이 연구는 USDA-ARS 크리스틴 프로젝트 5325-42000-037-00D 아래와 CRADA 58-3K95-7-1198 및 TFCA 58-5325-8-419의 결과와 함께 실시되었다. 저자들은 기꺼이 그의 선물 Suterra을 인정 (지지) -11,13-hexadecadienal, 생산적 토론 B. Higbee, 기술 지원 J. 베이커.에게

1. 심사를 EAG에 대한 호스트 공장에서 포착한 휘발성 물질의 작성 <ol><li> GC-MS를 통해 모든 휘발성 물질의 적절한 식별 및 인증 후 사용 가능한 각 휘발성의 EAG 퍼프 분석을 수행합니다. 초기 검사 시간이 짧은 금액 (표 1)에 상대 chemoreceptivity의 표시를 달성하기 위해 각각의 섹스를 위해 antennal 반응 낮은 복제 번호 (N = 3-5) 될 수 있습니다. </li><li> pentane에 5 밀리그램 / ML 농도에서 각 휘발성의 솔루션을 준비합니다. 단단히 (예 : 아세토페논, 밀도 = 1.03 g / ML, 부피 = (0.005 g/1.03 G / ML) × 1,000 = 4.85 1.0 ML 용적 플라스크에 아세토페논의 μL와가 희석 즉시 사용 준비가 될 때까지 샘플을 밀봉하고 냉장 보관 1.0 pentane과 ML). </li><li> 직전 EAG 분석, 테스트하는 휘발성 물질의 5 밀리그램 / ML 농도를 포함하는 튜브를 제거하고 실내 온도를 따뜻하게 수 있습니다. 한편으로 파스퇴르의 pipettes의 적절한 수를 레이블테스트 각 휘발성와 연관 및 피펫의 팁을 통해 parafilm의 작은 조각 (15 ca. × 15mm)을 싸다. 초기 심사 열 자극 pipettes의 경우 (N은 = 4는 각각 남성과 여성을위한) 불량 준비이나 기타 예상치 못한 장애 발생시로드됩니다. </li><li> 족집게의 쌍을 사용하여 부드럽게 피펫으로 배치를 용이하게 반으로 bioassay 디스크를 접어 후 부분적으로 CA 있도록 피펫의 큰 끝에 접힌 디스크를 넣으십시오. 디스크의 2~3mm이 노출됩니다. 선반 홀더의 라벨 및 준비 pipettes을 맞춥니다. </li><li> pipettor이나 주사기를 사용하여, 각 디스크에 휘발성 용액의 10 μL (50 μg)를로드하고 완벽하게 피펫으로 디스크를 삽입하기 전에 합격 2 분 수 있습니다. 일단로드, 즉시 parafilm (15 ca. × 30mm)와 피펫의 끝을 밀봉. 로드되고 숨이 차서되는 휘발성 자극의 양은 대부분 곤충 종에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 동일한 프로토콜을 준수하면 위에서 언급한에 컨트롤을 준비각 분석에 포함됩니다. 각 디스크에 단지 pentane의 부정적인 제어 부하 10 μL 들어, 2 분 기다려 표시된 피펫으로로드 및 인감. 긍정적인 제어 들어, 디스크에 10 μL (50 μg)를로드 2 분 기다 라벨 피펫으로로드 및 parafilm과 인감. </li><li> 곤충 antennal 사립의 생존 능력은 가능성이 가장 높은 수종에 따라 달라질 것이지만, 우리는 Amyelois transitella 안테나는 일반적으로 기술된 프로토콜을 사용하여 절단 후&gt; 30 분 동안 적극적이고 일관성있게 유지 것으로 나타났습니다. 시간이 금액은 일반적으로까지 평가될 수 있도록 4-10 휘발성 시료에 대해있게됩니다. 표 2는 시간과 시퀀스의 예제를 제공합니다. </li></ol> 2. Bioassay를 EAG위한 곤충 안테나의 작성 <ol><li> 이 실험의 초점은 분석을 EAG되며, 따라서 각 조사 적절하게 reared 곤충에 액세스할 것이라는 가정합니다. </li><li> 본 실험에서는 우리는 마셨다 3~4일를 공부한다D, 성관계 남성과 여성의 나방. 개별 나방은 작고, lidded, 플라스틱 용기 분석 당일로 전송됩니다. bioassay로 바로 전에, 테스트되는 나방이 들고기구 (즉, 각종 플라스틱 pipettor 팁 만든)과 뒤에서 담보로 머리를 최초 전송됩니다. 곤충의 조작은 절단을 촉진하기 위해 저전력 스테레오 - 현미경으로 볼 수 있습니다. </li><li> 안테나 와이어 스쳐 도구를 사용하여 밖으로 조롱하고 있습니다. 전극 젤 작은 영화와 포크 홀더는, 안테나의 빠른 전송을위한 근접 거리에 위치합니다. 첫 번째 안테나는 마이크로 가위를 사용하여 excised과 포크에 배치, 안테나의 기반을 확보하는 것은 포크 (무관심 접지 전극)의 빨간색이 아닌 부분에 위치입니다. 10 분 타이머 세트가 시작되고 두 번째 안테나는 포크의 동일한 측면에 두 기지로 최초의 안테나 옆에 excised과 배치됩니다. </li><li> 또는 안테나 머무르고 내에서 보안 남아있을 수 있습니다g 튜브는 excised 다음, 부드럽게 관과 끝에 젤의 명인과 함께 와이어 스쳐 도구를 사용하여 곤충 사이에서 제거. </li><li> 안테나를 기반과 팁은 전극 젤로 포장되어 있습니다 있도록 확인하고 아무런 거품이 젤에 존재하지 않습니다. 엔드 / 팁은 전극 젤에 대한 전체 노출을 보장 줄어들 수 있습니다. 관리는 각 안테나의 나머지가 따라서 퍼프에 노출되는 최대 antennal 표면적을 보장, 젤 덮여되지 않도록하는 데 사용해야합니다. </li><li> 준비 포크 그런 다음 프로브 프리 앰프에 삽입 200 ML / 기간을 기다리는 십분의 남은 시간을 분에 humidified 공기의 지속적인 흐름 밑에 보관됩니다. 