This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 - 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

NOT: farelerin beyin dokusu Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uygun olarak kullanılan, ve çalışma protokolleri Mississippi State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Slaytlar ve Doku 1. Hazırlık <ol><li> Silan-hazırlık slaytlar veya polietilen naftalat (PEN) membran cam slaytlar kullanın. </li><li> RNA izolasyonu için, RNaz dekontaminasyon çözelti içinde daldırma slaytlar, daha sonra RNase içermeyen su ile 3 kez yıkanır, 30 dakika için RNase içermeyen etanol ve vakumda kurutun kademeli bir dizi dihidrat. </li><li> Bir sirostat kullanılarak 10 mikron kalınlığında doku bölümleri kesin ve hazırlanan RNazsız kızaklar üzerinde monte. RNA kalitesini korumak için kesit sırasında donmuş bölümleri tutun. NOT: Doku yaklaşık 4 mm uzakta slayt kenarlarına çok yakın olan doku kaldıramazsınız LCM olarak slayt kenarlarından olduğundan emin olun. Order PEN membran slayt doku kaldırmak doku sol, üst ve alttan 4 mm ve slayt bağlı olmayan zarın boyutları slayt sağ tarafında 7 mm olmasını sağlamak için. </li><li> Silan-hazırlık slaytlar veya PEN membran slaytlar ya direk immunhistokimya, bölüm doku kullanarak bireysel hücre popülasyonlarının izolasyonu için. Dolaylı immünohistokimya destekli teknikler kullanılarak doku bölgelerin izole edilmesi için, LCM için kullanılacak PEN membran sürgü ve / veya silan-preparatif sürgü ya da immünohistokimya ve diğer bölümleri için bir Silan preparatif slayt bölümlere bir set monte edin. </li></ol> Lazer Yakalama 2. Doku Hazırlık - İmmünoeaktif Hücreleri Doğrudan Lazer Yakalama Hızlı Tirozin Hidroksilaz İmmünhistokimya <ol><li> Hidrofobik kalemle doku anahat ve kurumasını bekleyin. </li><li> Aseton-metanol doku saptamak (1: 1), 10 dakika boyunca -20 ° C&#39;de çözelti. NOT: OuR deneyimi aseton-metanol tespit tek başına aseton veya metanol çok daha tutarlı bir immünohistokimya ile sonuçlandığını göstermiştir. </li><li> Fosfat içinde durulayın slayt% 1 Triton (RNase içermeyen) ile tuzlu su (PBS) ilave edilmeden. </li><li> 400 U / ml RNasin 100: tirozin hidroksilaz antikor ile% 1 Triton ile 100-200 ul PBS ile kapak bölümleri 1 seyreltilmiş. 5-10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Iki kez kısaca PBS içinde durulayın ve PBS-% 1 Triton. </li><li> 100 PBS-% 1 Triton 400 U / ml RNasin ve 50 ng / ml DAPI ile: 1 seyreltilmiş Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiş keçi anti-tavşan IgG, 100-200 ul doku örtün. 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> PBS içinde 2 kere yıkayın, sonra RNazsız etanol serileri içinde 30 saniye dihidrat (% 75 -75,% -95% -95% -100% -100%). </li><li> 1 dakika, 5 dakika boyunca Ksilen iki yıkama içinde inkübe edin. </li><li> Hemen önce LCM için kullanmak ve kurumaya izin Ksilen slaytları çıkarın. </li></ol> Lazer Yakalama 3. Doku Hazırlık - Tirozinİmmünoeaktif Bölgeler Dolaylı Lazer Yakalama Hidroksilaz İmmünhistokimya <ol><li> Bölümlere bitişik bölümler ile işlem, bir slayt Silan hazırlık ve / veya immünohistokimya PEN zar parçalan üzerine yerleştirildi. NOT: Burada kullanılan Prosedürler önce 5 bildirilenlere benzerdir. Gösteri görüntüler için, diaminobenzidin (DAB) Chromagen reaksiyon ilgi tirozin hidroksilaz nöronlar görselleştirmek için kullanıldı. </li><li> LCM için kullanılan slaytlar için, 4 ° C&#39;de,% 100 aseton içinde 5 dakika boyunca sabitleyin. </li><li> RNazsız etanol serileri içinde doku kurutmak (% 75 -75,% -95% -95% -100% -100%) 1 dakika her biri için. </li><li> 1 dakika, 5 dakika boyunca Ksilen iki yıkama içinde inkübe edin. </li><li> Hemen önce LCM için kullanmak ve kurumaya izin Ksilen slaytları çıkarın. </li></ol> 4. Lazer Yakalama Mikrodiseksiyon Sisteminin Kullanılması NOT: LCM uygulama programı 10 Alet çubukları ve kontrol 2 pencere varmikrodissek- prosedürü. Aracı Barlar: 1. Mikroskop, 2. Yakalama Lazer, 3. Kesim Lazer, 4. Eğitim, 5. Navigasyon, 6. Malzemeler, 7. Yakalama Gruplar, 8. Mikrodisseksiyon, 9. Yazı, 10. Ek Açıklama. Windows: 1. Canlı Video ve 2. Yol Haritası. <ol><li> LCM sistem yazılımı Malzeme araç çubuğunda &quot;Açık Kapı&quot; sekmesini seçerek kapıyı açın. </li><li> Mevcut üç yuvaları Yük kayar. Bu gösteri için, tirozin hidroksilaz immunohistokimyasal yük bir slayt DAB, bir Silan-hazırlık slayt ve bir PEN membran slayt hızlı floresan tirozin hidroksilaz immünohistokimya için etiketli her ile görüntülendi. Tipik bir deneyde, doğrudan lazer yakalama için floresan tirosin hidroksilaz ile etiketlenmiş tirosin DAB kullanılarak hidroksilaz ve slaytlar için etiketli referans slayt ya etiketlenmemiş aseton sabit bölümleri kullanabilir. </li><li> Mevcut yuvaya LCM kapakları yükleyin. NOT: Makro ve HS LCM kapaklar kullanıma hazır. LCM kapağı türü de kullanmak içinhücreler ya da doku miktarı sayısı basımınızın toplanacak. Makro slaytlar HS kapaklar birkaç yüz toplayabilir ise birkaç bin hücrelere kadar toplamak için listelenir. Makro slaytlar fazla doku toplama sağlar ancak liziz tamponu 50 ul gerektirir. Adaptörleri ile kullanıldığında HS kap, RNA daha orantılı kurtarma sağlar lizis tamponu sadece 10 ul gerektirir. </li><li> Kapıyı kapatın. </li><li> Tüm slayt bir çalışma görünümünü sağlar Yol Haritası penceresini etkinleştirmek için slayt yükleyin, bu (Şekil 3) ilgi bölgenin seçimi için izin verir. Ilgi alanına gitmek için Canlı video penceresinde Yol Haritasını görüntüleyin. </li><li> Malzemeler araç çubuğunda, slayt yuvasının yukarıdaki kutuyu işaretleyerek PEN membran slaytlar tespit. Kap özelliklerini sağlamak için, sağ Malzeme araçları çubuğunda kapaklar üzerine tıklayın ve &quot;Cap arz özellikler&quot; i seçin. Kapaklar konumunu gösteren onay kutularını ve ya Ma seçincro veya HS kapaklar. </li><li> Floresan lamba açmak ve floresan lamba ısınmak için izin Mikroskop araç çubuğunda &quot;Floresan&quot; sekmesini seçin. Sırasıyla, Alex Fluor 488 ve DAPI görselleştirmek için Mavi ve UV filtreleri kullanın. Floresan etiketli hücreleri görmek için resmin hassasiyetini artırmak için &quot;Kamera Ayarı&quot; sekmesini kullanın. </li><li> Malzemeler araç çubuğunda, sağ kapağın üzerine tıklayın ve ilgi slayt taşıyın. Canlı Video penceresinde görünen bölgeyi seçmek için Yol Haritası Bir yere çift tıklayın. Bir Yol Haritası bölgeyi (çift sol tıklama) ve daha sonra sağ tıklayarak ve seçme seçerek slayt etrafında kapağı Taşı &quot;merkez bölgede yer kapağını.&quot; </li><li> IR yakalama lazer kullanmadan önce, amacı ve gücü için ayarlayın. Uzakta dokudan slayt bir bölgede kapağı yerleştirin. Yakalama Lazer araç çubuğunda, &quot;Enable&quot; ı seçin. Güç (3-100 mW), Pulse ayarlayın (100-1000000 μ; Sn) ve lazer # Hits. Kapak dokusu olmadan slayt bir kısmı üzerinde olduğunda IR lazer Yangın ve lazer yeterince LCM kap membran erir olmadığını görmek için kontrol edin. NOT: kapağı polimer membran eriyor Bu denir ıslatma temas cam slayt böylece. Karanlık bir halka açık halka (yeterli ve yetersiz erime örnekleri için Bkz: Şekil 4) merkezi ile slayt kaynaşmış yeterli ıslatma görülebilir. Islatma yeterli değilse, bu elde edilene kadar, tekrar güç ve nabız, ateş ve test ayarlayın. Buna ek olarak, lazer birden yangınları da kullanılabilir. </li><li> IR lazer yoğunluğu ayarlanır zaman, sağ tıklayın ve lazer amacı &quot;Yakalama lazer burada&quot; seçeneğini seçin. NOT: Bu adım IR yakalama lazer dokusu hedefleniyor bilgisayar söyler. Lazer amaçlayan bu adım önemlidir ve kapak hareket her zaman tekrarlanması gerekir ya da nesnel değiştirilir. </li></ol&gt; Silan-hazırlık Slaytlar kapalı Bireysel Dopamin Nöronlar 5. Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon <ol><li> Hücreleri yakalamak için ilgi bölgeye taşıyın. NOT: izole dopamin nöronlarının örneği burada gösterilmektedir. </li><li> Bir Silan-hazırlık slayt kapalı bireysel hücrelerin yakalamak için, Mikrodiseksiyon araç çubuğunda ardından &quot;tek nokta&quot; simgesi &quot;LCM&quot; sekmesini seçin. </li><li> Mikroskop araç çubuğunda, uygun filtreler seçmek için floresan filtreleri sekmeleri ile floresan ve parlak alana arasında geçiş yapmak için &quot;Shutter&quot; sekmesini kullanın ve büyütmesini değiştirmek için hedefleri sekmeleri kullanın. Ilgi hücreler Canlı video penceresinde görünür sonra, hücrelerin yaklaşık boyutu ilgi hücreleri işaretlemek için kullanılan nokta boyutunu ayarlamak. Daha sonra karşı tarafta tıklayarak takip lekeli bir hücrenin, bir tarafında tıklayarak Yakalama Lazer araç çubuğunda Nokta sekmesini tıklatarak bunu. NOT: Bu hesaplarspot çapı ve değerini gösterir. </li><li> &quot;Tek nokta&quot; simgesi seçili iken onlara tıklayarak ilgi hücreleri işaretleyin. Her hücrede bir nokta işaret yerleştirmek için bunu yapın. Burada, Mavi filtre ve 10X objektif dopamin nöronları görselleştirmek için kullanılır. Tekrar test ve adım 4.9 ve 4.10 açıklandığı gibi altındaki hiçbir doku olduğu yerde kapağı IR lazer hedefliyoruz. </li><li> Otomatik olarak seçilen tüm işaretli hücreleri ateş edecek Mikrodiseksiyon araç çubuğunda ve IR lazer sekmesini - hücreler işaretlendikten sonra, &quot;kesme ve yakalama git&quot; seçeneğini seçin. Gerekirse Ayrıca, ilgi herhangi bir noktasında (Şekil 5D) manuel IR lazer ateş. </li><li> Hücreler LCM kapağı üzerine ele geçirildi olmadığını kontrol etmek için uzağa bölümünden ve slayt açık bölge üzerine kapağını taşıyın. Ilgili hücreler sürgü (Şekil 5B, D) çıkarılır ve LCM kapak (Şekil 5C, K) bağlı olduğundan emin olun. Belge inciMikroskop araç çubuğunda &quot;Yakalama görüntü&quot; sekmesine tıklayarak süreçtir. </li><li> Doku toplama bittiğinde, kap sağ tıklayarak kapağı çıkarın ve ardından &quot;Taşı&quot; seçeneğini &quot;Boşaltma.&quot; </li></ol> PEN Membran Slaytlar kapalı Bireysel Dopamin Nöronlar 6. Lazer Yakalama <ol><li> IR ve UV lazerler her ikisini de kullanarak PEN membran slaytlar kapalı bireysel hücrelerin yakalamak için, seçeneğini &quot;Kes ve Yakalama&quot; Mikrodiseksiyon araç çubuğunda sekmesini. Ilgi hücreleri işaretlemek için &quot;tek nokta&quot; sekmesini seçin. Her hücre anahat &quot;Kes çizgi&quot; sekmesini kullanın. Adım 4.9 ve 4.10 açıklandığı gibi kızılötesi lazer sınamak emin olun ve düşünce kesmek için gerekli olan minimum yoğunluğunu PEN membran ve doku belirlemek için UV lazer testi (Şekil 4 ve 5) </li><li> Mikrodiseksiyon araç çubuğundaki &quot;Yakalama ve Kes&quot; sekmesini seçin. Bu tekniği kullanarak bireysel hücrelerin toplarken, olmakOnlar LCM kapağı yapıştırılmış edilmeden önce kesip eğer öncelikle bu küçük parçalar UV lazer takip IR lazer yangın emin kaybolmuş olabilir. NOT: Bu işlem aynı zamanda ilgi noktada IR lazer ateş elle yapılabilir ve hücreler ayrı ayrı UV lazer ile özetlenen. </li><li> Hücreler ayrılmış ve kapak (Şekil 6) bağlı olup olmadığını saptamak için adım 5.7, yukarıda anlatıldığı haliyle ilgi konusu hücrelerin toplanmasından sonra, lcm kapağı hareket ettirin. </li><li> Doku toplama bittiğinde, sağ kapağı tıklayarak ve seçerek kapağı çıkarın, sonra &quot;Taşı&quot; &quot;Boşaltma.&quot; </li></ol> 7. Silan-hazırlık Slaytlar gelen ventral tegmental alan yakalama <ol><li> Ilgi bölgeyi tanımlamak için, immünohistokimya için işlenmiş slayt kullanın. NOT: ventral tegmental alan izole edilir, bu gösteri (Şekil 7A) için. </li><li> Bir LCM kapağı yükleyin ve adım gibi lazerler testi4.9 ve 4.10 s. NOT: Genellikle, bir makro LCM kap kullanılır, ancak bir HS kapağı da (Şekil 8 bakınız) kullanılabilir. </li><li> Mikrodiseksiyon araç çubuğunda &quot;LCM&quot; sekmesini seçin, Silan-hazırlık slayt doku bölgesini (yani, ventral tegmental alan) izole etmek, ardından &quot;çokgen-dış&quot; sekmesini seçin. Canlı Video penceresinde ilgi bölgeyi Anahat. Toplama alanın büyüklüğüne bağlı olarak, düşük büyütme (2X Amaç) de ilgi bölgeyi anahat. Toplanması için, ancak, enstrüman 10X objektif şekilde ayarlayın ve yakalama için 10X objektif altında IR lazer önce nişan kullanır. </li><li> Mikrodiseksiyon araç çubuğunda - &quot;yakalama ve kesim git&quot; sekmesini seçin. NOT: Bilgisayar otomatik olarak tüm seçilen alanda (Şekil 7F, ben) boyunca IR lazer ateş edecek. LCM membran alanı boyunca yeterince erimiş değilse, lazer adam ateş olabilirually veya tüm işlem tekrarlanır. </li><li> Doku toplandı ne kadar iyi belirlemek için doku kapalı LCM kapağını hareket ettirin. NOT: Bu yöntemi kullanarak bir geçiş tipik slayt (Figure7G bakınız) arkasında bazı doku bırakır. Bu durum ortaya çıkarsa, seçim tekrarlayın ve yukarıdaki adımı yakalamak. Bu adımı tekrarlanması (Şekil 7J) toplanan doku miktarını artırabilir. </li><li> Doku toplama bittiğinde, sağ kapağı tıklayarak ve seçerek kapağı kaldırmak ardından &quot;Taşı&quot; &quot;Boşaltma.&quot; </li></ol> 8. PEN Membran Slaytlar gelen ventral tegmental alan yakalama <ol><li> Yukarıdaki gibi PEN membran slaytta dokudan ilgi bölgeyi seçmek için bir rehber olarak immünohistokimya için işlenmiş slayt kullanın. </li><li> Mikrodiseksiyon araç çubuğunda &quot;Kes ve Yakalama&quot; sekmesini seçin. &quot;Kes Çizgi&quot; sekmesini seçin ve immunohistoche kullanarak ilgi bölgeyi anahatmistry bir rehber olarak slayt etiketli. NOT: Program otomatik kap doku eklemek için IR lazer noktalar katacak. Daha kapağa doku sabitlemek için ek noktalar eklemek için &quot;tek nokta&quot; sekmesini kullanın. </li><li> 10X objektif test ateşi altında ve 4.9 ve 4.10 açıklandığı gibi IR ve UV lazer hedefliyoruz. UV lazer slayt ve bu kesim bilgisayar ekranında yere karşılık geldiğini zarı nüfuz edebilir ki sınayın. Zar ve doku kesmek için yeterli olan, ancak doku (Şekil 5) zarar vermez UV lazer gücü kullanarak. </li><li> Mikrodiseksiyon araç çubuğunda - &quot;yakalama ve kesim git&quot; sekmesini seçin. NOT: Bilgisayar otomatik olarak sonra kapağı ekleyin slayt PEN membran ve doku (Şekil 7C) kesmek için UV lazer ateş doku içinde tüm etiketli noktalar IR lazer ateş edecek. Ek IR erimiş noktalar yeterli tis takmak gerekebilirelle de eklenebilir LCM kapağı için dava. </li><li> Doku kısmında (Şekil 7C) çıkarılır ve kapağın (Şekil 7C) bağlı olup olmadığını belirlemek için doku kapalı lcm kapağını hareket ettirin. </li><li> Doku toplama bittiğinde, sağ kapağı tıklayın ve ardından &quot;Taşı&quot; seçeneğini, kapağı kaldırmak için &quot;Boşaltma.&quot; </li></ol> RNA izolasyonu 9. <ol><li> Çekilen hücre veya doku RNA toplamak için, 37 ° C &#39;de 30 dakika süre ile, RNA liziz tamponu içinde LCM kap membran inkübe edilir. Not: HS kapaklar, bir adaptör başlıkta liziz tamponu sadece 10 ul kullanımına izin veren bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü verdiği mevcuttur. Makro kapaklar liziz tamponu içinde 50 ul gerektiren ve 0.5 ml mikrosantrifüj tüpüne doğrudan bağlanmaktadır. </li><li> İnkübasyondan sonra, 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine lizis tamponu döndürün. </li><li> O tüm hücrelerin tam parçalama sağlamak içinr dokusu, lizis tamponunda kapağı ve yer LCM kap zarının kapalı kabuğu. </li><li> RNA bütünlüğü test etmek için, kullanım RNA LCM RNA bütünlüğünü ölçmek için sonra slayt üzerinde ve geri kalan dokulardan izole edilmiştir. NOT: LCM ile elde edilen sınırlı numune RNA, bu LCM izole RNA RNA bütünlüğünü test etmek için genellikle pratik değildir dolayı, ancak, kalan dokudan RNA nedeniyle esnasında tespit, immünohistokimyasal ve zaman herhangi bir RNA bozulması iyi bir gösterge sağlar LCM prosedürü. </li></ol>

