Bu nanobar destekli lipit çift katmanlı sistem, hücre aktiviteleri sırasında protein ve lipitlerin dinamiklerini ve dağılımını düzenlemede membran eğriliğinin rolünü incelemek için kullanılabilir. Bu teknik, yüksek çözünürlüklü nanofabrikasyon ile önceden tanımlanmış membran eğriliği ile patent nanobar hataları üzerinde sürekli bir lipit çift katmanı oluşturarak membran eğriliği üretiminde hem yüksek alt kök hem de kötü sunar. Başlamak için, nano çipi desen tarafı yukarı bakacak şekilde 10 mililitrelik bir beherin içine yerleştirin.
Beher'e dikkatlice bir mililitre% 98 sülfürik asit ekleyin ve asidin çipin ön ve arka tarafını tamamen kapladığından emin olun. Beheri yavaşça döndürün ve tüm beher ısınana kadar damla damla damla 200 mikrolitre% 30 hidrojen peroksit ekleyin. Sülfürik asit ve hidrojen peroksitin, organik moleküllerin nano çipten uzaklaştırılması için Piranha çözeltisi oluşturmak üzere iyi karıştırıldığından emin olun.
Beheri ikincil bir cam kaba koyun ve safsızlıkları iyice temizlemek için nano çipi gece boyunca Piranha çözeltisine batırılmış halde tutun. Beheri çıkarın ve Piranha çözeltisini dikkatlice bir asit atık kabına pipetleyin. Artık asidi seyreltmek ve asit atığına atmak için beherin içine beş mililitre deiyonize su yükleyin.
Bu adımı beş kez yineleyin. Çipi cımbızla alın ve artık asidi iyice gidermek için sürekli bir deiyonize su akışıyla yıkayın. SLB oluşumu için talaş %99,9 azot gazı ile üflenerek kurutun.
Lipid karışımını 30 dakika boyunca sonikleştirin. Lipit karışımını sıvı azotta 20 saniye dondurun ve ardından bir su banyosunda iki dakika boyunca 42 santigrat derecede çözün. Donma/çözülme döngülerini 30 kez tekrarlayın.
Bundan sonra, lipit karışımı berrak bir sıvı gibi görünür. Lipit karışımını mini ekstrüderden geçirin ve 20 kez ileri geri ekstrüzyon yapın. Daha büyük parçacıklar veya yabancı madde ile kontaminasyonu azaltmak için SUV'ları diğer taraftaki şırıngadan toplayın ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Temizlenmiş nano çipi deiyonize sudan bir çift cımbızla dikkatlice çıkarın ve% 99,9 azot gazı ile fön ile kurulayın. Bir saat boyunca hava plazma işlemi ile nano çipin yüzey temizliğini yapın. Nano çipi bir PDMS odasına monte edin.
Çipi, desen yukarı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirerek başlayın. Orta PDMS'yi çiple yavaşça örtün ve tüm desenin orta PDMS'deki oval şekilli büyük açıklığın merkezi alanına maruz kaldığından emin olun. Üst PDMS'yi orta PDMS ile örtün ve iki küçük deliğini orta PDMS'nin büyük oval deliği bölgesinde tutun.
Daha sonra, PDMS odası monte edilir. SUV'ları üst PDMS'deki iki küçük delikten birinden PDMS kanalına bir pipetle yükleyin ve SLB'yi oluşturmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. PBS tamponunu küçük deliğin bir tarafından PDMS kanalına nazikçe pipetleyin ve bağlanmamış SUV'ları yıkamak için atıkları diğer delikten pamuklu bir tomurcukla çıkarın.
Ardından nano çip üzerinde oluşan SLB'yi edinin. 100 x yağ hedefi kullanarak lazer taramalı konfokal mikroskopiyi ayarlayın. Lipid ve proteinin floresansını uyarabilecek uyarma lazer gücünü seçmek için Zen yazılımını açın.
Edinme Modu'nu seçin. Ardından Akıllı Kurulum'a ve ardından Texas Red'e tıklayın. Nano çubuk kenarları lipit kanalının altında keskin olana kadar çip üzerindeki nano çubukları bulmak için odak düğmesiyle odağı ayarlayın.