공기 / 퍼프 흐름에게 2-3밀리미터을 지시하도록 조정되는 소비세 시간과 개시 시간을 EAG가 주목된다 (표 2)와 첫 경기 부양 퍼프 이전 삼십초는 긍정적인 컨트롤을 포함하는 피펫은 unsealed와 홀더에 배치됩니다 이 안테나를 준비한. </li><li> 각 exper 후iment은 테스트 나방은 드라이 아이스 환경에서 euthanized 정상적으로 처리됩니다. </li><li> 여성 나방은 짝짓기 상태를 확인하기 위해 해부를하고 있습니다. Cohabitating 수컷들이 짝짓기가로 간주됩니다. </li></ol> 3. 개별 구성 요소에 대한 프로토콜을 EAG <ol><li> Antennal 응답 Syntech의 EAG 악기에 포함된 AutoSpike 소프트웨어를 통해 기록됩니다. EAG 프로브와 채널에 대한 AutoSpike 등록 정보 탭에서 구성은 106.7의 샘플링 속도, NO 수습하고, 그리고 0-42 Hz의 필터로 설정됩니다. 필터 탭을 들어, EAG 필터에 있고 낮은 컷오프는 0.1 Hz로 설정됩니다. </li><li> 자극 퍼프는 기간 1~2초 있습니다. 1 분 설정된 타이머는 각각 낸 후에 시작됩니다. </li><li> 다음 시험 휘발성 피펫은 unsealed와 홀더에 배치됩니다. 무작위 간의 테스트 휘발성 물질의 순서는 어떤 시험 화합물은 지속적으로 다른 테스트 휘발성을 따라하지 않도록 실행 후 다음됩니다 (예 : 표 2) 조심스럽게 allowi퍼프 사이 NG 일분. </li><li> EAG 답변을 읽기의 용이성을 촉진하기 위해 통치자의 일부는 컴퓨터 화면에 배치하고 아래 방향으로 편향 신호의 정점에 기본적인 수준은 mm로 측정하고 데이터 시트 (즉, 5 MV 설정을위한, 33mm에 기록된다 = 2.5 MV). 소프트웨어는 향후 분석을 위해 저장 레코딩의 재생 능력을 가지고 있습니다. MV 또는 μV 진폭 중 하나에 mm의 전환은 나중에 데이터 분석에서 수행됩니다. </li><li> 최종 긍정적인 제어 퍼프가 (예를 들어, 레코드 # 12) 투여 후 안테나가 제거되고 포크는 에탄올 포화 닦아로 세척 및 이후 사용하기 전에 건조 허용됩니다. </li><li> assays의 처리량을 높이려면 안테나의 다음 세트의 절단은 약 10 분 현재 실험이 끝나기 전에 두 번째 실험실 요원에 의해 시작될 수 - 네 번째 낸 후, 현재 실험의 두 번째 테스트 휘발성, 표에 따라 2. 이것은 구경 할 수 있습니다R 직접 현재의 실험 종료 후 다음 실험의 시작. </li><li> 복제의 높은 숫자 (다른 안테나에서) 더 통계적 검증을 제공하기 위해 관심있는 화합물을 수행할 수 있습니다. </li></ol> 4. 혼합 또는 기타 매트릭스의 EAG 분석의 예 (표 3) <ol><li> 다음 두 차 조화 (3-컴포넌트 혼합물)에 대한 비율과 볼륨이 높은 EAG 응답 (표 4)을 도출하도록 의도 휘발성 물질을 결합의 예를 제공하기 위해 계산됩니다. 다음 2 phenylethanol과 1시 2분 4초의 두 번째 혼합 비율로 비교 : 2-undecanone : 계산은 기본적인 비율, α-humulene의 1시 1분 1초 어금니 비율을위한 것입니다. </li><li> 유사한 프로토콜을 사용하여 이전 버전 혼합물의 준비를하고 레이블이 붙은 파스퇴르의 pipettes가 필요한 긍정적이고 부정적인 컨트롤과 함께로드되어 있습니다 설명했다. </li><li> 휘발성 샘플은 남성과 여성의 안테나를 통해 부풀하고 응답을 측정하고 로그온되어데이터 시트 (표 3). </li></ol> 5. 대표 결과 여성의 배꼽 orangeworm 들어 다음과 같은 설정이 사용됩니다 : 이초 퍼프, 십초 녹화 시간, 10 초간 열리, 5 MV 규모. 부정적인 편향은 전형적인 반응이며, 아직 절대 값 (예 : -3,400 μV 편향은 3400 μV로 기록됩니다) 기록됩니다. 긍정적인 컨트롤에 대한 준비의 비교적 약한 반응은 무시됩니다. 그림 1은 배꼽 orangeworm에 의해 긍정적인 제어 가난한 응답의 그래픽 표현을 제공합니다. 가난한 제어 결과의 예를 들어, 아세토페논으로 평균 여성 antennal 반응은 일반적으로 CA입니다. 2600 μV (그림 2), 준비만이 CA의 응답을 해준다면 말이지. 1300 μV 그것은 폐기 및 안테나 또 한 쌍의가 준비됩니다. 마찬가지로 평균 남성 응답 (Z, Z) -11,13-hexadecadienal는 typicall였다Y 3000 μV은, 따라서, 모든 응답은 이하 1,500보다 μV는 일반적으로 폐기되었다. 각 실험의 시작과 끝에 긍정적인 컨트롤은 또한 안테나의 상태에 관한 정보를 제공합니다. 포스트 컨트롤 (레코드 # 12, 표 2) 퍼프에 antennal 반응은 미리 제어 1 일 퍼프 (레코드 # 1 미만의 75% 하나있다면 우리는 신속한 심사를 위해 다음과 엄지손가락의 규칙입니다 , 표 2) 또는 이전 컨트롤 (레코드 # 2, 표 2) 다음 실험 (그림 3)로 인해 준비 가능한 저하로 데이터 분석에 사용되지 않습니다의 2 차 퍼프보다. 엄지의 첫 번째 규칙의 예는 기록 # 1이 될 것입니다 = 2,730 μV 및 레코드 # 12 = 1,680 μV, 그리고 엄지의 두 번째 규칙은 만약 이러한 경우 각각에 기록 # 2 = 2350 μV 및 레코드 # 12 = 1,680 μV, , 준비 및 실험의 결과는 폐기됩니다. 