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Schutze, K., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+expressed+genes+by+laser-mediated+manipulation+of+single+cells.">Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells.</a> Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).</li><li>Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+micromanipulation+systems+as+universal+tools+in+cellular+and+molecular+biology+and+in+medicine.">Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine.</a> Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).</li><li>Vandewoestyne, M., Van Nieuwerburgh, F., Van Hoofstat, D., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+DNA+extraction+protocols+for+forensic+STR+typing+after+laser+capture+microdissection.">Evaluation of three DNA extraction protocols for forensic STR typing after laser capture microdissection.</a> Forensic Science International Genetics. 6, 258-262 (2012).</li><li>Eells, J. B., Wilcots, J., Sisk, S., Guo-Ross, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NR4A+gene+expression+is+dynamically+regulated+in+the+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+and+is+related+to+expression+of+dopamine+neurotransmission+genes.">NR4A gene expression is dynamically regulated in the ventral tegmental area dopamine neurons and is related to expression of dopamine neurotransmission genes.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 46, 545-553 (2012).</li><li>Seelan, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+analysis+of+laser+capture+microdissected+fetal+epithelia.">Epigenetic analysis of laser capture microdissected fetal epithelia.</a> Analytical Biochemistry. 442, 68-74 (2013).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-126+contributes+to+Parkinson's+disease+by+dysregulating+the+insulin-like+growth+factor/phosphoinositide+3-kinase+signaling.">miR-126 contributes to Parkinson's disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling.</a> Neurobiology of Aging. 35, 1712-1721 (2014).</li><li>Bohm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antidepressant+treatment+on+gene+expression+profile+in+mouse+brain:+cell+type-specific+transcription+profiling+using+laser+microdissection+and+microarray+analysis.">Effects of antidepressant treatment on gene expression profile in mouse brain: cell type-specific transcription profiling using laser microdissection and microarray analysis.</a> Journal of Neurochemistry. 97, 44-49 (2006).</li><li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Nurr1+maintains+fiber+integrity+and+nuclear-encoded+mitochondrial+gene+expression+in+dopamine+neurons.">Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2360-2365 (2013).</li><li>Miller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomics+in+Laser+Capture+Microdissected+Sleep+Nuclei+From+Rat+Brain.">Quantitative Proteomics in Laser Capture Microdissected Sleep Nuclei From Rat Brain.</a> Journal of Neurogenetics. , (2014).</li><li>Roberts, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+laser+capture+microdissection+and+protein+microarray+technologies+in+the+molecular+analysis+of+airway+injury+following+pollution+particle+exposure.">Application of laser capture microdissection and protein microarray technologies in the molecular analysis of airway injury following pollution particle exposure.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. A. 67, 851-861 (2004).</li><li>Yuferov, V., Nielsen, D., Butelman, E., Kreek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+studies+of+psychostimulant-induced+changes+in+gene+expression.">Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression.</a> Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).</li><li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection.">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15, 2364-2374 (2009).</li><li>Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy.">Laser capture microscopy.</a> Molecular Pathology. 53, 64-68 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

