Biz T. Hunt, M. Rosenbluth ve onların tavsiye ve faydalı tartışmalar için Lam Lab teşekkür ederim. Biz G. Spinner gelen destek ve Teknoloji Georgia Institute Elektronik ve Nanoteknoloji Enstitüsü kabul ediyorsunuz. Bu çalışma için maddi destek bir NIH hibe K08-HL093360, UCSF REAC ödül, bir NIH Nanotıp Geliştirme Merkezi Ödülü PN2EY018244 ve Atlanta Çocuk Sağlık ve Endotel Hücre Biyolojisi Merkezi&#39;nden fon tarafından sağlandı.

1. Endotel mikrocihazda Fabrikasyon <ol><li> Dışarıdan bir maske satıcıya mikroakışkan cihazın bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) çizim göndererek bir photomask oluşturun. Kullanılan maske soda kireç camına bir krom tabakası oluşuyordu. Bu durumda mikroakışkan kanalın eni 30 mikron olmuştur. </li><li> 15 dakika boyunca piranha sahip çıplak silikon (sülfürik asit ve hidrojen peroksit 10:01 oranında) temizlemek ve 30 saniye boyunca hidroflorik asit eğimlidir. Yaklaşık 10 saniye deiyonize (DI) su ile durulayın. </li><li> 30 mikron yüksekliğinde gofret üzerine bir spin lak kullanılması, spin Microchem SU-8 2025 fotorezist. SU-8 2025, 3000 rpm arasında bir dönüş hızı tavsiye edilir. SU-8 diğer viskoziteler Bu yüksekliğe ulaşmak hangi mevcuttur. SU-8 kullanmak için Tam talimatlar mevcuttur <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">www.microchem.com</a> </li><li> Için 95 ° C&#39;de bir ocak gözünde SU-8 ile gofret yerleştirin5 dakikadan fazla çözücü kovmak için. Not: Bir fırın, bir ocak gözünün farklı gofret kurulayın ve edecektir tavsiye edilmez. </li><li> Gofret üzerinde istenilen özelliği şekli ile bir maske yerleştirin ve UV ışık (160 mj ​​/ cm 2 maruz Bir maske hizalama (Karl süß, MA-6)) 365 nm&#39;de ölçülür. Bu çapraz fotorezist bağlar. </li><li> Daha da SU-8 polimerizasyon hızlandırmak için ek bir 5 dakika süreyle 95 ° C &#39;de bir ısı plakası üzerine geri gofret yerleştirin. </li><li> Olmayan bir çapraz bağlı SU-8 kaldırmak 4 dakika boyunca PGMEA (propilen glikol metil eter asetat) ile esas olarak oluşan SU-8 Developer gofret, batırmak. </li><li> 10 sn için% 100 izopropil alkol (IPA) sahip yeni geliştirilen gofret çalkalayın. Gofret ve sonra solvent birkaç dakika için temiz bir çeker ocak içinde gofret buharlaşmasına izin vererek veya basınçlı nitrojen kullanılarak kurutulur. </li><li> Teyp bir petri kaplarına desenli SU-8 ile kuru gofret kenarlarına öncesi içinhareketi için önlem alınmalıdır. </li><li> Gofret tam kaplama sağlamak için petri üst ve girdap gofret ile kapağı, bir pipet kullanarak gofret için Sigmacote 1 mL uygulayın, kapağını kaldırın ve tüm çözücü çekinceye kadar gofret, birkaç dakika kurumasını bekleyin. </li></ol> 2. PDMS (polidimetilsiloksan) hazırlanması <ol><li> Mix PDMS polimer ve sertleştirici 10:1 oranı (w / w) az ve bir vakum desikatörde kullanarak hava kabarcıklarını çıkarmak. Gazını almak PDMS için gerekli olan zamanın uzunluğu, kullanılabilir vakum sisteminin gücüne göre değişir, ancak genellikle birkaç dakika ile bir saat arasında değişmektedir. Için bir önceden döküldü PDMS, polimerin 60 mL toplam hacim ile altı inçlik petri tavsiye edilir. </li><li> Yaklaşık 5 mm kalınlığında, gofret üzerine karışımı dökün. Ayrıca, PDMS ince bir tabaka oluşturmak için, düz dipli çanak üzerine yaklaşık 1 mm kalınlığında dökün. 