와 같은 긍정적인 컨트롤로 측정 EAG 응답 값을 수정 대표 예제는 다음과 같이 될 것입니다. <table border="1"><tbody><tr><td> # 실행 </td><td> EAG (μV) </td><td> # 2를 실행 </td><td> EAG (μV) </td><td> # 3를 실행 </td><td> EAG (μV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2800 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2420 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 3030 </td></tr><tr><td> 를 Cmpnd </td><td> 3000 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 2500 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 3440 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 530 </td><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 755 </td><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 910 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 2400 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2000 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2560 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2770 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2400 </td><td> (+) 클릭률리터 </td><td> 3020 </td></tr></tbody></table> N = 3 실험 위의 값을 사용하여 부정적인 제어 응답이 부정적인 제어가 기계적 퍼프와 용매 잔류에 대한 기준 antennal 반응이다 가정하에 각 실험 내의 모든 값에서 빼는됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> # 1를 실행 </td><td> EAG (μV) </td><td> # 2를 실행 </td><td> EAG (μV) </td><td> # 3를 실행 </td><td> EAG (μV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2270 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 1665 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2120 </td></tr><tr><td> 를 Cmpnd </td><td> 2470 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 1745 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 2530 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Cmpnd B</td><td> 1870 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1245 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1650 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2240 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 1645 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2110 </td></tr></tbody></table> 각 실험에 대한 긍정적인 컨트롤이 후 평균 1,000 μV로 정정에 대한 비율을 지적하며, 1,000 μV로 수정됩니다. 데이터 시트 (예, 엑셀)를 쉽게 사용할 데이터에 대한 응답을 변환하는 조작 할 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> # 1를 실행 </td><td> 평균 (μV) </td><td> # 2를 실행 </td><td> 평균 (μV) </td><td> # 3를 실행 </td><td> 평균 (μV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2255 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 1655 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2115 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 형용사. </td><td> 1000 (0.443) </td><td> (+) Ctrl 키를 형용사. </td><td> 1000 (0.604) </td><td> (+) Ctrl 