Diese Arbeit wurde unter USDA-ARS CRIS Projekt 5325-42000-037-00D und mit Ergebnissen aus CRADA 58-3K95-7-1198 und TFCA 58-5325-8-419 durchgeführt. Die Autoren danken Suterra für die Gabe des (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, B. Higbee für fruchtbare Diskussionen und J. Baker, um technische Unterstützung.

1. Vorbereitung von flüchtigen Stoffen aus der Wirtspflanze für EAG Screening entdeckt <ol><li> Nach entsprechender Identifizierung und Authentifizierung aller flüchtigen Bestandteile via GC-MS, führen EAG puff Analyse der einzelnen flüchtigen verfügbar. Das anfängliche Screening kann eine niedrige Anzahl von Wiederholungen Antennallobus Antworten (N = 3-5) für jedes Geschlecht sein, um eine Anzeige der relativen chemoreceptivity in einer kurzen Zeit (Tabelle 1) zu erreichen. </li><li> Eine Lösung aus jedem flüchtigen bei einer 5 mg / ml-Konzentration in Pentan. Dicht verschließen und kühl stellen, bis die Probe für den sofortigen Einsatz (z. B. Acetophenon, Dichte = 1,03 g / ml, volume = (0,005 g/1.03 g / ml) × 1.000 = 4,85 ul von Acetophenon in ein 1,0 ml-Messkolben und zu verdünnen 1,0 ml mit Pentan). </li><li> Unmittelbar vor der Analyse EAG, entfernen die Fläschchen, die 5 mg / ml Konzentration an flüchtigen Stoffen zu prüfenden und zu ermöglichen, sich auf Raumtemperatur erwärmen. Inzwischen bezeichnen die richtige Anzahl von Pasteurpipetten zukorrelieren mit jedem flüchtigen getestet werden soll, und wickeln Sie ein kleines Stück Parafilm (ca. 15 × 15 mm) über die Spitze der Pipette. Für die erste Screening-10 Stimulus Pipetten (N = 4 für jede männliche und weibliche) werden im Falle einer schlechten Vorbereitung oder andere unvorhergesehene Hindernisse geladen. </li><li> Mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig falten Sie den Bioassay Scheibe in zwei Hälften, um die Platzierung in die Pipette zu erleichtern, dann legen Sie die teilweise gefalteten Disc in das große Ende der Pipette, so dass ca. 2-3 mm von der Platte ausgesetzt sind. Richten Sie die markierte und vorbereitet Pipetten in einem Rack Halter. </li><li> Mit einer Pipette oder Spritze, laden 10 l (50 g) von flüchtigen Lösung auf jeder Disc und warten Sie 2 Minuten, bevor das Einlegen von Medien in vollem Umfang in die Pipette passieren. Einmal geladen, sofort verschließen Sie das Ende der Pipette mit Parafilm (ca. 15 × 30 mm). Die Menge an flüchtigen Reiz zu verladen und aufgeblasen werden, wird höchstwahrscheinlich mit Insekten Arten variieren. </li><li> Nach dem gleichen Protokoll oben erwähnt vorbereitet Steuerelementegehören in jeder Analyse. Für die Negativkontrolle Last von nur 10 l Pentan auf jeder Disc, 2 Minuten warten, laden in den gekennzeichneten Pipette und Dichtung. Für die positive Kontrolle, laden 10 l (50 g) auf die Disc, 2 Minuten warten, Last in den gekennzeichneten Pipette und Dichtung mit Parafilm. </li><li> Die Lebensfähigkeit des Insekts antennalen prep wird höchstwahrscheinlich mit Arten variieren, aber wir haben festgestellt, dass Amyelois transitella Antennen in der Regel aktiv bleiben und konsequent für&gt; 30 Minuten nach der Exzision mit dem beschriebenen Protokoll. Diese Zeit wird im Allgemeinen bis auf 4-10 flüchtigen Proben ausgewertet werden können. Tabelle 2 gibt ein Beispiel von Malen und Sequenzen. </li></ol> 2. Vorbereitung der Insektenfühler für EAG Bioassay <ol><li> Der Schwerpunkt dieses Experiment wird EAG-Analyse, so die Annahme, dass jeder Prüfer den Zugriff auf entsprechend aufgezogen Insekten haben. </li><li> Für dieses Experiment werden wir studieren 3-4 Tage old, gepaart männlichen und weiblichen Motten. Individuelle Motten sind in einem kleinen, mit Deckel, Kunststoff-Behälter der Tag der Analyse übertragen. Unmittelbar vor der Bioassay wird die Motte zu prüfenden Kopf voran in eine Haltevorrichtung (dh aus verschiedenen Kunststoff-Pipettenspitzen) und von hinten gesichert übertragen. Manipulation des Insekts kann unter einer Low-Power-Stereo-Mikroskop zu erleichtern Exzision angesehen werden. </li><li> Antennen werden mit Hilfe einer Draht-bestückten Werkzeug gehänselt. Die Gabelhalter, mit einem kleinen Film aus Elektroden-Gel, in unmittelbarer Nähe für die schnelle Übertragung von Antennen angeordnet. Die erste Antenne ist mit Mikroscheren ausgeschnitten und auf der Gabel, die Gewährleistung der Basis der Antenne ist auf der nicht-roten Teil der Gabel (die indifferente