60 gece boyunca bir fırında ° C&#39;de tedavisi. </li><li> Bir bıçak ya da bistüri kullanarak, c etrafında kesipPDMS cihaz edili ve gofret çıkarın. Buna ek olarak, cihaz, biraz daha büyük PDMS ince bir tabaka kesilir. </li><li> 1.0 mm delik kullanarak PDMS cihazın giriş ve çıkış delikleri oluşturun. Bu da iğne mengenesi, Harris Uni-Core veya benzer bir cihaz kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li><li> Cihazın yüzeyler ve seloteyip kullanılarak levha temizlenir. </li><li> Ve plazma kullanılarak, PDMS aygıtı ve 30 saniye bir oksijen plazmaya PDMS tabakanın yüzeyi maruz bırakmaktadır. Oksijen plazma fiziksel temas ettirilir bağı PDMS açıkta kalan yüzeyi üzerinde reaktif türün oluşturur. </li><li> PBS içinde insan plazmasından 50 ug / ml fibronektin ile doldurulmuş sırayla bir küt-noktası iğne ile bir şınngaya bağlanmış bir çok tüp küçük bir uzunluğu (birkaç santimetre), daha küçük boru bağlanır. Tüp ve iğne bir sürtünme uygun borular arasında oluşturulan bu tür ölçekli vardır. Küçük PDMS mikrocihazda girişinde boru ve eklemepply şırıngaya basınç fibronektin çözeltisi ile tamamen kanalları doldurmak için ve çıkış deliği küçük bir 100 uL damla oluşturmak için, kanallar ıslak kalmasını sağlamak için. 40-60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe cihazı. </li><li> Künt noktaya iğne için PBS ile dolu yeni bir şırınga bağlayın. PBS ile cihaz durulama şırıngaya basınç uygulayın. </li></ol> 3. Endotel Hücreleri ile mikroakışkan Aygıt tohumlama <ol><li> % 8 dekstran ile endotelyal büyüme ortamında insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC&#39;lere) 1.000.000 hücre / ml hazırlayın. 500.000 ile 2.000.000 hücre / ml Bir dizi başarıyla kullanılmaktadır. Hücre yükleme orta dekstran ilavesiyle bunlar fibronektin kaplı mikroakışkan sistemi girerken endotel hücrelerinin hızı azalır sıvısı, viskozitesi arttırır. Bu da, hücrelerin mikrocihazda içinde başarıyla yapışır ve kültür olasılığını artırır. </li><li> CAdım 2.7 gibi yeni şırınga ve tüp onnect. fakat daha uzun bir boru ile (uzunluk yaklaşık 1 metre). </li><li> Bu sistemin performansını optimize etmek için, tüm perfüzyon sisteminde herhangi bir sızıntı veya kabarcıklarını engellemek için bu noktada önemlidir, çözüm ya da medyada kabarcıklarının varlığı herhangi bir sızıntı akışını değiştirebilir ve endotelyal hücrelerin başarılı tohumlama önleyecektir. Bu nedenle, boru sıkı uyan herhangi bir bağlantıları arasındaki sızıntıyı ortadan kaldırmak için gereklidir. Hücreleri mikrocihazda tanıtıldı ve tüm perfüzyon sistemi hava kabarcıklarının giriş önlemek için mikroakışkan tüp takmadan önce hücre çözümü ile astarlanmalıdır önce şırınga ve / veya boru Bubbles ortadan kaldırılmalıdır. </li><li> Bir şırınga pompası kullanılarak, 37 de 2 saat için 1.23 ul / dak akış hızında hacimsel PDMS aygıtı içine hücre süspansiyonu aşılamak ° C&#39;de ve% 5 CO2. Şırınga pompası olduğu zaman iyi sonuçlar elde edildi<html> PDMS aygıtı olarak aynı yükseklikte. Girişi için inkübatöre içinde sarmal olabilir uzun tüp, hücreler ve medya yeterince cihazı ile temas öncesi ılıtıldı edilmesini sağlar. Bizim sistemde, 1.23 ul / dakika debili ~ 1 dyne / tam kan kullanarak bu kanalları cm 2. Bir duvar kayma gerilmesi karşılık küçük mikrokanallarda içinde ~ 1 mm / s orta akım hızı yaklaşık olarak </li><li> 1,23 ul / dk oranında 2-8 gün