키를 형용사. </td><td> 1000 (0.473) </td></tr></tbody></table> 각 실험 이내에 보정 비율로 곱한, 화합물의 값이 A와 화합물 B는 그때 조정됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> # 1를 실행 </td><td> 형용사. EAG (μV) </td><td> # 2를 실행 </td><td> 형용사. EAG (μV) </td><td> # 3를 실행 </td><td> 형용사. EAG (μV) </td></tr><tr><td> 를 Cmpnd </td><td> 1094 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 1054 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 1197 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 828 </td><td> Cmpnd B </td><td> 752 </td><td> Cmpnd B </td><td> 780 </td></tr></tbody></table> 각각의 화합물에 대한 평균 (수단)은 다음엔 평가할 수있다 시험 화합물에 대한 기타 관련 통계 자료 및 EAG 답변과 함께 결정됩니다자세한 조사를 위해 후보입니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 화합물 </td><td> EAG (μV) </td><td> 아니요 실행, N = </td></tr><tr><td> </td><td> 1115 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> B </td><td> 787 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig1.jpg" /> 그림 1. 안테나 확보 후 가난한 antennal 반응에 의해 삭제됩니다 미리 제어 (1 일 양수 제어 퍼프)로 남성 antennal 대응 (1180 μV)의 대표 EAG가 젤로 좋은 연락 있습니다. 아래쪽 창문에 파란색 막대는 휘발성의 이초 퍼프를 나타냅니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig2.jpg" /> <s<html> trong&gt; 그림 2.에 여성 antennal 응답 (3400 μV)의 대표 EAG 1 일 낸 적절한 간주되는 사전 관리 기능을 제공합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig3.jpg" /> 그림 3. 여성 antennal 가난한 간주되는 포스트 제어에 대한 응답 (1680 μV) (각 실험의 마지막으로 긍정적인 제어) 및 안테나 저하 (&lt;75 1 일 사전 통제 % 또는 &lt;의 암시를위한 대표 EAG 사전 통제 제 2 퍼프 값). 이 예를 들어 1 일 이전 제어 퍼프는 사전 통제 퍼프가 2,350 μV였다 2730 μV 및 2 차했습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . &quot;dflinebreak&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig4.jpg" /> 그림 4. 후보 휘발성 조화의 퍼프로 여성 antennal 응답 (3800 μV) 및 최대 초기 편향 (3800 μV), 낸 기간 동안 초기 기울기 (의 후속 측정 EAG 대표 0.3 s/1.2 MV = 0.25 S / MV), 나머지 낸 기간 동안 기울기 (1.6 s/1.9 MV = 0.84 S / MV). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig5.jpg" /> 샘플 매트릭스 및 관련 휘발성 물질을 포함하는 그림 5. 작은 수정 배는 A. 걸쳐 부풀 수 transitella 안테나. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931table1.jpg" /> 표 1.의에서Autospike 프로그램에 다른과 덜 민감한 구성에 의해 결정 비할 아몬드 (2007)과 EAG 응답 ITU 휘발성 방출. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931table2.jpg" /> 표 2. 개별 휘발성 컴포넌트에 남성과 여성의 antennal 답변을 녹음 양식의 예. <img alt="표 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931table3.jpg" /> 표 3. 휘발성 혼합 및 / 또는 꽃다발로 남성과 여성의 antennal 답변을 녹음 양식의 예. <img alt="표 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931table4.jpg" /> 표 4. 혼합된 두 가지 비율에 대한 5 MG / ML 솔루션의 10 ML의 준비의 예. <img alt="표 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931table5.jpg" /> 표 5. 2 conse 레코딩을위한 양식의 예남성과 여성 안테나에 걸쳐 하나의 휘발성의 구성 요소 cutive 퍼프.