Masseelektrode) angeordnet ist. Ein Timer-Set für 10 Minuten gestartet wird und die zweite Antenne wird herausgeschnitten und neben der ersten Antenne mit beiden Basen auf der gleichen Seite der Gabel. </li><li> Alternativ können die Antennen links befestigt werden im holding Tube, ausgeschnitten, dann sanft von zwischen dem Rohr und das Insekt unter Verwendung eines Draht-Werkzeug aus den festen mit einem Klecks Gel am Ende entfernt. </li><li> Antennen werden überprüft, um sicherzustellen, dass die Basis und der Spitze in Elektroden-Gel getaucht werden und keine Blasen in dem Gel. Die Enden / Tipps können getrimmt werden, um volle Exposition gegenüber dem Elektroden-Gel zu gewährleisten. Es sollte sichergestellt werden, dass der Rest jeder Antenne nicht mit Gel bedeckt, so garantieren maximale Antennallobus Oberfläche wird auf der Zug ausgesetzt werden. </li><li> Das vorbereitete Gabel wird dann in die Sonde Vorverstärker eingesetzt und unter einem konstanten Strom von befeuchteter Luft bei 200 ml / min für die verbleibende Zeit der 10 minütigen Wartezeit. Die Verbrauchsteuern Zeit und EAG Initiation mal notiert (Tabelle 2) und 30 Sekunden vor dem ersten Stimulus puff, die Pipette mit der positiven Kontrolle wird entsiegelt und in die Halterung, die eingestellt wird, um direkte Flugverbindung / puff Flow von 2-3 mm die Antennen vorbereitet. </li><li> Nach jedem experiment werden die Test-Motten in einem Trockeneis-Umgebung eingeschläfert und fachgerecht entsorgt. </li><li> Weibliche Motten werden seziert der Paarung Status zu überprüfen. Cohabitating Männchen verpaart angenommen haben. </li></ol> 3. EAG-Protokoll für die einzelnen Komponenten <ol><li> Antennalen Antworten werden über die Software mit dem AutoSpike Syntech EAG Instrument enthalten aufgezeichnet. Die Konfiguration im AutoSpike Registerkarte Eigenschaften für den Kanal mit dem EAG-Sonde wird mit einer Abtastrate von 106,7, NEIN zu beheben, und einen Filter von 0-42 Hz eingestellt. Für die Registerkarte Filter, ist die EAG-Filter ON und die Low-Cutoff auf 0,1 Hz eingestellt. </li><li> Stimulus Puffs sind in 1-2 Sekunden Dauer. Ein Timer für 1 Minute eingestellt ist nach jedem Zug gestartet. </li><li> Der nächste Test flüchtigen Pipette wird entsiegelt und in die Halterung ein. Die Reihenfolge der Tests flüchtigen, randomisierte zwischen läuft, um sicherzustellen, keine Testverbindungen konsequent einen weiteren Test flüchtig ist, wird dann folgte (z. B. Tabelle 2) sorgfältig allowing 1 Minute zwischen den Zügen. </li><li> Um eine einfache Lesen EAG Antworten zu erleichtern, werden Teile der Lineale auf dem Bildschirm platziert, und die Grundlinie Ebene der Spitze der Auslenkung nach unten Signal wird in mm gemessen und protokolliert auf einem Datenblatt (dh für die Einstellung 5 mV, 33 mm = 2,5 mV). Die Software hat die Fähigkeit der Wiedergabe der gespeicherten Aufnahmen für eine spätere Analyse. Umrechnung von mm zu beiden mV oder uV Amplitude wird in späteren Datenanalyse durchgeführt. </li><li> Nach dem letzten Zug positive Kontrolle (zB Eintrag # 12) verabreicht wird, die Antennen entfernt werden, wird die Gabel mit einem Ethanol-gesättigten Wischen gereinigt und gelassen, bevor nachfolgende Verwendung zu trocknen. </li><li> Um den Durchsatz des Assays erhöhen, kann die Entfernung der nächsten Gruppe von Antennen durch ein zweites Labor Personal ca. 10 Minuten vor dem Ende der aktuellen Experiment gestartet werden - nach dem vierten Zug, der zweite Test flüchtige des aktuellen Experiment, nach Tabelle 2. Auf diese Weise können for der Beginn des nächsten Versuch unmittelbar nach der aktuellen Experiment Enden. </li><li> Höhere Anzahl von Wiederholungen (auf verschiedenen Antennen) können auf Verbindungen von Interesse durchgeführt werden, um weitere statistische Validierung liefern. </li></ol> 4. Ein Beispiel für EAG Analyse von Mischungen oder anderen Matrices (Tabelle 3) <ol><li> Als nächstes werden die Verhältnisse und Volumina für zwei tertiären Mischungen (3-Komponenten-Mischungen) berechnet, um ein Beispiel der Kombination von flüchtigen Hervorrufen hohen EAG Reaktionen (Tabelle 4) bereitzustellen. Die Berechnungen sind für einige grundlegende Verhältnisse, einem 1:1:1-Molverhältnis von α-Humulen: 2-Undecanon: 2-Phenylethanol und dann den Vergleich zu einem zweiten Mischungsverhältnis von 1:2:4. </li><li> Mit ähnlichen Protokolle beschrieben, die Mischungen hergestellt und etikettiert sind Pasteurpipetten werden zusammen mit den notwendigen positiven und negativen Kontrollen geladen. </li><li> Die flüchtigen Proben werden über männliche und weibliche Antennen aufgeblasen und die Antworten werden gemessen und protokolliert aufum ein Datenblatt (Tabelle 3). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Für weibliche Bauchnabel orangeworm die folgenden Einstellungen verwendet: 2 Sekunden Puffs, 10 Sekunden Aufnahmezeit, 10 Sekunden-Fenster, und 5 mV Skala. Eine negative Ablenkung ist die typische Antwort, doch der absolute Wert wird aufgezeichnet (zB -3.400 uV Auslenkung wird als 3400 uV aufgezeichnet). Eine relativ schwache Reaktion des prep mit der positiven Kontrolle wird verworfen. Abbildung 1 zeigt eine grafische Darstellung von einem schlechten Ansprechen auf die positive Kontrolle durch Nabel orangeworm. Zum Beispiel von einem schlechten Steuerung Ergebnis ist die durchschnittliche weibliche antennalen Reaktion auf Acetophenon in der Regel ca. 2600 uV (2), wenn die Vorbereitung gab nur eine Antwort von ca.. 1300 uV wäre es verworfen und ein anderes Paar von Antennen vorbereitet. In ähnlicher Weise die durchschnittliche männliche Reaktion auf (Z, Z) -11,13-war hexadecadienal typically 3000 uV; damit, jede Reaktion weniger als 1.500 uV wurde in der Regel verworfen. Die positive Kontrolle am Anfang und Ende jedes Experiments auch Informationen über den Zustand der Antennen. Eine Faustregel folgen wir für ein schnelles Screening ist, wenn die Antwort auf die antennalen puff der post-Kontrolle (Record Nr. 12, Tabelle 2) ist entweder weniger als 75% des 1. Blätterteig des Pre-Steuerung (Rekord # 1 , Tabelle 2) oder weniger als der 2. Zug der Pre-Steuerung (Record Nr. 2, Tabelle 2) dann wird das Experiment nicht in der Datenanalyse wegen der möglichen Verschlechterung des prep verwendet werden (Abbildung 3). Ein Beispiel für die erste Faustregel würde Rekord Nr. 1 sein = 2.730 uV und Record # 12 = 1680 uV; und die zweite Faustregel gilt, wenn Record # 2 = 2350 uV und Record # 12 = 1680 uV, In jedem dieser Fälle , würden die Vorbereitung und Experiment die Ergebnisse verworfen werden. Einrepräsentatives Beispiel für die Korrektur der EAG-Werte als Reaktion auf die positive Kontrolle gemessen würde wie folgt aussehen. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # </td><td> EAG (uV) </td><td> Run # 2 </td><td> EAG (uV) </td><td> Run # 3 </td><td> EAG (uV) </td></tr><tr><td> (+) Strg </td><td> 2800 </td><td> (+) Strg </td><td> 2420 </td><td> (+) Strg </td><td> 3030 </td></tr><tr><td> Ein Cmpnd </td><td> 3000 </td><td> Ein Cmpnd </td><td> 2500 </td><td> Ein Cmpnd </td><td> 3440 </td></tr><tr><td> (-) Strg </td><td> 530 </td><td> (-) Strg </td><td> 755 </td><td> (-) Strg </td><td> 910 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 2400 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2000 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2560 </td></tr><tr><td> (+) Strg </td><td> 2770 </td><td> (+) Strg </td><td> 2400 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3020 </td></tr></tbody></table> Unter Verwendung der Werte für einen N = 3 oben beschriebene Experiment wird die negative Kontrolle-Antwort von jedem Wert in jedem Experiment unter der Annahme, die negative Kontrolle ist die Grundlinie Antennallobus Reaktion auf die mechanische Zug und restliches Lösungsmittel abgezogen. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> EAG (uV) </td><td> Run # 2 </td><td> EAG (uV) </td><td> Run # 3 </td><td> EAG (uV) </td></tr><tr><td> (+) Strg </td><td> 2270 </td><td> (+) Strg </td><td> 1665 </td><td> (+) Strg </td><td> 2120 </td></tr><tr><td> Ein Cmpnd </td><td> 2470 </td><td> Ein Cmpnd </td><td> 1745 </td><td> Ein Cmpnd </td><td> 2530 </td></tr><tr><td> (-) Strg </td><td> 0 </td><td> (-) Strg </td><td> 0 </td><td> (-) Strg </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Cmpnd B</td><td> 1870 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1245 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1650 </td></tr><tr><td> (+) Strg </td><td> 2240 </td><td> (+) Strg </td><td> 1645 </td><td> (+) Strg </td><td> 2110 </td></tr></tbody></table> Die positiven Kontrollen für jedes Experiment würde dann gemittelt und korrigiert werden, um 1000 uV und stellt fest, das Verhältnis zur Korrektur bis 1.000 uV. Ein Datenblatt (zB Excel) können leicht manipuliert werden, um Antworten auf verwertbare Daten umgewandelt werden. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> Avg (uV) </td><td> Run # 2 </td><td> Avg (uV) </td><td> Run # 3 </td><td> Avg (uV) </td></tr><tr><td> (+) Strg </td><td> 2255 </td><td> (+) Strg </td><td> 1655 </td><td> (+) Strg </td><td> 2115 </td></tr><tr><td> (+) Strg adj. </td><td> 1000 (0.443) </td><td> (+) Strg adj. </td><td> 1000 (0.604) </td><td> (+) Strg adj. </td><td> 1000 (0.473) </td></tr></tbody></table> Die Multiplikation mit dem Korrekturverhältnis innerhalb jedes Experiment wurden die Werte für Verbindung A und Verbindung B werden dann eingestellt. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> Adj. EAG (uV) </td><td> Run # 2 </td><td> Adj. EAG (uV) </td><td> Run # 3 </td><td> Adj. EAG (uV) </td></tr><tr><td> Ein Cmpnd </td><td> 1094 </td><td> Ein Cmpnd </td><td> 1054 </td><td> Ein Cmpnd </td><td> 1197 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 828 </td><td> Cmpnd B </td><td> 752 </td><td> Cmpnd B </td><td> 780 </td></tr></tbody></table> Die Durchschnittswerte (Mittelwerte) für jede Verbindung werden dann zusammen mit anderen einschlägigen statistischen Daten und der EAG-Antworten für den getesteten Verbindungen bestimmt können anschließend ausgewertet werdenfür die Kandidatur für eine weitere Untersuchung. <table border="1"><tbody><tr><td> Verbindung </td><td> EAG (uV) </td><td> Nr. läuft, N = </td></tr><tr><td> Ein </td><td> 1115 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> B </td><td> 787 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table><img alt="1" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vertreter EAG für männliche antennalen Reaktion (1.180 uV) an den Pre-Steuerung (1 st positive Kontrolle Blätterteig), die aufgrund der schlechten antennalen Antwort wäre nach Sicherstellung der Antennen verworfen haben guten Kontakt mit dem Gel. Blaue Balken im unteren Fenster stellen die 2 Sekunden puff flüchtiger. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig2.jpg" /> <sTrong&gt; Abbildung 2. Vertreter EAG für die weibliche Antwort Fühlerglied (3.400 uV) auf der 1. Blätterteig Pre-Steuerelement, das als angemessen betrachtet werden würde. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter EAG für die weibliche Antwort Fühlerglied (1680 uV) auf die post-Kontrolle (letzte positive Kontrolle für jedes Experiment), die als arm werden würde, und suggestive Abbau von Antennen (&lt;75% vom 1. Vor-Steuer-oder &lt; 2. Blätterteig Wert von Pre-Steuerung). Für dieses Beispiel der 1. Pre-Steuerung puff war 2730 uV und 2. Vorregelung puff war 2350 uV. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig4.jpg" /> Abbildung 4. Vertreter EAG für die weibliche Antwort Fühlerglied (3.800 uV) an den Blätterteig eines Kandidaten flüchtige Mischung und den anschließenden Messungen der maximalen Anfangsauslenkung (3.800 uV), die anfängliche Steigung während der Zugzeit (0,3 mV = s/1.2 0,25 s / mV), und die Steigung für die restliche Dauer Blätterteig (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig5.jpg" /> Abbildung 5. Kleine modifizierte Gefäß, das eine Probenmatrix und die damit verbundenen flüchtigen Stoffe, über A. aufgeblasen werden transitella Antennen. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931table1.jpg" /> Tabelle 1. In sITU Emission von flüchtigen Nonpareil Mandeln (2007) und EAG Reaktionen durch eine andere und weniger empfindliche Konfiguration in der Autospike Programm bestimmt. <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931table2.jpg" /> Tabelle 2. Beispiel eines Formulars für die Aufzeichnung männlichen und weiblichen antennalen Antworten auf individuelle flüchtigen Bestandteilen. <img alt="Tabelle 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931table3.jpg" /> Tabelle 3. Beispiel eines Formulars für die Aufzeichnung männlichen und weiblichen antennalen Reaktionen auf flüchtige Mischungen und / oder Sträuße. <img alt="Tabelle 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931table4.jpg" /> Tabelle 4. Beispiele für die Herstellung von 10 ml einer 5 mg / ml Lösung für zwei verschiedene Verhältnisse von Mischungen. <img alt="Tabelle 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931table5.jpg" /> Tabelle 5. Beispiel der Form für die Aufnahme zwei Folgencutive Hauche des einzigen flüchtigen Komponenten über männliche und weibliche Antennen.