LCM bir mikroskop lamı ve RNA, mıkroRNA, DNA ve protein daha sonra izolasyon hücre veya doku kesitlerinin bir doku bölgelerin somut popülasyonlarının diseksiyon için güçlü bir tekniktir. Bu tekniklerin duyarlılığı arttırır ve gerekli başlangıç ​​malzemesi miktarı azaltılır gibi mikrodizi, yeni nesil bir RNA dizisi, DNA ve proteomik epigenetik analizi, yüksek verimli teknolojileri kullanılarak analizi ile kombinasyon halinde LCM kullanımı giderek daha yaygın hale gelmektedir 8-12. LCM ile, daha iyi bir anatomik çözünürlüğü için bir örnek elde edilir, ve bu örneklerin alt baş tedbirlerden anlama büyük ölçüde artırılmıştır. LCM ile bir uyarı, ilgi hücreleri ancak zorunlu hücre saf nüfusunun konsantre örneği sağlamasıdır. hassas sınırları komşu doku bazı kirlenme var olacağı anlamına. Ancak, bu teknik ilgi hücreleri konsantre yapardoku ve hücreleri çevreleyen ile ilgili etkilerini en aza indirmek ve ilgi hücreleri üzerinde deneysel etkileri maksimize etmek. Dolaylı İmmünohistokimya karşı doğrudan LCM anda RNA sağlam tutarak, izolasyon ve RNA ölçümü için öncelikle kullanılan olduğundan çok önemli bir kriterdir. RNA bütünlüğünü korumak (Şekil 10) RNA düşüren doğrudan doku leke gereğini kaldırır doku diseksiyonu rehberlik dolaylı immünohistokimya kullanımı asıl gerekçesi de budur. Deneysel soru, ancak, bu, dopamin nöronları gibi hücreler, belirli bir popülasyonun izole gerektirdiğinde, doğrudan floresan immünohistokimya gereklidir. Hızlı immünohistokimyasal etiketleme protokolünü kullanarak işlem sırasında RNA bozulmasını en aza indirebilirsiniz. Kısa inkübasyon süreleri, birincil ve ikincil anti-yüksek konsantrasyonlarının kullanımı nedeniyleorganları, yaklaşık 10-20 olan konsantrasyonları 2 saatlik inkübasyon geleneksel immünohistokimya için gerekli olandan daha yüksek kat. Bununla birlikte, uzun inkübasyon sürelerine ihtiyaç durumunda, Brown ve Smith, RNA bozulmasını inhibe eden ve uzun inkübasyon süreleri (20 saat kadar), 13 ile iyi kalitede RNA elde etmek için yüksek tuz tampon kullanılır. Bu yaklaşım, aynı zamanda bir LCM sistemine doku etiketleme ve alma erişim arasında gerekli önemli bir zaman varsa kullanılabilir. PEN zarın, Silan-hazırlık ve kaplanmamış cam slaytlar - slaytlar seçimi LCM kaplanmamış cam slaytların kullanımı 14 bildirilmiştir. Bu kaplama yeterince doku kaybı olmadan immünohistokimya için slayt doku ekler ama hala slayt LCM kapaklar doku eki ve kaldırılması için izin verir gibi Laboratuvarımızda, Silan-hazırlık slaytlar, optimal bir seçim olduğu tespit edilmiştir . Kaplamasız cam slaytlar varimmünohistokimyası prosedürü ile bazı doku kaybı gösterdi. Dolaylı immünohistokimyasal kullanılırsa, ancak doku tutma daha az sorun olur. Silan-hazırlık slaytlar kapalı düzgün dehidratasyon, yakalama hücreleri veya dokusu ile ilgili bir sorun olmamıştır. Bu yazıda anlatılan izole nöronların veya beyin bölgelerinde çeşitli yaklaşımların her biri avantajları ve dezavantajları vardır. Bireysel dopamin sinir hücrelerinin izole edilmesi için, silan-preparatif slaytlar kullanımı iyi optik avantajı vardır ve PEN membran slaytlar daha az pahalıdır. Orada yetersiz dehidratasyon (aşağıya bakınız) ve bazı doku slayt üzerinde kalabilir, eğer dezavantaj bazen yakalayan hücreler zor olabilir ki. PEN membranlar slaytlar avantajı IR ve UV lazer lazer kombinasyonu kullanılarak dopamin nöronları tahsil edilecektir sağlar olmasıdır. Cam slaytlar daha dehidratasyon daha az bağımlı olduğu gibi PEN membran slaytlar hücreleri toplamak için Başarısızlık neredeyse hiç oluşur. Bir<html> Ek bir avantaj, kızılötesi lazer ile cam slaytların kapalı nöronlar yakalamak için bir çevreye göre UV lazer daha yakından ilgi nöronların şekle yaklaştıkları için kullanılabilir olmasıdır. Doku bölgeleri izolasyonu için, PEN membran slaytlar üstündür ve ilave maliyet haklı. Membran üzerinde kesip tüm doku tamamen kaldırılması Bu yaklaşım sonuçları, tek başına IR lazer kullanarak ve kalın doku bölümleri toplanabilir doku geniş bir alanı yakalama daha hızlıdır. Ancak kızılötesi lazer kullanarak LCM kapak zarı tamamen tüm doku alanı üzerine erimiş olması gerekir. Ayrıca, doku eksik koleksiyonu tipik ve genellikle birden girişimleri gerektirir. Bu PEN membran slayt doku izole daha uzun sürer rağmen mevcut doku cam slayt veya UV lazer zaten ise, doku çoğu (Şekil 8J) tahsil edilebilir bu uygun bir seçenek olduğunu, mevcut değildir. ove_content &quot;&gt; Kritik adımlar % 100 etanol inkubasyon en önemli adımlardan biridir. Silan-hazırlık slaytlar hücreleri toplamak için dokusunun tam dehidratasyon gereklidir. Bu nedenle,% 100 etanol inkübasyon çoğunlukla ilişkili kaldırılmaz herhangi bir su, slaytlar hücreleri almak yeteneğini etkiler. Bu sorunu gidermek için, sık sık dehidratasyon etkileyebilir önceki yıkama adımlarından hava veya transfer suyun emilimi% 100 etanol çözümleri değiştirin. Buna ek olarak, moleküler elekler, bir su kontaminasyonu absorbe etmek için kullanılır. LCM sistemi ideal düşük nem koşulları sağlamak için bir nem alıcı ile küçük bir odada yer almalıdır. İyi karyostat bölümleri düzgün LCM için kritik öneme sahiptir. Bölümler minimize dokuda kıvrımlar düz olması gerekir. LCM kapağı arasındaki mesafeyi artırmak ve t temas engellemek olacaktır dokuda KıvrımlarO doku. Daha sonra, yeterli bir doku üzerine zar kap eritmek için zor olur. Cam slaytlar için, tipik haliyle kesit kalınlığı 6 ve 12 um arasında olması gerekmektedir. Kalın bölümler PEN membran slaytlar ile yakalanabilir. LCM mikroskop slaytlar çok hassas doku diseksiyonu ve hücreleri yapmak için bir teknik kapasiteye sahiptir. Doku parçaları brüt diseksiyon kıyasla dramatik olarak daha fazla analiz çözünürlüğünü artırır. LCM zaman ve yoğun emek olabilir rağmen, bu kapsamlı eğitim veya uzmanlık ve gerektirmez, diğer yüksek verimli teknolojiler ile birleştiğinde ayrı hücreler veya anatomik bölgeler kullanıldığında, büyük ölçüde biyolojik sürecin anlayışı geliştirmek olabilir.

