Araştırmamızın amacı Multipl sklerozpatogenezini incelemektir. Bu amaca ulaşmak için ms olan bireylerin beyinlerini elde etmek ve incelemek için hızlı bir otopsi programı kurduk. Otopsi programımızın iki özel yönü var, birincisi hızlı olması. Beynin 6-8 saatlik ölümün altında olduğunu topluyoruz.
Bu son teknoloji moleküler çalışmalara olanak sağlar. İkinci husus, beyni hareket ettirmeden önce yerinde MR'ı yapmamızdır. Bu bize beyin görüntüleme değişiklikleri ile patolojik değişiklikleri ilişkilendirmek için izin verir.
Görsel gösterim, izleyicilerin en iyi sonuçları elde etmek için yer imizi ve zamanımızı nasıl düzenlediğimizi anlamalarını sağlar. Hızlı ve dikkatli bir şekilde gerçekleşen doku işleme, RNA analizi, immünboyama, immünoblotlama ve MRG korelasyonlarına olanak sağlar. Yeni araştırmacılar kötü doku bütünlüğü ile işleme dokuları ile mücadele edebilir.
Uzun post mortem fiksasyon süreleri kaçınmak önemlidir ve MR Doku korde striations MRI analiz uzmanları ile istişare çok yararlı olabilir bu yüzden zor olabilir. Prosedürü gösteren Emilie Christie ve Christina Volsko olacaktır. Laboratuarımızdan teknisyenler.
In situ manyetik rezonans görüntüleme sonra, tartmak ve beyin fotoğraf ve% 4 Paraformaldehit veya PFA bir kap içinde herhangi bir ekli dura yerleştirin. Beyincik ve beyin sapını beyinden ayırın ve serebrumun fotoğrafını çekin. Optik sinirleri, chiasm ve yolları ayırmak ve bir neşter ile yapı rezeksiyon için bir sonda kullanın.
Serebral hemisferleri uzunlamasına ayırın ve her yarımküreyi ayrı ayrı fotoğrafla. Sol yarımküre için birincil motor korteks veya PMC mürekkep, doku rephotograph ve uzun fiksasyon için 3.3 litrelik konteyner doku yerleştirin. Sağ yarımküre için PMC çıkarmak için kaplama menenjler kaldırmak ve doku rephotograph.
Daha sonra neşter kullanarak PMC'yi kes. Daha sonra hemisferin yanındaki rezeke edilmiş PMC'nin fotoğrafını çekin. PMC'yi eşit büyüklükte altı bölüme kesin ve her bölümün rostral yönünü mürekkeple mürekkeple.
Daha sonra pfa dolu kaplar içine kısa fiksasyon için her bölümü yerleştirin. Ve snap mühürlü dondurucu torbalarda depolama kalarak kalan bölümleri dondurmak, soğutucu bir numara. Bir santimetre kalınlığında koronal kesitler içine posterior sağ hemisfer anterior kesin.
PFA'daki diğer tüm bölümleri düzeltin ve geri kalan bölümleri bir numaralı soğutucuda, kapalı dondurucu torbalarında depolamak için sabit bırakın. Beyin sapını beyincikten ayırın ve beyin sapını kısa fiksasyon için PFA dolu bir kapta yerleştirin. Her serebellar hemisferdört eşit sabit sagital kesitler halinde kesin ve medial ve lateral görünümleri fotoğraflayın.
Daha sonra kısa fiksasyon için PFA bir kap içinde sol serebellar hemisferik dilimleri yerleştirin. Ve snap kapalı dondurucu torbalarda depolamak için sağ serebellar hemisferik dilimleri dondurmak, soğutucu bir numara. Sinir kökleri ile omurilik elde ettikten sonra omurilik dura mater kaldırmak ve PFA dura saklamak.
Sol ve sağ anterior ve posterior sinir köklerini ayırın ve PFA kısa fiksasyon için omurilikten sol anterior ve posterior sinir kökleri kesti. Sağ anterior ve posterior sinir köklerini omurilik akorundan kesin ve bu dokuları kapalı dondurucu torbalarında depolamak için iki numaralı soğutucuda çabuk dondurun. Daha sonra omuriliğin kaudal en 20 santimetre fotoğraf ve PFA kısa fiksasyon ve snap donma için kordon un rostral yönde kaudal iki santimetre transfer bölümleri kesti.
Sonra omuriliğin kalan rostral kısmını fotoğraflayın. Ve PFA kısa fiksasyon ve hızlı dondurma için kordonun rostral yönde kaudal iki santimetre transfer bölümleri kesti. Kısa veya uzun sabit dokulardan ilgi kesitleri kesin.
