Bu protokolde, sülfonyum tuzu, özel yakınlıkta protein sistein ile reaksiyona giren yeni bir el gibi davranabilecek şekilde inşa edildi. Bu tekniğin avantajı, bu reaksiyonun hızlı ve verimli olması ve Met-katalizörün içermemesi ve peptitleri stabilize etmek için basit ve verimli bir yöntem geliştirmesiydi. Başlamak için, 500 mililitrelik bir beher veya şişede% 20 piperidin veya% 50 morfolin ve DMF'nin N-terminal 9-florinil-metiloksikarbonil deproteksiyon çözeltisini hazırlayın.
Daha sonra, kolona 10 mililitre deproteksiyon çözeltisi ekleyin ve azotu çözeltiye 30 dakika veya beş dakika boyunca iki kez kabarcıklayın. Çözeltiyi bir vakum pompası ile boşaltın ve reçineyi diklorometan ve N, N-dimetilformamid ile beş kez sırayla yıkayın. Reçineyi koyu sarı renkli bir renk çözeltisi olarak tespit etmek için, az miktarda reçineye bir mililitre N, N-dimetilformamid ekleyin ve bir cam tüpe 200 mikrolitre% 5 ninhidrin ekleyin.
Reçine rengindeki değişiklikleri değerlendirmek için üç dakika boyunca 130 santigrat derecede ısıtın. Peptitlerin bağlanması için, bir polipropilen tüp içinde el yazmasında tarif edildiği gibi bir karışım çözeltisi hazırlayın ve üç mililitre N, N-dimetilformamid içinde çözün. Daha sonra, amino asidi inaktive etmek için çözeltiye 173 mikrolitre N, N-diizopropiletilamin veya 154 mikrolitre N, N'diizopropilkarbodiimid ekleyin.
Daha sonra, karışımı reçine ile kolona ekleyin ve iki saat boyunca azotla kabarcıklayın. Bağlantıdan sonra, az miktarda reçineye bir mililitre N, N-dimetilformamid ekleyin ve bir cam tüpe 200 mikrolitre% 5 ninhidrin ekleyin. Reçine renksizliğe dönüşürken, üç dakika boyunca 130 santigrat derecede ısıtın, bu da korumadan önce serbest bir amino grubunun bulunmadığını doğrular.
Çözeltiyi boşalttıktan sonra, reçineyi daha önce gösterildiği gibi yıkayın ve kolona 10 mililitre deproteksiyon çözeltisi ekleyin. Daha sonra, 30 dakika veya beş dakika boyunca iki kez azotla kabarcıklayın. Ve yine, taze bir çözüm ekleyin.
Dehidrasyon için reçineli kolona 10 mililitre susuz metanol ekleyin ve bir sonraki kullanım için azotla kurutun. Reçinenin 100 miligramını bir kolona tartın ve bağlantı adımından önce reçineyi diklorometan ve N, N-dimetilformamid ile yıkayın. Koruyucu grubu çıkarmak için 100 mililitrelik bir beher veya şişeye trifloroasetik asit, triizopropilsilan ve diklorometan karışımı ekleyerek tritil-L-sistein koruma grubunu çıkarmak için bir çözelti hazırlayın.
Koruma grubunu 10 dakika boyunca çıkarmak için hazırlanan çözeltinin beş ila 10 mililitresini kolona ekleyin. Sarı renk tamamen kaybolana kadar azot köpürmesiyle altı kez tekrarlayın. Çözeltiyi bir vakum pompası ile boşalttıktan sonra, reçineyi daha önce gösterildiği gibi yıkayın.
Daha sonra, 50 mililitrelik bir beherde dihalojenli bağlayıcı ve N, N-diizopropiletilamin ekleyerek veya N, N-dimetilformamid içeren şişe ekleyerek korumasız sistein ile reaksiyona girmek için bir çözelti hazırlayın. Azot köpürmesiyle en az üç saat boyunca korunan sistein ile reaksiyona girmek için kolona beş ila 10 mililitre reaksiyon çözeltisi ekleyin. Yine, çözeltiyi bir vakum pompasıyla boşaltın ve reçineyi daha önce gösterildiği gibi sırayla yıkayın.
Peptit siklizasyon çözeltisini hazırlamak için, 20 mililitrelik bir beherde trifloroasetik asit karışımı ekleyin veya peptid siklizasyonu için duman davlumbazına şişe ekleyin. Daha sonra, karışım çözeltisinin beş ila 10 mililitresini polipropilen tüpe ekleyin ve reçineyi trifloroasetik asit kokteylinin altında üç saat boyunca bölün. Bağlantı adımı daha önce gösterilmeden önce reçineyi dehidrate ettikten ve yıkadıktan sonra,% 1'lik bir formik asit sulu çözeltisi ve bir milimolar propargil bromür hazırlayın ve metiyonin peptid çözeltisine ekleyin.
Daha sonra, metiyonin ve propargil bromürün bağlantı reaksiyonunu oda sıcaklığında 12 saat çalkalayın. Reaksiyondan sonra, ürünü bir polipropilen tüp ve asetonitril içinde çözün ve 0.22 mikrometrelik bir filtre membranından süzün. Daha sonra, çözeltiyi hemen ters faz HPLC ile saflaştırın ve bir sonraki kullanım için toz haline getirerek dondurarak kurutun.
Sistein ve metiyonin arasında bis-alkilasyon kullanılarak sentezlenen siklik peptitler, epimerlerin farklı tutma süreleri ve aynı moleküler ağırlıklar sergilediğini gösteren HPLC ve LCMS spektrumu ile karakterize edildi. Epimerlerin ve konjuge ürününün HPLC izleri, siklik peptit ile ürünü arasındaki zamana bağlı dönüşümü göstermiştir. Tiol-yne tipi reaksiyon kullanılarak sentezlenen siklik peptitlerin moleküler ağırlığı LCMS tarafından belirlendi ve peptid HPLC tarafından izole edildi ve saflaştırıldı.
Peptitler ayrıca proton NMR ve heteronükleer tek kuantum tutarlı spektrumları ile karakterize edildi ve kimyasal kaymayı ortaya çıkardı. Sülfonyum halkasının açılmasına bağlı peptid stabilitesini araştırmak için siklik peptid ile ditiotrreitol ve döteryum oksit arasındaki zamana bağlı dönüşümün proton NMR spektrumları elde edildi. Sonuçlar, 24 saat sonra hiçbir ekleme veya halka açma ürününün oluşmadığını göstermiştir.
Bu prosedür, siklik peptitlerin sentezlenmesi için etkili bir strateji oluşturdu. Reaksiyon, seçiciliğin, siklik peptidi stabilize eden bir doğrulama oluşturarak da arttığını ve siklik peptitlerin umut verici ilaç katalizörü olduğunu gösterdiğini söylüyor.