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R., Stelinski, L. L., Grant, G. G., de Groot, P., Buchan, L., MacDonald, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+electrophysiological+responses+of+the+emerald+ash+borer,+Agrilus+planipennis,+to+induced+volatiles+of+Manchurian+ash,+Fraxinus+mandshurica.">Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica.</a> Chemoecology. 16, 75-86 (2006).</li><li>Burks, C. S., Brandl, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+abundance+of+navel+orangeworm+(Leipidoptera:+Pyralidae)+in+figs+and+effect+of+peripheral+aerosol+dispensers+on+sexual+communication.">Seasonal abundance of navel orangeworm (Leipidoptera: Pyralidae) in figs and effect of peripheral aerosol dispensers on sexual communication.</a> J. Insect Sci. 4, 1-8 (2004).</li></ol>

저자는 파라마운트의 농업 회사, Suterra LLC과 연줄이있는 회사와 기존의 공동 연구 개발 계약을하고 있습니다.

대상 곤충의 chemoreception 응답을 결정하는 bioassay로 electroantennogram 녹음의 사용은 가스 크로마토 그램 (GC-EAD)의 유출에 대한 감지기로 EAG을 활용한 연구는 문헌에서 찾을 수 흔하다는 다수이다. 9,10 방법 시연 상대적인 응답의 확신 임무 높은 복제와 휘발성 구성 요소의 상당 금액의 신속한 심사를 제공할 것입니다. 우리가 &quot;심사&quot;값으로 여기서 제시 안테나의 최대 편향 진폭 신호를 <...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 아세토페논 </td><td> 알파 - Aesar </td><td> A12727 </td><td> 여 긍정적인 제어 </td></tr><tr><td> (Z, Z) -11,13-Hexadecadienal </td><td> Suterra </td><td></td><td> 남자 긍정적인 제어 </td></tr><tr><td> α-Humulene </td><td> 올드 리치 </td><td> 53,675 </td><td> Sesquiterpene </td></tr><tr><td> 2 - Undecanone </td><td> 올드 리치 </td><td> U1303 </td><td> 지방산 유도체 </td></tr><tr><td> 2 - Phenylethanol </td><td> 올드 리치 </td><td> 77,861 </td><td> Benzenoid </td></tr><tr><td> Pentane </td><td> EMD </td><td> PX0167-1 </td><td> 용제 </td></tr><tr><td> 4 채널 수집 컨트롤러 </td><td> Syntech </td><td> 나DAC-4 </td><td></td></tr><tr><td> EAG 프로브, 프리 앰프 </td><td> Syntech </td><td> 타입 PRG-2 </td><td></td></tr><tr><td> 안테나 홀더 </td><td> Syntech </td><td> PRG-2의 경우 </td><td> 포크 전극 </td></tr><tr><td> 자극 컨트롤러 </td><td> Syntech </td><td> CS-55 </td><td> 공기 흐름과 퍼프 </td></tr><tr><td> 스펙트럼 전극 젤 </td><td> 파커 </td><td> 12-02 </td><td></td></tr><tr><td> Bioassay 디스크 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 2017-006 </td><td> 6mm </td></tr><tr><td> 파스퇴르 pipets </td><td> VWR </td><td> 14673-010 </td><td> 5 잡았다 &quot;(14.6 ㎝) </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> Bemis </td><td> PM-992 </td><td></td></tr></tbody></table>

