Bu çalışma ve 2,10 olarak anılan, finansmanı, Yaşlılık Araştırma, Edward P. Stiles Fonu ve Kuzeybatı Louisiana Biyomedikal Araştırma Vakfı Amerikan Federasyonu MF Salvatore bir araştırma hibeler ile, kısmen sağlandı ve Ike Muslow predoctoral Kardeşliği BS Pruett için, LSU Sağlık Bilimleri Merkezi-Shreveport.

<ol>
	<li>Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substantia+nigra+pars+reticulate+is+a+highly+potent+site+of+action+for+the+behavioral+effects+of+the+D1+antagonist+SCH23390+in+rat.">Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat.</a> Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+reveals+a+role+for+nigral+tyrosine+hydroxylase+ser31+phosphorylation+in+locomotor+activity+generation.">Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation.</a> PLoS ONE. 4, e8466 (2009).</li><li>Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+controls+persistence+of+long-term+memory+storage.">Dopamine controls persistence of long-term memory storage.</a> Science. 325, 1017-1020 (2009).</li><li>Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+dopamine+regulation+in+mesoaccumbens+pathway+in+response+to+non-contigent+binge+and+escalating+methamphetamine+regimens+in+the+Wistar+rat.">Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat.</a> Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).</li><li>Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+infusion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+into+the+ventral+tegmental+area+induces+long-lasting+potentiation+of+cocaine+seeking+after+withdrawal.">A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal.</a> J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).</li><li>Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+reverses+toxin-induced+injury+to+midbrain+dopaminergic+neurons+in+vivo.">Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.</a> Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).</li><li>Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+GDNF+administration+increases+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+rat+striatum+and+substantia+nigra.">Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra.</a> J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).</li><li>Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ventral+tegmental+area+glial+cell-line+derived+neurotrophic+factor+in+incubation+of+cocaine+craving.">Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving.</a> Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).</li><li>Lavicky, J., Dunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticotropin-releasing+factor+stimulates+catecholamine+release+in+hypothalamus+and+prefrontal+cortex+in+freely+moving+rats+as+assessed+by+microdialysis.">Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis.</a> J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomy+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+regulation+between+somatodendritic+and+terminal+field+areas+of+nigrostriatal+and+mesoaccumbens+pathways.">Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways.</a> PLoS ONE. 7, e29867 (2012).</li><li>Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+nigrostriatal+and+mesolimbic+systems+in+vivo:+Effects+of+acute+haloperidol+and+related+compounds.">Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds.</a> J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).</li><li>Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-stimulated+catecholamine+biosynthesis:+involvement+of+protein+kinases+and+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+sites+in+situ.">Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ.</a> J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).</li><li>Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serine-19+phosphorylation+in+regulating+tyrosine+hydroxylase+studied+with+site-+and+phosphospecific+antibodies+and+site-directed+mutagenesis.">Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis.</a> J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).</li><li>Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tyrosine+hydroxylase+activity+and+phosphorylation+at+ser19+and+ser40+via+activation+of+glutamate+NMDA+receptors+in+rat+striatum.">Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum.</a> J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Şekil 1 &#39;de belirtildiği gibi, yukarıda detaylı yöntemler dopamin birden readouts ve sıçan veya fare ya elde SN ya VTA bir numuneden olan proteinleri düzenleyen TH, DAT ve VMAT2 vermelidir. Yine, bu Protokolün yürütülmesi yararları araştırmacı dopamin hemen her deneysel paradigma altında in vivo olarak düzenlenir ve bunu yaparken, herhangi bir gerekli hayvan sayısını azaltarak önemli deneysel kaynak tasarrufu nasıl bir operasyonel eşleştirilmiş girilmesi gerekmektedir olmalarıdır...