boyunca aynı şırınga pompası ve uzun bir tüp, yayma taze büyüme ortamı kullanılarak. Başarılı bir cihaz 24-48 saat içinde aygıt iç büyüyen endotel hücreleri, bir tek tabakalı sahip olacaktır. Önceki deneyler konfluent mono tabakalar uygun bir cihaz 14 boyunca hücre-hücre kavşaklarda VE-cadherin ifade olduğunu göstermiştir. </li><li> Deneysel sistem içine kan veya hücre süspansiyonu enjekte edilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar _content &quot;&gt; Bu protokol kullanılarak standart litografik imalat teknikleri fizyolojik olarak mikrovasküler (Şekil 1a) sizescale taklit mikroakışkan kanal üretmek için gerekli kalıp oluşturmak için kullanılır. optimize edilmiş bir perfüzyon tekniği kullanarak, endotel hücreleri daha sonra, tohum ve confluently kültürü mikroakışkan sistemi şeffaf olduğu için hücre ekimi 24-48 saat içinde mikroakışkan sistemi (Şekil 1B) tüm iç yüzünü., tüm mikrocihazda görüntüleme ve veri toplama için bir aydınlık / floresan mikroskop sahnede yerleştirilebilir. Sistemimiz daha sonra orak kırmızı hücreleri ve anormal lökosit ve endotel adezyon artan sertlik mikrovasküler obstrüksiyon katkıda bulunduğu gibi orak hücre hastalığı gibi biyofiziksel özellikleri, değiştirilemez barındırır hematolojik hastalıklar çalışma uygulanabilir. Klinik olarak onaylanan ilaç, hidroksiüre, belirtiler ancak d düzeltirmikrovasküler akımı üzerine irect etkisi bilinmemektedir. Bizim test hesabı hücre sertliği ve yapışma hem de içine alır ve hidroksiüre önemli orak hücre hastalığı (Şekil 2) akış düzeltir olduğunu gösteriyor. Bu sistemin ideal kan hücrelerinin mikrovasküler birbirlerine ve endotel hücreleri ile etkileşim içinde herhangi bir hematolojik süreci incelemek için uygundur gibi orak hücre hastalığı, mikrovasküler-on-a-chip için bir uygulama sadece bir örnektir. Daha temel uygulamaları pek çok diğerleri arasında lökosit biyoloji ve hematopoetik kök hücre biyolojisi, yer alırken, diğer klinik uygulamalar inflamatuar hastalıklar, sepsis / akciğer hasarı, trombotik mikroanjiopatilerdir, sıtma ve kanser metastazı içerir. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. A) endothelializasyona önce, başlangıç ​​PDMS mikroakışkan cihazı. Burada, mikrocihazda wit enjekte edilirh gıda sisteminin sizescale ve genel tasarımı göstermek için boyama. B) aydınlık mikroskobu mikroakışkan sistemi tamamen burada açıklanan protokolü kullanılarak hücre ekiminin 48 saat içinde endothelialized gösterir. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. A) mikrokanallar ile mikrovasküler-on-a-chip post-kapiller venüller (30 mikron), en orak hücreli mikrovasküler obstrüktif olayların sitenin boyutu yakındır. Hidroksiüre alan orak hücre hastalarında ve hidroksiüre almayan hastalardan tam kan iki farklı mikrodolaşımını-on-a-chip cihazlar üzerinden akar. Endothelialized mikrokanallar içinde göreli kolaylıkla hidroksiüre akımlarının alan orak hücre hastalarında B) Tam kan. C) aynı hemodinamik şartlar altında, hidroksiüre almayan orak hücre hastalardan alınan kan, bununla birlikte, microch ile çok daha yavaş akış sergileyenannel tıkanıklığı. Alt kanalı tamamen hiçbir akışı ile engellenmiş ve diğer endothelialized mikrokanallardaki akım hızları hidroksiüre durumda önemli ölçüde daha düşüktür edilir. Her üç görüntüler ölçek çubuğu 30 mikron olduğunu.