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Der Autor hat eine bestehende kooperative Forschung und Entwicklung Vereinbarung mit Paramount Farming Company, ein Unternehmen mit Verbindungen zu Suterra LLC.

Verwendung Elektroantennogramm Aufnahmen als Bioassay Chemorezeption Reaktionen ein Zielinsekt zu bestimmen ist recht üblich und zahlreiche Studien unter Verwendung EAG als Detektor für Ausfluss aus einem Gaschromatogramm (GC-EAD) in der Literatur gefunden werden. 9,10 Verfahren nachgewiesen wird ein schnelles Screening von äquivalenten Mengen an flüchtigen Komponenten mit hohen Wiederholungen für zuversichtlich Zuordnung der relativen Reaktionsfähigkeit geben. Das Programm in der AutoSpike Syntech Soft...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Acetophenon </td><td> Alfa-Aesar </td><td> A12727 </td><td> Weibliche positive Kontrolle </td></tr><tr><td> (Z, Z) -11,13-Hexadecadienal </td><td> Suterra </td><td></td><td> Männlich positive Kontrolle </td></tr><tr><td> α-Humulen </td><td> Aldrich </td><td> 53675 </td><td> Sesquiterpen </td></tr><tr><td> 2-Undecanon </td><td> Aldrich </td><td> U1303 </td><td> Fettsäurederivat </td></tr><tr><td> 2-Phenylethanol </td><td> Aldrich </td><td> 77861 </td><td> Benzoiden </td></tr><tr><td> Pentan </td><td> EMD </td><td> PX0167-1 </td><td> Lösungsmittel </td></tr><tr><td> 4-Kanal-Controller Erwerb </td><td> Syntech </td><td> IchDAC-4 </td><td></td></tr><tr><td> EAG-Sonde, Vorverstärker </td><td> Syntech </td><td> Typ PRG-2 </td><td></td></tr><tr><td> Antennenhalter </td><td> Syntech </td><td> Für PRG-2 </td><td> Fork Elektrode </td></tr><tr><td> Stimulus-Controller </td><td> Syntech </td><td> CS-55 </td><td> Luftdurchsatz und Puffs </td></tr><tr><td> Spectra Elektrodengel </td><td> Parker </td><td> 12-02 </td><td></td></tr><tr><td> Bioassay-Discs </td><td> Whatman </td><td> 2017-006 </td><td> 6 mm </td></tr><tr><td> Pasteurpipetten </td><td> VWR </td><td> 14673-010 </td><td> 5 ¾ &quot;(14,6 cm) </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> Bemis </td><td> PM-992 </td><td></td></tr></tbody></table>