Altı kuyu plaka bireysel kuyular içine bölümleri yerleştirin ve sallayarak, yıkama başına taze PBS iki mililitre üç beş dakikalık yıkar ile dokuları yıkayın. Antijen alımı için, mikrodalga 10 milimoller sitrat tampon kabaca 30 mililitre içeren bir cam kabında iki ila üç dakika boyunca bölümleri mikrodalga. Bölümler oda sıcaklığına kadar soğuduğunda numuneleri üç beş dakikalık yıkama ve iki mililitre PBS için yeni bir altı kuyu plakasına aktarın, ayrıca yıkama başına %0.3 Triton X-100.
Oda sıcaklığında 30 dakika pbs% 3 hidrojen peroksit artı% 0.3 Triton X-100 iki mililitre endojen peroksidaz engelleme izledi. Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi, pbs artı Triton X-100 yıkama başına iki mililitre üç kez bölümleri yıkayın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca %3 normal keçi serumu ve PBS artı Triton X-100'ün iki mililitresinde bloke edildi.
Daha sonra, dört santigrat derece ilgi birincil antikorlar geceden beş güne kadar bölümleri kuluçka ve yıkama başına PBS iki mililitre üç beş dakikalık yıkar. Oda sıcaklığında avidin-biotin kompleks çözeltisi veya ABC kompleksi bir saat boyunca bölümleri kuluçkaya yatırın. PBS üç beş dakikalık yıkıntı ile bu izleyin.
Etiket filtrediaminobenzidin iki mililitre ile iyi başına hidrojen peroksit ile takviye üç ila sekiz dakika. Renk yeterince geliştiğinde, pbs üç kez bölümleri yıkayın ve ayrı ayrı bir PBS dolu konteyner her bölümü aktarın. Her bölümü tek tek doku slaytlarının altına düz bir şekilde yerleştirin.
Ve her slaytı pbs'den yavaşça kaldırarak bölümleri mümkün olduğunca düz tutarak. Yavaşça düzleştirmek ve her doku dışarı germek için iki paintbrushes kullanın. Ve fazla suyu uzaklaştırmak için kağıt havlu kullanın.
Daha sonra uygun bir montaj ortamı ile bölümleri monte ve açık oje ile her kapak kayma mühür. Doku kesitleri beyaz madde lezyonlarının varlığı açısından incelenir ve seçilen bölgeler immün aktivite ve demiyelinasyon için lekelenir. Akut Multipl Sceloris lezyonlarında bu demiyelinated aksonların çoğu transekse aksonların proksimal uçlarını yansıtan aksonal retraksiyon ampulleri olarak hareket eder.
Akut lezyonlarda transekted aksonun yoğunluğu aktif lezyonlarda milimetreküp başına 11000'ü aşarken, komşu non-lezyonal beyaz madde bölgelerinde sadece 15. Yeni üretilen oligodendrositler de birçok kronik MS lezyonlarında mevcuttur. Bu süreçler ile ilişkilendirmek ama miyelinde demiyelinated aksons yok.
Kronik MS hastalarından elde edilen hızla donmuş motor kormetinde nöronal gen değişiklikleri için tarafsız bir arama, 23 nükleer ve kodlu mitokondriyal haberci RNA'nın immünositokimya ve yerinde hibridizasyon kullanarak yaptığı kimlik doğrulama çalışmalarında önemli azalmalar tespit edilmiş ve yerinde hibridizasyon bu genlerin kortikal projeksiyon nöronlarda yüksek oranda zenginleştirilmiş olduğunu ve projeksiyon aksonlarından izole edilmiş mitokondriyalin glikolis lerde azalmış glikoli ler gösterdiğini göstermiştir. Miyelinli ve demiyelinated hipokampi nöronod gen ekspresyonunun karşılaştırılması, nöronal haberci RNA'nın hafıza ve öğrenme de dahil olmak üzere proteinlerde azalmalar ortaya koymaktadır. Ayrıca, kontrol kortikülleri ile karşılaştırıldığında, kortikal nöronal kayıp spinal kord ve serebral kortext demiyelinasyon var MS hastalarının bir alt popülasyonda önemli ölçüde daha fazladır ama serebral beyaz madde.
Doku işleme sırasında, koronal kesitler kesildiğinde kalınlık ve oryantasyon açısından sürekli olarak kesildiğinden emin olun. Ve bir fiksatif ya da dondurulmuş yüzen düz yalan olduğunu. Dondurulmuş doku toplama immünohistokimyasal analize ek olarak genetik ve proteomik analiz yapma fırsatı sağlar.
Bu teknikler MRG'de serebral beyaz madde lezyonu olan ancak önemli bir beyaz madde demiyelinasyonu bulunmayan yeni bir MS hastalarının belirlenmesine yardımcı olmuştur. Miyelokortikal MS olarak adlandırılır.