<ol>
	<li>Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Level+of+Laboratory+Testing+Required+for+Diagnosis+or+Exclusion+of+a+Platelet+Function+Disorder+Using+Platelet+Aggregation+and+Secretion+Assays.">The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays.</a> Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).</li><li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments.">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li><li>Young, E. W. K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macro-+microscale+fluid+flow+systems+for+endothelial+cell+biology.">Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology.</a> Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).</li><li>Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+cell+vasoocclusion+and+rescue+in+a+microfluidic+device.">Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).</li><li>Rosano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks.">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li><li>Meer, A. D. v. a. n. d. e. r., Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Technology+in+Vascular+Research.">Microfluidic Technology in Vascular Research.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li><li>Karunarathne, W., Ku, C. -. J., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+nature+of+extracellular+ATP+as+a+concentration-dependent+platelet+P2X1+agonist+and+antagonist.">The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist.</a> Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).</li><li>Kotz, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+microfluidics+for+neutrophil+genomics+and+proteomics.">Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics.</a> Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).</li><li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry.">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).</li><li>Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+model+for+single-cell+capillary+obstruction+by+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes.">A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).</li><li>Borenstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+endothelialized+microvascular+networks+with+circular+cross-sections+in+a+tissue+culture+substrate.">Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate.</a> Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).</li><li>Nesbitt, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation.">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat. Med. 15, 665-673 (2009).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).</li><li>Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology.">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li><li>Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemolytic+uraemic+syndrome:+prognostic+factors.">Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors.</a> Clinical &#38; Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bizim endothelialized mikrocihazda sistemi in vivo deneyler ile birlikte kullanıldığında en uygun olan, ve indirgemeci bir yaklaşım, insan ve hayvan modellerinde gözlenen hematolojik süreçlerinin biyofiziksel mekanizmaları aydınlatmak yardımcı olabilir. Ayrıca, sistem sınırlamaları olmaksızın değildir. Örneğin, bizim mikroakışkan kanal kesitinin kare vardır. Teknik dairesel mikrokanallar 10,11 imal edilebilir olsa da, diğer araştırmacılar kolayca kendi çalışmaları iç...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> künt noktası iğne </td><td> Tamam Uluslararası </td><td> 920.050-TE </td><td> Hassas TE iğnesi 20 Gauge x 1/2 &quot;, pembe </td></tr><tr><td> dekstran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 31392 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0895 </td><td></td></tr><tr><td> Delgeç (pin mengene) </td><td> Teknik Yenilikler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> İnsan göbek kordonu endotel hücreleri (HUVEC&#39;lere) </td><td> Lonza </td><td> CC-2519 </td><td></td></tr><tr><td> Plazma temizleyici </td><td> Plazma </td><td> PDC-326 </td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9285739 </td><td> Sylgard 184 Silikon Elastomer KİTİ </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 2025 </td><td> Microchem </td><td> Y111069 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 Geliştirici </td><td> Microchem </td><td> Y020100 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga pompası </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-3008 </td><td> PHD-ULTRA </td></tr><tr><td> boru (büyük) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06418-02 </td><td> Tygonreg microbore boru, 0.020 &quot;ID x 0,060&quot; OD </td></tr><tr><td> boru (küçük) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06417-11 </td><td> PTFE microbore boru, 0.012 &quot;ID x 0,030&quot; OD </td></tr></tbody></table>

endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases

Imalat teknikleri gelişmeler mikro ve nanoscales 1,2 &#39;de biyolojik ve biyokimyasal deneyler için ucuz ve tekrarlanabilir mikroakışkan sistemleri üretim sağlamıştır. Buna ek olarak, aynı zamanda spesifik olarak Mikroakiskan nedeniyle kolayca dinamik bir akışkan ortam ve biyolojik şartlar 3-6 kontrol etme konusunda, kantitatif hematolojik ve mikrovasküler süreçler kullanılarak analiz edilmiştir. Gibi araştırmacılar, son zamanlarda kan hücrelerinin şekil, kan hücre agregasyonu, mikrovasküler kan akımı ve kan hücre-endotel hücre etkileşimleri 6-13 incelemek için mikroakışkan sistemleri kullandık. Ancak, bu mikroakışkan sistemler ya kültürlü endotel hücreleri içeren veya büyüktü vermedi mikrovasküler patolojik süreçleri sizescale ilgili daha. Kültürlü endotel hücreleri ile mikroakışkan platformu doğru özetlediği hücresel, fiziksel ve hemodyn bumikrodolaşımında Amic ortamı mikrovasküler içeren hematolojik hastalıkların temel biyofiziksel patofizyolojisi anlayışımızı ilerletmek için gereklidir. Burada, hematolojik hastalığı meydana patolojik biyofiziksel mikrovasküler etkileşimleri çalışmak için standart endotel hücre kültür teknikleri ile birlikte, basit bir, tek bir maske mikroimalat sürecini kullanarak, mikrovasküler bir in vitro model &quot;endothelialized&quot; oluşturmak için bir yöntem sunduk. Bu &quot;mikrovasküler-on-a-chip&quot; sıkı biyolojik hem de biyofiziksel koşulları kontrol ve standart bir şırınga pompası ve aydınlık / floresan mikroskobu kullanarak işletilmektedir sağlam bir yöntem ile araştırmacı sağlar. Böyle mikrosirkülatuar hemodinamik şartlar, endotel hücre tipi, küre tipi (ler) ve konsantrasyon (s), ilaç / inhibitör konsantrasyonu, vs gibi parametreler her kolayca kontrol edilebilir. Bu, bizim mikrosistem sağlarkantitatif mikrovasküler akış nedeniyle hücre adezyon, agregasyon ve deformabilitesi, mevcut testler ile ulaşılamıyor bir yeteneği değişikliklerden engelli olduğu hastalık süreçleri araştırmak için bir yöntem.

Watch this Scientific Journal Video about Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases at JoVE.com

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Mikrovasküler ölçekli kanallar (&lt;30 um) ile bir mikroakışkan cihazın bütün iç yüzeyi boyunca kültürün 3B, endotel hücre mono tabakasında için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu<em&gt; In vitro</em&gt; Mikrovasküler modeli kan hücreleri, endotelyal hücreler ve kan hastalıkları çözünür faktörler arasında biofiziksel etkileşimlerin çalışma sağlar.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

endothelialized-microfluidics-for-studying-microvascular-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.8K Görüntüleme.  Emory University School of Medicine. Mikrovasküler ölçekli kanallar (

Video: Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Biyomühendislik

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Plasenta karşısında Ksenobiyotik ve Nanomalzemelerin Ulaştırma Hızı belirlenmesi kullanarak<em&gt; Ex vivo</em&gt; İnsan Plasental Perfüzyon Modeli

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

Sürekli Akış Microspotter kullanma Modifiye yüzeye hücrelerin Batık Baskı

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandviç gibi mikroçevrelerde Hücre / Malzeme Etkileşimleri Harness

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

Doku Mühendisliği vaskülarizasyon Birimleri olarak Kemirgen Yağ Dokusu kaynaklı Mikrovasküler Parçalarının İzolasyonu

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

Nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma çalışmak için elektrot dizileri ile ara yüz kullanımını Havacilik

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models is crucial both to better understand the pathological mechanisms of these diseases and identify new therapeutic targets and strategies. To be pertinent, an in vitro model must reproduce the pathological features of a human disease. However, in the context of neurodegenerative disease, a relevant in vitro model should provide neural cell replacement as a valuable therapeutic opportunity. 
Such a model would not only allow screening of therapeutic molecules but also can be used to optimize neural protocol differentiation [for example, in the context of transplantation in Parkinson's disease (PD)]. This study describes two in vitro protocols of 1) human glioblastoma development within a human neural organoids (NO) and 2) neuron dopaminergic (DA) differentiation generating a three-dimensional (3D) organoid. For this purpose, a well-standardized protocol was established that allows the production of size-calibrated neurospheres derived from human embryonic stem cell (hESC) differentiation. The first model can be used to reveal molecular and cellular events occurring during in glioblastoma development within the neural organoid, while the DA organoid not only represents a suitable source of DA neurons for cell therapy in Parkinson's disease but also can be used for drug testing.

This study introduces and describes protocols to derive two specific human neural organoids&#160;as a relevant and accurate model for studying 1) human glioblastoma development within human neural organoids exclusively in humans and 2) neuron dopaminergic differentiation generating a three-dimensional organoid.

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...