Endoplazmik retikulum sürekli sitoiskelet ile etkileşim dinamik bir tübüler etki alanı içerir sürekli hareket ve yeniden düzenleme uğrar. ER'nin bu organizasyonu nasıl oluşturduğu ve koruduğu henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, karmaşık lipid nanotüp ağlarına aktarılabilen katı destekli proteinsiz membran sisteminden oluşan ER için aşağıdan yukarıya yapısal organel modeli oluşturmak için uygun bir madde salıyoruz.
Hidrofilik enerji için organik bir bileşiktir. Protein arınması ve protein ekstraksiyonu gerekli değildir. Sadece temel bileşenleri katı substrat ve fosfolipidler en temel ER modeli sağlayan vardır.
Çözünmüş lipid çözeltilerini 10 mililitrelik ters armut şeklindeki bir şişeye aktarın ve toplam 3,000 mikrogram lipid ve 300 mikrolitre kloroform elde edin. Daha sonra şişeyi döner buharlaştırıcıya bağlayın ve 45 derece eğimle yerleştirin. Şişeyi 24 RPM'de bir su banyosunda 23 santigrat derecede altı saat boyunca azaltılmış hava basıncıyla yavaşça ve tamamen kloroformu çıkarmak için döndürün.
Basınç 20 kilopascals ulaşana kadar her iki dakikada bir 20 kilopascals adımlarla rotasyon başlattıktan sonra basıncı azaltmaya başlayın. Altı saat sonra, rotasyonu durdurun ve hava basıncını her iki dakikada bir 20 kilopascal'lık adımlarla tekrar artırın ve 100 kilopascal'a ulaşıncaya kadar. Döner evaporatör den şişe çıkarın ve PBS üç mililitre ve gliserol 30 mikrolitre ekleyin.
Yavaşça gliserol çözmek için şişe girdap. Lipidler içeren şişe mühür için bir hava geçirmez cam stoper kullanın. Rehidrasyon ve lipid filmlerin şişmesi için bir gecede dört derece santigrat de buzdolabında şişe saklayın.
Ertesi gün, oda sıcaklığında bir ultrasonik su banyosu ile lipidler sonicate ve 35 kilohertz frekansta bir üniforma biraz bulanık lipid süspansiyon elde kadar. Sonication yaklaşık 10 ila 30 saniye sürebilir. Uzun süreli sonication ısı üretir ve vesitik oluşumu için zararlıdır.
Bu adımlar veziküler yapıların iki tür içeren bir süspansiyon verim. Multilameller veziküller ve dev unilamellar veziküller. Depolama için, toplam 30 mikrosantrifüj tüpleri kullanarak 100 mikrolitre aliquots içine lipid süspansiyon bölün.
Aliquots eksi 20 santigrat derece bir dondurucuda saklayın. Sıvı nitrojen ile flaş donma gerekli değildir. Lipid süspansiyonuna çözülün ve dört mikrolitrelik süspansiyon damlasını temiz bir cam mikroskop kaydırağı veya kapak kaydırağı üzerine aktarın.
20 dakikalık kuruduktan sonra, damlacık gözle görülebilen düz dairesel bir lipid filmine dönüşür. 3 dakika boyunca HEPES tampon bir mililitre ile lipid film rehydrate. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi ACIL dönüşümünü başlatmak için gerekli olan otomatik bir pipet ile tampon değişimi için izin vermek için açık bir üst ile gözlem odası hazırlayın.
Bir spatula ile tedavi PDMS levha çıkardıktan sonra, mikroskop aşamasında mevcut açılış için uygun boyutlar ve geometri içine çerçeve kesmek için bir neşter kullanın. 1,5'e 1,5 ile 0,5 santimetre boyutları çoğu kurulum için uygundur. PDMS çerçevesinin pürüzsüz tarafını alüminyum oksit filminin bulunduğu yüzeyin aktif tarafıyla temas edin ve çerçeveyi ve yüzeyi birbirine doğru iterek yapışmalarını sağlamak için hafifçe basınç uygulayın.
Hemen kalsiyum HEPES tampon ile gözlem odası doldurun. Sonraki adımda rehydrated lipidlerin eklenmesi için izin vermek için tüm oda hacmini doldurmayın. Odayı konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin.
Rehydrated lipid malzeme, şimdi dev veziküller içeren bir süspansiyon, plastik bir mera pipet ile odaya aktarın. Veziküllerin yüzeye yapışmasını ve yüzeye yayılmasını sağlamak için 10 ila 20 dakika bekleyin. Yayma yüzeyde lipidlerin birikimihemen sonra başlar.
Lipid yapıyı yaymadan önce tampon değişimi mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yapılmalıdır veya tamponun hızlı bir şekilde eklenmesi yüzeydeki lipid yapılarını tedirgin eder. Birden fazla lipid yayılır gözlemledikten sonra, yavaş yavaş otomatik pipet ile ortam tampon kaldırın. Öyle ki, sadece ince bir tampon film altta kalır.
Hızlı kaldırma önlemek için dikkat edin. Gözlem odasını otomatik pipet kullanarak şelatör HEPES tamponuyla yavaşça doldurarak ortam tampon değişimine devam edin. Ani eklemekaçının.
Son adım, DLBM'nin çok lameller veziküllere çekilmesi ve geri çekilmesi sonucu oluşan dinamik nanotubular ağlar verir. Burada protokolde elde edilen nanotüp ağlarının mikrografları gösterilmiştir. Bu resimde, sürekli parlak kırmızı bölgeler, mavi kesikli çizgiyle işaretlenmiş Olan DLBM'nin geri çekme fraksiyonudur.
Burada gösterilen, kontrastı artırmak için ters çevrilmiş bir boru ağının bir mikrografıdır. Burada, boru yoğunluğunun azalması üç saat 20 dakika boyunca bir membran bölgesinde gösterilir. Boru yoğunluğundaki azalma, DLBM'nin yüzeyden çekilmesinin ardından kademeli olarak depinning sonucu oluşur.
Kalsiyum aracılı sabitleme noktalarının yerleri, tüplerin terminal veya keskin dönüşlere sahip olduğu noktalar olarak belirlenebilir. Keskin dönüşler, tüplerin hizalanması yönünde ani kayma nedeniyle v kavşakları veya dönüm noktaları olarak adlandırılır. Bitiş noktası, tüpün geri çekilmesini engelleyen tüpün son noktasını temsil eder.
Yayılma uzun süre devam ederse, membran gerilimi yırtılmalara yol açar. Lipidler floresan olarak etiketlendiği için, yırtılma doğrudan görülebilir. Yırtılma önemli bir göstergesi yırtık bölgede floresan yoğunluğunda önemli bir düşüş.
Numunenin tamamen susuz kalması veya tamponların hızlı bir şekilde değiştirilmesi yamalarda rahatsızlık, yırtılma veya deformasyona neden olur. Modelin karmaşıklığı lipid proteinleri gibi ER ilişkili bileşenler eklenerek inşa edilebilir. Ve bu model aynı zamanda kendi kendine montaj, nanofluidics, marangoni akışı ve taşıma olayları çalışma ima edilebilir.
Kloroform zehirli ve son derece uçucu her zaman bir duman başlık altında ele alınmalıdır ve polivinil asetat laboratuvar eldivenleri de dahil olmak üzere ilgili kişisel koruyucu ekipman ile, laboratuvar önlüğü, ve güvenlik gözlükleri.