electroantennographic bioassay as a screening tool for host plant volatiles

Pflanze flüchtigen spielen eine wichtige Rolle bei Pflanze-Insekt-Wechselwirkungen. Pflanzenfressende Insekten benutzen Pflanzen flüchtige Stoffe, wie Kairomonen bekannt, um ihre Wirtspflanze zu lokalisieren. 1,2 Wenn eine Wirtspflanze ist ein wichtiger Rohstoff agronomischen Fraßschäden durch Schädlinge können schwere wirtschaftliche Verluste für die Erzeuger zuzufügen. Dementsprechend kann Kairomonen als Lockmittel eingesetzt werden, um zu locken oder zu verwirren diese Insekten und bieten somit eine umweltfreundliche Alternative zu Pestiziden zur Schädlingsbekämpfung. 3 Leider Pflanzen können eine große Anzahl flüchtiger mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und Verhältnisse von Emissionen in Abhängigkeit von der Phänologie emittieren der Ware oder der Tageszeit. Dies macht die Identifizierung von biologisch aktiven Komponenten oder Mischungen von flüchtigen Komponenten ein mühsamer Prozess. Zur besseren Identifizierung der bioaktiven Komponenten der Wirtspflanze flüchtigen Emissionen setzen wir die Labor-basierte Screening-Bioassay Elektroantennographie (EAG). EAG ist ein effektives Instrument zur Bewertung und Record elektrophysiologisch die olfaktorischen Reaktionen eines Insektes über ihre antennalen Rezeptoren. Die EAG Screening-Verfahren kann dazu beitragen, die Zahl der flüchtigen Stoffe getestet, um vielversprechende biologisch aktiven Komponenten zu identifizieren. Allerdings EAG Bioassays nur Auskunft über Aktivierung von Rezeptoren. Sie enthält keine Informationen über die Art des Verhaltens von Insekten die Verbindung löst, was könnte als Lockmittel, abstoßend oder andere Art von Verhaltensreaktionen sein. Flüchtige Hervorrufen eine signifikante Antwort von EAG, bezogen auf eine geeignete positive Kontrolle, werden typischerweise auf einer weiteren Prüfung von Verhaltensreaktionen der Schädling aufgenommen. Das experimentelle Design präsentiert ausführlich die Methoden zu Mandel-basierte Wirtspflanze flüchtigen 4,5 durch Messung der elektrophysiologischen Reaktionen antennalen eines Erwachsenen Schädling Nabel orangeworm (Amyelois transitella), um einzelne Komponenten und einfache Mischungen von Komponenten über EAG Bioassay zu screenen. Das Verfahren nutzt zwei Exschnittene Antennen platziert über eine &quot;Gabel&quot; Elektrodenhalter. Das Protokoll hier gezeigt stellt eine schnelle, High-Throughput-standardisierten Verfahren zum Screening flüchtiger Bestandteile. Jeder flüchtig ist bei einer eingestellten, konstanten Menge als die Anregungspegel standardisieren und ermöglichen so Antennallobus Reaktionen als indikativ für die relative chemoreceptivity. Die negative Kontrolle hilft dabei, die elektrophysiologische Reaktion auf sowohl restliche Lösungsmittel und mechanische Kraft der Blätterteig. Die positive Kontrolle (in diesem Fall Acetophenon) ist eine einzige Verbindung, die ausgelöst eine kohärente Reaktion der männlichen und weiblichen Bauchnabel orangeworm (NOW) Motte hat. Ein weiterer Standard, der semiochemischen einheitliche Reaktion bereitstellt und für den Bioassay Studien mit dem männlichen NOW Motten, (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, ein Aldehyd-Komponente aus dem weiblichen hergestellten Sexualpheromon. 6-8