<html> Tüm doku hücrelerinin bir heterozigot topluluğundan oluşmaktadır. Bu glial hücreleri (oligodendrositler, mikroglia ve astrositler) çeşitli çevrili çeşitli morfolojik ve / veya nörokimyasal farklı nöron oluşan beyin dokusu için özellikle uygundur. Ek olarak, korteks veya beyin sapı çekirdeklerinin alanlar olarak beyinde farklı bölgeler, belirli bir işleve sahiptir. Analitik teknikler (örneğin Q-PCR, mikrodiziler, RNA, DNA sekanslama proteomik) ile bir araya nedenle, özelliği belirgin bir şekilde çeşitli biyolojik süreçlerin anlaşılmasını artırabilir, hücre ya da çok küçük bir anatomik olarak farklı alanlarının özel popülasyonlarının izole edilmesi için. LCM RNA, mıkroRNA, DNA ve proteinler gibi çeşitli moleküller, daha fazla analiz için çok daha homojen bir kaynak temin eden bir mikroskop lamı üzerine dokusundan çok farklı anatomik alanlar veya belirli hücrelerin izole edilmesi mümkün kılan bir teknolojidir. t &quot;&gt; LCM ilk tanıtıldı yana, birkaç farklı yaklaşımlar dokudan 1-3 hücreleri microdissect için kullanılmıştır. erken yaklaşımlar bir kızılötesi (IR) lazer ve bir termoplastik film ve olmayan bir kullanarak bir slayt dokuya direkt eki dahil bir tüp içine, bir hücre ya da doku ve toplama ayırmak için lazer kesme bir ultraviyole (UV) ile iletişim yöntemi. Daha sonra, lcm başarılı dokularda ve hücre tiplerinde çeşitli kullanılan gösterilmiştir alt analizi için çeşitli moleküllerinin izole edilmesi ile uyumlu olacak şekilde enzimatik aktivite 1,4-7, RNA, mıkroRNA, DNA ve proteinler de dahil olmak üzere. Burada lcm bir kesme UV lazer ve hücreler ya da doku çevresinde kesme ve sabitlenmesi için bir yakalama kızılötesi lazer kullanan bir LCM sistemi kullanılarak gösterilmiştir LCM kap olarak bulunmuştur. Bu LCM sistemi plastik filme hücreleri bağlayan ve t kaldırır hücre ya da ilgi konusu doku üzerinde bir kapak ile bir plastik film eriyik IR yakalama lazer hem kullanırkapağın kaldırılması ile de doku (Şekil 1). Buna ek olarak, İR lazer ile bir arada, bir UV lazeri cut-out için doku veya sonra kızılötesi lazer (Şekil 2) ile lcm kapağa doku bağlanması ile izole edilmiş bir zar ile kaydıraklar üzerinde monte dokudan çıkar hücreleri mevcuttur. Bu tekniklerin kısa bir bakış, Şekil 1 ve 2&#39;de bulunmaktadır. Ya doğrudan fluoresan immünohistokimya ve belirli bir proteinin ifadesine dayalı bir doku bölgesinin izolasyonu için kullanılır dolaylı immünohistokimya güdümlü tekniği kullanılarak belirli hücreleri izole etmek için bu teknik üzerinde çeşitli varyasyonlar tarif edilmiştir. Spesifik olarak, substantia nigra ve ventral tegmental alan ve taze, dondurulmuş beyin dokusu RNA daha sonra tecrit izolasyondan dopamin sinir hücrelerinin izolasyonu gösterilmiştir. RNA, ölçülen moleküllerin en çok kararsız olduğu için, st (DNA ya da protein ile karşılaştırıldığında)RNA bütünlüğünü korumaya yardımcı olmak için eps dahil ve veri elde RNA miktarı ve kalitesi üzerinde gösterilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:159px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Numer&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Veritas Laser Capture Microdissection System</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:121px;">Newer model is now sold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">CapSure HS LCM Caps</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>LCM0213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">PEN Membrane slides</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>s4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Silane prep-slides</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">95% Ethanol-RNase Free</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E7148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">100% Ethanol-RNase Free</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Rnase Free Triton</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:191px;">EDM Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MX1583D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Anti-Tyrosine hydroxyase antibody</td>
			<td style="width:191px;">EDM Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>Ab152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Stratagene MX 3005P</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>401513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Nanodrop 3300 fluorospectrometer</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Quant-iT RiboGreen</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection - a demonstration of the isolation of individual dopamine neurons and the entire ventral tegmental area