HPLC sisteminde: Temel sistemimizin, bir Shimadzu LC10-ADvp HPLC pompası, bir Waters WISP 717 otomatik örnek enjektör, bir 250 mm x 4.4 5 mikron Spherosorb ODS-1 C18 ters faz kolonu (Waters), bir Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual camsı oluşmaktadır karbon elektrot, iki BAS LC4B elektrokimyasal dedektörler ve Waters 2 veri toplama ve entegrasyon sistemi güçlendirin. Sütun 30-45 tutulur ° C (BAS LC22A kolon ısıtıcı). Mobil faz, 0.1 M sodyum fosfat (pH 3,0), 0.1 mM EDTA, 1-oktan sülfonik asit (Eastman Kodak) 0,2-0,4 mM, ve bir 0.45 mikron filtre ile filtrelenmiştir% 0.35 asetonitril (v / v) &#39;dir. Akış hızı 1.2 ml / dak taşımaktadır. Mobil faz dört litrelik gruplar pH, oktan sülfonik asit ve kolon sıcaklığı ayarlayarak ayırma için optimize edilir. Mobil faz geri kazanılır ve sürekli çözünmüş oksijen kaldırmak için helyum gazı ile temizlenir. Mobil faz, geri dönüşümümakul bir zaman süresi için iyi çözünürlük korumak için hemen hemen esastır. Mobil faz raf ömrü her dönem ilk 2-7 dakika boşa aktarmak için bir akış anahtarı (entegratör tarafından kontrol) ile korunur. Elektrotlar bir Ag/AgC1 referans elektroduna göre yaklaşık 0,78 ve 0.95V potansiyelleri az tutulur. Yüksek potansiyel olarak elektrot triptofan (NMDA ve dahili standart) tayin edilmesi için özel olarak kullanılır. 0.78 V potansiyel triptofan dışındaki monoaminler ve bileşiklerin tespiti için gürültü oranı üstün bir sinyali sağlar. Kromatogramlar güçlendirin iş istasyonunun sabit diskinde saklanan ve daha sonra işlenmiş ve veri metabolit miktarları ve grup veri derleme hesaplanması için bir Excel doğrudan aktarılır. Pompa: Shimadzu LC-10AD Hücre: BAS Çapraz Akış. Camsı karbon 0.780 ile 0.9 elektrot çalışma50 V potansiyel. Dedektör: BAS LC-4B çift kanal modunda çalıştırılır. Veri ACQ. Sistem: Waters Pro 2 güçlendirin. Enjektör: Waters WISP 717 Sütun: Waters Spherosorb ODS-1, 5 uM partikül, 4.4 mm X 250 mm. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> - JT Baker </td><td> 4095-02 </td></tr><tr><td> Trizma Base </td><td> Sigma </td><td> T1503-1KG </td></tr><tr><td> Trizma HCl </td><td> Sigma </td><td> T3253-1KG </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Sigma </td><td> G8773-500 ml </td></tr><tr><td> PVP-40 </td><td> Sigma </td><td> PVP40-1KG </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td></tr><tr><td> Tween20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 ml </td></tr><tr><td> Glisin </td><td> Sigma </td><td> G8898-1KG</td></tr><tr><td> Ponceau S </td><td> Fluka </td><td> 81460 </td></tr><tr><td> Bromophenol Mavi </td><td> Sigma </td><td> B8026-5G </td></tr><tr><td> Ditiyotretol </td><td> Sigma </td><td> D-9163 </td></tr><tr><td> Protein Standart 2 mg BSA </td><td> Sigma </td><td> P5619-25VL </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Testi Reaktif A </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 23223 </td></tr><tr><td> Hassas Plus, Protein Standart </td><td> Bio Rad </td><td> 161-0373 </td></tr><tr><td> [125l]-protein A, spesifik aktivite </td><td> Perkin-Elmer </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2. Özel reaktifler. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifler </td><td> Formüller </td></tr><tr><td> % 10 SDS </td><td> 10 g SDS, 100 mL DI H 2 0 </td></tr><tr><td> % 1 SDS (pH 8.2) </td><td><ol><li> 10 mL% 10 SDS </li><li> 60.5 mg Trizma Tabanı </li><li> 37.22 mg EDTA </li><li> 90 mL DI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> Bakır II Sülfat Çözüm </td><td><ol><li> 1 g bakır sülfat II </li><li> 25 mL DI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> 3X Örnek Tampon </td><td><ol><li> Trizma Base 2.27 g </li><li> SDS 6 g </li><li> Ditiyotretol 0.463 g </li><li> Gliserol 30 g </li><li> Bromophenol Mavi 10 mg </li><li> Dih 2 0 (ilk H 40 ml reaktiflerin üzerinde Mezür 2 0 ekleyin; hacmi 100 ml ulaşana kadar daha sonra H 2 0 ekleyin) </li><li> HCI (ekledikçe 6.85 pH ulaşmak için gerekli) </li><li> 50 2.0 ml tüpler çözüm dondurun. </li></ol> (100 ml yapar): 3X Örnek Tampon hacmi ihtiyaç = örneğinde kullanılan SDS ½ hacmi. </td></tr><tr><td> 1X Örnek Tampon </td><td> DI H 2 0 kullanarak 1X örnek tampon 3X Örnek Tampon aşağı sulandırınız </td></tr><tr><td> 10X<html> Tampon Koşu (4 L yapar) </td><td><ol><li> Trizma Bankası 121.1 g </li><li> Glisin 577 g </li><li> SDS 40 g </li></ol></td></tr><tr><td> 10X Transferi Tampon: (4 L yapar) </td><td><ol><li> Glisin 360 g </li><li> Trizma Base 96 g </li></ol></td></tr><tr><td> Ponceau </td><td><ol><li> Ponceau S. 0.5 g </li><li> Asetik asit 5 mL </li><li> DI H 2 0 95 mL </li></ol></td></tr><tr><td> .2% HCl </td><td> DI H 2 0 500ml 5.2 mL HCl </td></tr><tr><td> PVP-T20 soln engelleme. (4 L yapar) </td><td><ol><li> PVP-40 40 g </li><li> DPBS 38.2 g </li><li> Tween20 2 g </li><li> Thimerisol 0.4 g </li><li> 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 500 ml DI H 2 0 13.9 g Tris Base) - 50 ml </li></ol></td></tr><tr><td> 10X Blot Tampon (4 L yapar) </td><td><ol><li> Tween 20 20 g </li><li> Tris Base 14 g </li><li> Tris HCI 61 g </li></ol></td></tr></tbody></table>ontent &quot;&gt; Tablo 3. Protein Testi ve Western Blot Formüller. Tirozin hidroksilaz standartları: Bu laboratuvar tarafından kullanılan kalibre TH protein ve fosforilasyon standartları sonuçta Dr John Haycock 11 laboratuar kaynaklı önceden ayarlanmış TH standartlarına karşı TH ve protein fosforilasyon stoichiometries için analiz edildi PC12 hücre ekstreleri, türetilen .

comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area

Dopamin MSS bir gayretle çalıştı nörotransmitterdir. Nitekim, lokomotor aktivite ve ödül ile ilgili davranışı kendi katılımı dopamin regülasyonu ile ilişkili moleküler eksikliklerin bir soruşturma beş yıl teşvik etti. Nigrostriatal ve mesoaccumbens yolların terminal alanında bölgelerde düzenlenmesi için moleküler temeli üzerine beyin odak dopamin yönetmeliğin bu soruşturmaların çoğunluğu, striatum ve nukleus akumbens. Ayrıca, bu tür çalışmaların sadece ıslak doku ağırlığı normale dopamin doku içeriğinin analizi üzerinde yoğunlaşmıştır. Böyle tirozin hidroksilaz (TH) protein, TH fosforilasyon, dopamin taşıyıcısı (DAT) ve veziküler monoamin transporter 2 (VMAT2) protein olarak, dopamin düzenleyen proteinlerin incelenmesi genellikle aynı örnek dopamin doku içeriğinin analizini içermez. Dopamin doku içeriği ve düzenleyen proteinleri (post-tra dahil olmak üzere her iki analiz yeteneğinslational değişiklikler) protein düzeyi ve TH, DAT, ya VMAT2 fonksiyonu ile dopamin arasındaki ilişkiyi yorumlama doğasında güç verir, aynı zamanda örnek ekonomisi uzatır sadece. Henüz daha az maliyet ve çevirmenize araştırmacılar &#39;seçim hemen her paradigma dopamin moleküler düzenlenmesi irdeliyoruz üretir. Biz orta beyindeki analizleri odaklanır. SN ve VTA genellikle dopamin regülasyonu en çalışmalarda ihmal rağmen, bu çekirdekler kolayca uygulama ile disseke edilir. Kapsamlı bir dopamin doku içeriği ve TH okuma, DAT, ya VMAT2 yapılabilir. Orada davranışı SN ve VTA dopamin fonksiyonunun etkisi literatürde filizlenen ve orada 1-5 eksojen maddeler veya hastalık süreçleri sıkışmaları edilir. Ayrıca, bu tür büyüme faktörleri gibi bileşikler SN veya VTA içinde nispeten büyük ölçüde, dopamin ve dopamin düzenleyen proteinler üzerinde derin bir etkiye sahiptir <sup&gt; 6-8. Bu nedenle, bu yöntem özel tedaviler davranış ve dopamin regülasyonu modüle nasıl Araştırmalarına uzatmak istiyorsanız laboratuvarlar referans sunulmuştur. Burada, çok adımlı bir yöntem dopamin doku içeriğinin analizi, TH protein düzeyleri, DAT, ya VMAT2 ve kemirgen ortabeyin gelen substantia nigra ve VTA gelen TH fosforilasyon için sunulmuştur. TH fosforilasyon analizi sadece TH aktivitesi nasıl düzenlendiği, aynı zamanda belirli bir paradigma içinde somatodendritik çekirdeklerinde etkilenen sinyal kademelerin önemli anlayışlar elde edebilirsiniz. Biz bu iki çekirdeğin ve her çekirdek (Şekil 1) için spesifik in vivo dopamin regülasyonu moleküler mekanizmaları, ortaya bir profil üreten disseke doku örnek işleme ayırmak diseksiyon tekniği örneklerle gösterecek.

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area at JoVE.com

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamin belirgin hücre gövdeleri ve dopamin nöron dendritler içeren Ortabeyin çekirdekler, düzenlenmiştir. Burada substantia nigra (SN) ve kemirgenlerde ventral tegmental alan (VTA) ve orta beyin çekirdeklerinde dopamin regülasyonu üzerine, böylece bir diseksiyon ve örnek işleme sonuçları maksimize etmek için yaklaşım, sonuç ve görüşlerini açıklar.

Substantia nigra ve ventral Tegmental Bölgesi Dopamin Yönetmelik Kapsamlı Profilleme

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

comprehensive-profiling-dopamine-regulation-substantia-nigra-ventral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.6K Görüntüleme.  Louisiana State University Health Sciences Center. Dopamin belirgin hücre gövdeleri ve dopamin nöron dendritler içeren Ortabeyin çekirdekler, düzenlenmiştir. Burada substantia nigra (SN) ve kemirgenlerde ventral tegmental alan (VTA) ve orta beyin çekirdeklerinde dopamin regülasyonu üzerine, böylece bir diseksiyon ve örnek işleme sonuçları maksimize etmek için yaklaşım, sonuç ve görüşlerini açıklar.