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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Verfahren schnell Bildschirm Wirtspflanze flüchtigen Stoffe durch Messung der elektrophysiologische Reaktion von erwachsenen Nabel orangeworm (<em&gt; Amyelois transitella</em&gt;)-Antennen, um einzelne Komponenten und Mischungen über elektroantennographischer Analyse nachgewiesen wird.

Elektroantennographischer Bioassay als Screening-Instrument für Wirtspflanzen Volatile

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

electroantennographic-bioassay-as-screening-tool-for-host-plant

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Aufrufe.  Agricultural Research Service. Verfahren schnell Bildschirm Wirtspflanze flüchtigen Stoffe durch Messung der elektrophysiologische Reaktion von erwachsenen Nabel orangeworm ( Amyelois transitella)-Antennen, um einzelne Komponenten und Mischungen über elektroantennographischer Analyse nachgewiesen wird.

Serie: Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

Eine β-Glucuronidase (GUS) Basierend Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Forschung

Biologie

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Herbivore-induzierte Blueberry Volatile und Intra-Anlage Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA-Katalysator als Reporter für Drogen-Screening gegen RNA-Editing in Trypanosomen

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Eine Platte-Wettbewerb-Assay als eine schnelle vorläufige Beurteilung der Krankheit Unterdrückung

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological processes. Advances in molecular microbiology have seen the emergence of diverse mutagenesis techniques for the manipulation of genes. Among them, transposon-insertion sequencing (Tn-seq) is a valuable tool to simultaneously assess the functionality of many candidate genes in an untargeted way. The technique has been key to identify&#160;molecular mechanisms for the colonization of eukaryotic hosts in several pathogenic microbes and a few beneficial symbionts.
Here, Tn-seq is established as a method to identify colonization factors in a mutualistic Burkholderia gladioli symbiont of the beetle Lagria villosa. By conjugation, Tn5 transposon-mediated insertion of an antibiotic-resistance cassette is&#160;carried out at random genomic locations in B. gladioli. To identify the effect of gene disruptions on the ability of the bacteria to colonize the beetle host, the generated B. gladioli transposon-mutant library is inoculated on the beetle eggs, while a control is grown in vitro in a liquid culture medium. After allowing sufficient time for colonization, DNA is extracted from the in vivo and in vitro grown libraries. Following a DNA library preparation protocol, the DNA samples are prepared for transposon-insertion sequencing. DNA fragments that contain the transposon-insert edge and flanking bacterial DNA are selected, and the mutation sites are determined by sequencing away from the transposon-insert edge. Finally, by analyzing and comparing the frequencies of each mutant between the in vivo and in vitro libraries, the importance of specific symbiont genes during beetle colonization can be predicted.