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM), bir mikroskop lamı üzerine tek tek hücre veya doku kesitlerinin bir doku hassas anatomik bölgelerine konsantre bir popülasyonu izole etmek için kullanılır. Immünohistokimya ile birleştirildiğinde, lcm spesifik bir protein işaretleyiciye dayanan tek tek hücreler türleri izole etmek için kullanılabilir. Burada, lcm tekniği ile doğrudan tirosin hidroksilaz immünohistokimya ile LCM için kullanılanlara bitişik bir bölümü üzerinde dolaylı tirosin hidroksilaz immünohistokimya kullanılarak, ventral tegmental alan bölgesini içeren dopamin nöron izolasyonu için etiketli dopamin sinir hücrelerinin belirli bir nüfus toplanması için bir işlem açıklanmaktadır. Bir kızılötesi (IR) yakalama lazer hem de kullanılan bireysel nöronlar yanı sıra cam slaytlar ve analiz için bir LCM kapağı üzerine ventral tegmental alanı kapalı teşrih. % 100 etanol ve ksilen dokuya tam dehidrasyon kritiktir. İR yakalama lazer kombinasyonu ve ultraviyole (UV) cutting lazer PEN membran slaytları kullanırken bireysel dopamin nöronları veya ventral tegmental alanı izole etmek için kullanılır. Bir PEN membran slayt o, hızlı doku büyük parça topluyor hücreleri yakalama ve toplama daha iyi tutarlılık sunuyor, bir cam slayt üzerinde önemli avantajlara sahiptir slayt doku tamamen çıkarılması dehidratasyon ve sonuçları daha az güvenen. Bir cam slayt doku geniş alanlar çıkarılması mümkün olmasına rağmen, önemli ölçüde daha fazla bir zaman alır ve genellikle arkasında bazı kalıntı doku bırakır. Burada gösterilen veriler, yeterli miktarda ve kalitede RNA kantitatif PCR ölçümleri için de bu prosedürlere göre elde edilebileceğini göstermektedir. RNA ve DNA da geliştirilmiş anatomik ve hücresel çözünürlük yararlanabilir microRNA, protein ve DNA epigenetik değişikliklerin LCM, izolasyon ve ölçümü ile toplanan en sık izole dokudan moleküller ve hücreler olmasına rağmen LCM kullanılarak elde edilmiştir.

