyunca her hayvanın vücut ağırlığını ölçmek.
İkinci denemede, p.aeruginosa mililitre doz başına yedi koloni oluşturan birimleri ölümcül üç kez 10 ile yabani tip ve mutant fareler yeni bir dizi enjekte ve bir enjeksiyon iki gün içinde mortalite kaydetmek, ölüm sırasında veya iki gün en yüksek enfeksiyon akciğer bakteriyel yükünün sayısallaştırılması için enjeksiyondan sonra tüm akciğer dokusu toplama. Akciğerleri hasat ettikten sonra, akciğer örneklerini buz üzerinde küçük parçalara ayırın ve ayarlanmış bir elektrikli homogenizer ayarı kullanarak akciğer parçalarını homojenize edin. Sonra 10 kat seri seyreltmeler pseudomonas izolasyon agar plakaları üzerine homojen homojen 100 mikrolitre plaka.
Floresan mikroskopisi, FITC lateks boncuklarının fare primer alveoler makrofaj fagositozunun bir saatlik kuluçkadan sonra ortaya çıktığını ve TRIM72 nakavt makrofajlarının önemli ölçüde daha yüksek fagositik yeteneği gösterdiğini ortaya koymaktadır. Tersine, murine makrofaj hücrelerinde işlevi bilinmeyen bir protein olan TRIM72'nin aşırı ekspresyonu, kompleman fagositizinde beş kattan fazla azalmaya neden olur. Alexa flor-488 konjuge Zymosan-A parçacıkları, ancak, birincil alveoler makrofajlar ya vahşi tip veya nakavt fareler izole tarafından eşit miktarda yutuldu.
Yabani tip ve nakavt hayvanlardan elde edilen BALF'nin diferansiyel boyaması benzer sayıda makrofaj ı, nakavt farelerden toplanan makrofajlar için daha yüksek fagositik yeteneği ortaya koymaktadır. Ayrıca, TRIM72 nakavt fareler vücut ağırlıkları daha hızlı bir iyileşme göstermek, onların hayatta kalma korumak, ve intratrakeal P.aeruginosa uygulama dan sonra vahşi tip hayvanlara göre daha düşük bir bakteriyel yük sergilemek. Bu teknik kullanılarak, nötrofil fagosititaz gibi pnömoni için önemli olan diğer fagositik süreçler ve bakteri temizliğinde diğer fagositlerin göreceli katkısı analiz edilebilir.
Farmakolojik inhibitörleri ile birlikte, adaptif transfer, ve transgenik hayvanlar, bu teknik araştırmacılar ilgi fagositler için fagositoz belirli tip moleküler bileşeni keşfetmek için yardımcı olabilir.