electroantennographic bioassay as a screening tool for host plant volatiles

식물 휘발성 물질은 식물 곤충의 상호 작용에 중요한 역할을한다. 초식 곤충들은 호스트 공장을 찾습니다 kairomones로 알려진 식물의 휘발성 물질을 사용합니다. 1,2를 호스트 공장 재배자에 심각한 경제적 손실를 입힐 수있는 해충에 의한 중요한 농경 법의 상품 먹이 손상되면. 따라서 kairomones는 유인하거나 혼동이 곤충을하고, 따라서, 곤충 제어를위한 살충제에 환경 친화적인 대안을 제공하는 attractants으로 사용할 수 있습니다. 3 불행히도, 식물 생물 기후학 의존 배출량의 다양한 성분과 비율로 광대한 숫자 휘발성 물질을 방출 수 상품 또는 하루의 시간. 이것은 생물학적으로 활성화된 구성 요소 또는 휘발성 컴포넌트 힘든 과정의 조화를 이루고의 신분을 만듭니다. 우리가 실험실 기반의 심사 bioassay의 electroantennography (EAG)를 채용 호스트 식물 휘발성 배출 bioactive 구성 요소를 식별하는 데 도움합니다. EAG는 평가하고 recor 수있는​​ 효과적인 도구입니다D electrophysiologically들은 antennal 수용체를 통해 곤충의 후각 반응. EAG 심사 절차는 유망 bioactive 구성 요소를 식별하는 테스트 휘발성 물질의 수를 줄일 수 있습니다. 그러나 EAG bioassays은 수용체의 활성화에 대한 정보를 제공합니다. 그것은 화합물 elicits 곤충 행동의 유형에 대한 정보를 제공하지 않는다; 행동 반응의 유인, 혐오감 또는 기타 형식으로 될 수 있습니다. 적절한 긍정적인 컨트롤에 대한 상대 EAG에 의해 상당한 반응을 도출하도록 의도 휘발성 물질은 일반적으로 곤충 해충의 행동 반응의 추가 검사로 이동합니다. 실험 디자인을 제시합니다 상세 한 구성 요소 및 bioassay를 EAG 통해 부품의 단순한 조화에 어른 벌레 해충 배꼽 orangeworm (Amyelois transitella)의 electrophysiological antennal 반응의 측정에 의한 4,5 아몬드 기반 호스트 식물의 휘발성 물질을 구분할 고용 방법론. 방법은 두 전직을 활용cised 안테나는 &quot;포크&quot;전극 홀더에 걸쳐 배치. 여기서 보여준 프로토콜 심사 휘발성 물질에 대한 신속한 높은 처리량 표준화된 방법을 제공합니다. 자극 수준을 표준화하기 때문에 antennal 응답이 상대적 chemoreceptivity는 지표가 될 수 있도록 각 휘발성이 세트 일정한 금액을 부담합니다. 부정적인 컨트롤 낸 두 잔류 용매 및 기계적 힘을 electrophysiological 응답을 제거하는 데 도움이됩니다. 긍정적인 컨트롤 (이 인스턴스 아세토페논에서) 남성과 여성의 배꼽 orangeworm (NOW) 나방의 일관된 반응을 elicited있다 하나의 화합물이다. 남성하세요 나방과 일관성있는 응답을 제공하고 bioassay 연구에 사용되는 추가 semiochemical 표준 (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, 여성의 생산 성 페로몬에서 알데히드 구성 요소. 6-8입니다