Şekil 6 ve 7&#39;de ayrı ayrı mikrografıdır dopamin sinir hücrelerinin izolasyonu için yeteneklerini gösterir. sürekli LCM üretilen en küçük spot büyüklüğü bir hücreyi izole etmek kapakları gibi mevcut anatomik çözünürlük 5-10 mm. spesifik hücre tiplerinin izolasyonu için tek sınırlama, hücrelerin görselleştirmek yeteneğidir. LCM tek dopamin nöronları izole yeteneğine sahip olmakla birlikte, komşu etiketlenmemiş hücre parçaları kirlenmesi, büyük olasılıkla ortaya çıkar. Bu nedenle, son numune dopamin sinir hücrelerinin bir konsantre yığını, dopamin sinir hücrelerinin saf nüfusu. Bu teknoloji ayrıca, ventral tegmental alan izolasyonu ile gösterildiği gibi, örneğin, beyin içinde ayrı çekirdekler ya da bölgeler dokusunun küçük alanlar izole yeteneğine sahiptir. Önceki yayınlar beyin dokusunda bu kullanım göstermiştir yanı sıra normal dokudan 5,11 patolojik doku izole etmek. <pLCM kullanılarak izole hücreler ve dokuların en yaygın kullanımı RNA analiz Çünkü class = &quot;jove_content&quot;&gt;, sunulan prosedürler RNA bütünlüğünü korumak için optimize edilmiştir. LCM aşağıdaki kalan RNA kalitesini belirlemek üzere, RNA, LCM aşağıdaki slaytlar üzerinde dokudan, silika esaslı spin sütunları kullanılarak, izole edilmiş ya da aseton içinde hızlı bir tirosin hidroksilaz floresan immünohistokimya prosedürü veya tespit sonrasında. RNA kalitesi ölçülmüş ve ticari olarak temin edilebilen tüm beyin RNA, RNA için değerler (Şekil 9) ile karşılaştırılmıştır. RNA kalitesi tüm beyin RNA ile karşılaştırıldığında aseton sabitleme (RIN 2.6), ardından imünohistokimya sonra düşük bütünlük LCM için kullanılan doku RNA örneklerinden (RIN mevcut değil), indirgenerek nispi azalma ile görülebileceği gibi, (RIN 8.2) S18 zirveye kıyasla rRNA S28 tepe yüksekliği. Bununla birlikte, RNA, 18S ve 28S bantları muhafaza ve gen ekspresyonu Q-PCR kullanılarak ölçülebilir. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; LCM yoluyla elde edilen nöronlar, dopamin sinir hücrelerinin (50, 100 ve 200 dopamin nöronları) için elde edilen bir RNA miktarını ölçmek için, Silan hazırlık slaytlar kapalı ventral tegmental alan izole edilmiştir. RNA, silika esaslı spin sütunları kullanılarak izole edildi ve RNA miktarı ölçülmüştür. Oluşturulan standart bir eğri bağlı olarak, bir 17.3 toplam 24.8 pg ve 50.9 ug / ul 50, 100 ve 200 dopamin sinir hücrelerinin sırasıyla (Şekil 10A) izole edilmiştir. Q-PCR, ters transkribe edilmiş dopamin sinir hücrelerinin, bütün beyinler, RNA ve RNA bir konsantrasyon aralığı ve daha önce tarif edildiği gibi 5 Q-PCR kullanılarak ölçülmüştür β-aktin geninin RNA miktarını ölçmek. Bu ölçümlere dayanarak, 3.55, 6.82 ve 20.58 ug / ul &#39;lik bir konsantrasyon 50, 100 ve 200 dopamin sinir hücrelerinin sırasıyla (Şekil 10B) için hesaplanmıştır. Dopamin nöronları izolasyonu tüm v izolasyonuna karşılaştırır nasıl göstermek içinentral LCM ile tegmental alan dopamin nöron özel genler içerir (Nurr1, tirosin hidroksilaz ve dopamin taşıyıcı) örneklerin bu iki farklı tipler, Q-PCR ile ölçülmüştür ve β-aktin ekspresyonu (Şekil 11) ile karşılaştırılmıştır. Alt CT değerleri, ilgi konusu genin bir üst konsantrasyonu oluşturulacak için, ΔC t azalma β-aktin göre dopamin nöron genlerinin ekspresyonunda bir artışa işaret eder. Bu, bireysel dopamin nöronlarının izolasyon dopamin nöron spesifik genlerin ifadesini yoğunlaşmaktadır nasıl gösterir. Ventral tegmental alan örneklerinde, dopamin nöron spesifik genler β-aktin ifade ama dopamin nöron genleri ifade etmeyen de tahsil edilecek diğer hücrelere (non-dopaminerjik nöronlar ve glial hücreler) olarak seyreltilir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52336/52336fig1highres.jpg" /> <strong&gt; kızılötesi (IR) yakalama lazer kullanarak Şekil 1. lazer yakalama. küçük plastik LCM kap, bir cam slayt (Adım 1) monte edilmiş doku üstüne yerleştirilir altında bir zar bulunmaktadır. Doku veya hücre belirlendiğinde, bir IR yakalama lazer alttaki doku / hücre (Aşama 2) üzerine zar küçük bir çukur eritmek için LCM kapağı ile harekete geçirilir. LCM kapak kaldırıldığında, doku mikroskop lamı çıkarılır ve LCM kapağa bağlı kalır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52336/52336fig2highres.jpg" /> Kızılötesi (IR) yakalama lazer ve ultraviyole (UV) lazer kesme kullanarak Şekil 2. Lazer yakalama. Dokusunun büyük alanları kazanmak veya UV lazer kullanarak hücrelerin kurtarma kolaylaştırmak amacıyla, doku, bir membran ile bir slayt üzerine monte edilir dış köşesinde (PEN membran slaytlar) boyunca slayt bağlı. LCM kap t üzerine yerleştiriliro doku ve IR yakalama lazer kap membran eritmek ve LCM kap doku eklemek için kullanılır (Adım 1 ve 2). UV kesici lazer daha sonra sürgü membran ve kapak doku slayt çıkarıldı ve LCM kapağın (Aşama 5) üzerinde kalır çıkarıldığında, böylece doku (Aşama 3 ve 4 olabilir) kesilmesi için kullanılır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52336/52336fig3highres.jpg" /> Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Sistemi Yol Haritası 3. Şekil. Bu Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Sistemi bir seferde 3 kaydıraklı için yer vardır. Slaytlar mikroskop içine yüklendiğinde, her slayt için düşük büyütme Yol Haritası görüntüleri oluşturulur. Yol haritası görüntü üzerinde bir alanı seçme o bölgeye Canlı Görüntü penceresini taşır. Gösteri amaçlı, fare mesencephalon 3 kaydıraklı üzerine 10 mikron bölüme bölümlere ayrılmıştır. Birinci sürme tirosin hidroksilaz immunoreactivi için etiketlendity bir Chromagen (A) olarak diaminobenzidinin kullanarak. Bölümler Silan hazırlık slaytlar (B) veya PEN membran slaytlar (C) ya da monte edilmiştir. Bu slaytlar ikisi de hızlı floresan tirozin hidroksilaz immunhistokimya ile etiketlendi. (C) &#39;de oklar cam slayt PEN membran bağlanmasını göstermektedir. Bu sınır dışında hiçbir doku LCM ile toplanabilir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52336/52336fig4highres.jpg" /> Şekil 4. IR yakalama lazer kullanarak. IR yakalama lazer LCM kap doku eklemek ve doku geri kalanından çıkarmak için LCM kap membran eritmek için kullanılır. IR yakalama lazer altta yatan doku ve cam slayt irtibata yeterince LCM kap membran eritmek için yeterli güçte olmalıdır. Lazer membran eritmek için yeterli zaman görüntü üzerinde gösterirslayt (iki noktalar sol). Erimiş membran cam slayt değdiğinde, bir kalın siyah anahat (sağ nokta) görülebilir. lazerin yoğunluğu Güç (3-100 mW), Pulse (100-1,000,000 mikro saniye) ve lazer arasında Tıklama değiştirerek ayarlanabilir. Buna ek olarak, ayrıca membranın eriyik aynı noktada İR lazer atış tekrarladı. IR lazer amacı her zaman LCM kap taşınır ayarlanması ya da nesnel değiştirildiğinde gerekiyor. Ölçek çubuğu = 100 mikron. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52336/52336fig5highres.jpg" /> Şekil 5. lazer kesim UV kullanma. UV kesme lazer PEN membran ve dokuya kesmek için kullanılır. Zarından kesilmiş ve UV lazer dokuya zarar çünkü doku tespit edilmesi gerekmektedir için gerekli minimum yoğunluğu Kullanımdan önce. Yukarıda, farklı UV lazer şiddetlerde üç noktalar (Oklar) ile gösterilir<html> 10 mikron bölümden, kalın bölümler için orta nokta ve çok yüksek UV lazer yoğunluğu gösteren sağ nokta için yeterli sol nokta boyutu. Ölçek çubuğu = 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52336/52336fig6highres.jpg" /> Şekil IR lazer kullanarak tirozin hidroksilaz İmmünoreaktif nöronların 6. Doğrudan izolasyon. Dopamin nöronları tirozin hidroksilaz (A) hızlı floresan etiketleme sonra gösterilmektedir. İR lazer bu nöronların (D) üzerinde LCM kapak zarı erime çalıştığı zaman, kapağın çıkarılması sürgü (B, D), kapalı bu hücreleri seçer. LCM kapağı (C, F) bağlı olarak bu nöronlar sonra görüntülenebilir. Ölçek çubuğu = 250 mikron.= &quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52336/52336fig7highres.jpg" /> Şekil IR ve UV lazerler kullanarak PEN membran slaytlar gelen tirozin hidroksilaz İmmünoreaktif nöronların 7. Doğrudan izolasyon. Tirozin hidroksilaz etiketli nöronlar üzerinde (A) gösterilmektedir. Bu nöronlar IR lazer kullanarak LCM kapağı takılı ve UV lazer (B) kullanarak PEN membran slayt kesilebilir. Ölçek çubuğu = 250 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/52336/52336fig8highres.jpg" /> Dolaylı Şekil 8.<html> tirosin hidroksilaz immüno reaktivitesi ile ventral tegmental alan izolasyonu. ventral tegmental alan dopamin nöronlarının Yer standart immünohistokimya teknikleri kullanılarak (A ve E) ile bir bölümünde görselleştirildi. Bu immünohistokimya etiketli bölümde, boyanmamış bitişik bölümleri (B, F), ventral tegmental alan bulmak için bir şablon olarak kullanıldı. UV lazer kullanarak, ventral tegmental alan kızılötesi lazer ile lcm kapağa bağlanır ve UV lazer (C ve D) ile sürgü kesilmiş ve HS LCM başlığı (D) bağlı olarak gösterilmiştir edildi. Sadece kızılötesi lazer kullanarak Silan-hazırlık slaytlar izole ventral tegmental bölge de bir makro kap (FK) bağlı olarak gösterilmiştir. Birden fazla girişim bu bölgede (G ve J karşılaştır) bir doku en toplamak için gereken dikkat etmek gerekir. Ölçek çubuğu = 500 mikron.pload / 52.336 / 52336fig8large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/52336/52336fig9highres.jpg" /> Şekil 9. RNA kalitesi. Örnek elektroferogramlar ve ticari olarak temin edilebilen tüm beyin RNA (A) ve RNA aseton tespit ve LCM (B) sonra, kesitlerden izole edilebilir veya hızlı fluoresan tirosin hidroksilaz immünohistokimya ve LCM (C) bağlantılı jel ve görüntüler. RNA kalitesi tüm beyin RNA ile karşılaştırıldığında, imünohistokimya için işlemden bölümlerde azaltılmasına rağmen, elektroferogramlar rRNA S18 ve S28 tepe noktası mevcudiyetiyle göre çok sağlam RNA göstermektedir. Tüm beyin RNA yoğunluğu 8.2 RIN ile 6,487 pg / ml idi. Aseton işlem görmüş doku, RNA konsantrasyonu, 2.6 bir RIN ile 5,036 pg / ml idi. RNA, immünohistokimya saat sonra elde edilen<html> Reklam 4,474 ug / ul ve RIN bir konsantrasyonu mevcut değildi. <img alt="Şekil 10," src="/files/ftp_upload/52336/52336fig10highres.jpg" /> Şekil 10. RNA miktarı. LCM elde nöronlarda RNA miktarını belirlemek için, RNA konsantrasyonların standart eğrisi fluorospectrometer ve Q-PCR kullanılarak üretilmiştir. Fluorospectrometer ölçümleri (A) için, büyük grafik RNA miktarlarının yüksek aralığını gösterir ve küçük grafik 10 pg / ul aşağı bu testin duyarlılığını göstermektedir. 50, 100 ve 200 dopamin sinir hücrelerinin elde edilen RNA konsantrasyonları sırasıyla 17.3, 24.8 ve 50.9 ug / ml, idi. RNA miktarlarda (B) ölçülmesi için Q-PCR kullanarak, RNA konsantrasyonları 50, 100 ve 200 dopamin sinir hücrelerinin elde sırasıyla, 3.55, 6.82 ve 20.58 ug / ul&#39;dir. es / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg &quot;/&gt; Bireysel dopamin sinir hücrelerinin izolasyonu ile dopamin nöron özel genlerin Şekil 11. Konsantrasyon. Dopamin sinir hücrelerinin örnekleri dopamin nöron spesifik genin (Nurr1, tirosin hidroksilaz ve dopamin taşıyıcısının) ve β-aktin C arasında t (ΔC t) farkı LCM izole ventral tegmental alan gösterilmiştir, tüm ventral tegmental bölgesinden alınan kesitlerden ifade ile karşılaştırıldığında. Alt CT değerleri, ilgi konusu genin bir üst konsantrasyonu oluşturulacak için, ΔC t azalma olacak β-aktin için diğer hücreler (non-dopaminerjik nöronların, glia hücreleri) göreli dopamin nöron genlerinin ekspresyonunda bir artışa işaret eder β-aktin ifade ama dopamin sinir genleri ifade ettiği ventral tegmental alan örneklerde toplanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area at JoVE.com