Protein eklemeden önce lipit kanalının kontrol görüntüsünü elde etmek için tarama parametrelerini ayarlayın. FRAP tahlilini, rastgele tek bir nanobar alanı üzerinde floresan etiketli lipit çift katmanlı ağartarak yapın. Deneme Bölgeleri ve Ağartma onay kutularını seçin.
Merkezdeki tüm nanobarı içerebilen beş mikrometre çapında dairesel bir alan çizin ve deney bölgelerine ekleyin. TimeLapse görüntüleme parametrelerini girin. Zaman Serisi'ni seçin.
Ardından Süre'yi tıklayın. 100 döngü ve iki saniyeye eşit aralık seçin. Giriş ağartma parametreleri.
FRAP gerçekleştiren lazer onay kutularını seçin ve FRAP denemesi için gücü %100 Denemeyi Başlat'a değiştirin. Protein çözeltisini PDMS kanalına yükleyin ve proteinin SLB üzerine bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Nanoçubukları yeniden odaklayın ve protein eğriliği algılama tespiti için hem lipit hem de protein kanallarının görüntülerini almak için tarama parametrelerini ayarlayın.
Deney Bölgeleri'ni seçin ve FRAP testini hem lipit hem de protein kanallarında yapın ve eğrilik algılama proteininin hareketliliğini karakterize etmek için TimeLapse görüntüleme gerçekleştirin. Her ikisi de 300 nanometre genişliğinde SLB kaplı bireysel nanobarların ucunda artan birikim göstermektedir. Burada SLB, protein bağlanmasını elektrostatik olarak arttırmak için% 10 PS içerir.
Her iki protein de lipitlerden daha yüksek bir uç-merkez oranına sahiptir, bu da yaklaşık bir tanesidir. IDR FBP17 ve F-Bar'ı karşılaştırırken, IDR FBP17'nin daha yüksek uçtan merkeze oranı, F-Bar'dan daha güçlü eğrilik algılamasını gösterir. Her üç protein de, eğrilik çapı 400 nanometrenin altına düştüğünde nanobar uç kavisli membran bölgelerinde tercihli birikim gösterdi.
Bu üç protein alanı arasında, IDR FBP17 en yüksek nano çubuğu ve yoğunluğu verir, bu da en güçlü eğrilik algılama yeteneğini gösterirken, F-Bar en düşük değeri gösterir. Protein bağlanma eğrisi, IDR FBP17'nin güçlü bir işbirlikçi eğrilik algılama yeteneğine sahip olduğunu gösteren protein konsantrasyonunu kademeli olarak artırarak çizilebilir. Nanobarlardaki lipit sinyallerinin hızlı geri kazanımı ile karşılaştırıldığında, F-Bar iki dakika içinde iyileşemez, bu da kavisli membran bölgelerinde membran hareketliliğinin ve ilişki dinamiğinin önemli ölçüde azaldığını gösterir.
Şaşırtıcı bir şekilde, F-Bar'ın davranışından farklı olarak, IDR FBP17 sinyalleri, kavisli membranlarda biriken IDR FBP17'nin dinamik doğasını gösteren, aynı zaman diliminde belirgin bir iyileşme gösterdi. Bununla birlikte, çözümdeki bağlanmamış IDR FBP17'yi temizledikten sonra, IDR FBP17 kanalında eskisi gibi aynı iyileşme gözlenemedi. SLB kalitesi, kavisli membran ve protein arasındaki etkileşimi incelerken çok önemlidir.
Bu nedenle, membran hareketliliğini doğrulamak için deneyimizde FRAP testi gereklidir. Bu sistem, araştırmacıların eğrilik algılama alanları ve lipit bileşimi gibi kavisli membran ile protein etkileşimini etkileyen çeşitli parametreleri incelemelerine ve yüz ayırma davranışları gibi kavisli membran üzerinde dinamik çalışmalar yapmalarına yardımcı olacaktır.