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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

성인 배꼽 orangeworm의 electrophysiological 응답 (측정하여 빠르게 화면 호스트 식물의 휘발성 물질에 대한 방법<em&gt; Amyelois transitella</em&gt;) 하나의 구성 요소와 electroantennographic 분석을 통한 조화에 안테나를 시연한다.

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K 조회수.  Agricultural Research Service. 성인 배꼽 orangeworm의 electrophysiological 응답 (측정하여 빠르게 화면 호스트 식물의 휘발성 물질에 대한 방법 Amyelois transitella) 하나의 구성 요소와 electroantennographic 분석을 통한 조화에 안테나를 시연한다.

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A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

β - glucuronidase (거스)을 기반으로 세포를 파괴 분석

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

연구

생물학

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Herbivore 유도 블루베리 휘발성 물질과 내부 식물 신호

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Trypanosomes에서 RNA 편집에 대한 마약 검사에 대한 기자로 RNA 촉매

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

질병 억제의 빠른 예비 평가로 격판덮개 경쟁 분석 결과

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological processes. Advances in molecular microbiology have seen the emergence of diverse mutagenesis techniques for the manipulation of genes. Among them, transposon-insertion sequencing (Tn-seq) is a valuable tool to simultaneously assess the functionality of many candidate genes in an untargeted way. The technique has been key to identify&#160;molecular mechanisms for the colonization of eukaryotic hosts in several pathogenic microbes and a few beneficial symbionts.
Here, Tn-seq is established as a method to identify colonization factors in a mutualistic Burkholderia gladioli symbiont of the beetle Lagria villosa. By conjugation, Tn5 transposon-mediated insertion of an antibiotic-resistance cassette is&#160;carried out at random genomic locations in B. gladioli. To identify the effect of gene disruptions on the ability of the bacteria to colonize the beetle host, the generated B. gladioli transposon-mutant library is inoculated on the beetle eggs, while a control is grown in vitro in a liquid culture medium. After allowing sufficient time for colonization, DNA is extracted from the in vivo and in vitro grown libraries. Following a DNA library preparation protocol, the DNA samples are prepared for transposon-insertion sequencing. DNA fragments that contain the transposon-insert edge and flanking bacterial DNA are selected, and the mutation sites are determined by sequencing away from the transposon-insert edge. Finally, by analyzing and comparing the frequencies of each mutant between the in vivo and in vitro libraries, the importance of specific symbiont genes during beetle colonization can be predicted.