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Bireysel dopamin nöronlarının izolasyon ya da doğrudan veya dolaylı olarak immunohistokimyasal ile ventral tegmental alan lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanılarak gösterilmiştir. Kızılötesi lazer kullanarak cam slayt doku izolasyonu ve bir kızılötesi ve morötesi lazer kombinasyonu kullanılarak membran slaytlar arasındaki parametreler tartışılmıştır.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

laser-capture-microdissection-demonstration-isolation-individual

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K Görüntüleme.  Mississippi State University College of Veterinary Medicine.  Bireysel dopamin nöronlarının izolasyon ya da doğrudan veya dolaylı olarak immunohistokimyasal ile ventral tegmental alan lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanılarak gösterilmiştir. Kızılötesi lazer kullanarak cam slayt doku izolasyonu ve bir kızılötesi ve morötesi lazer kombinasyonu kullanılarak membran slaytlar arasındaki parametreler tartışılmıştır. 

Video: Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Nörobilim

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Substantia nigra ve ventral Tegmental Bölgesi Dopamin Yönetmelik Kapsamlı Profilleme

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

Yenidoğan Kemirgenlerin Ventral Kafatası kranyotomi olun Bir Yöntem

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Yetişkin Farelerde Orta beyin dopamin Nöronlar Sayısının Çevre Modülleri

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.