Biz Lyon INSA-ENS iGEM ekibi (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy&#39;nın, Clemence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy diğer üyeleri teşekkür , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon ve Valérie Desjardin), mali destek için sponsorlar (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon ve Biosciences INSA-Lyon Bölümü), kritik bu yazının okuma ve zorlanma hediye Dr CC Sze F. Wisniewski-dye. Drogue B. Doktora alır Région Rhône-Alpes bursu.

1. Curli Operon arasında BioBrick Tasarımı ve Sentezi <ol><li> Genetik organizasyon belirleyin ve curli genlerin endojen transkripsiyonel ve translasyonel sinyalleri yerelleştirilmesine. Bu bilgiler örneğin RegulonDB a veya b EcoGene gibi özel veritabanlarında toplanmış ve ilgili yayınların dikkatli bir okuma ile tamamlanmıştır. Veri yönetimi ve siliko preanalysis Clone Manager yazılımı c ile yapıldı. </li><li> Ilgili kodlama dizileri seçin. Curli sentezi (ÇSGB ve csgA kodlama elyaf monomerler) ve ihracat (csgE csgF ve csgG, Curlin salgılanması karmaşık kodlama) için beş kesinlikle gerekli gen grubu sentetik operon oluşturmak için seçilmiştir. FASTA formatında veri tabanından seçilen dizileri ayıklayın. CsgGFE küme E&#39;de olduğu gibi anti-duyum coli genomunun haritalanması, onun ters tamamlayıcısı counterp içine bu dizisi dönüştürmek&gt; Süreç molekül&gt; molekülü Invert Klon Yöneticisi araçları Operasyon kullanarak sanat. Fonksiyonu &quot;Arter&quot; (Klon&gt; Arter) kullanılarak csgBA arkasında csgEFG sekans yapıştırın. </li><li> Uygun bir promotörün ekleyin. Promotör P RCN kontrolü altında seçilen beş curli genler yerleştirerek, curli kobalt ve nikel varlığında aşırı üretilmiş olarak tahmin edilmektedir. RCN lokus Ni ve Co detoksifikasyon (rcnA) ve soydaş metallo-regülatör (rcnR) sorumlu bir akış pompası kodlar. RcnR rcnA ekspresyonu ve Ni ve Co 19, yanıt olarak, kendi gen kontrol eder. RcnR CDS ihtiva RCN dizisi, bütün RCN intergenik bölge ayrıca rcnA ve 41 birinci nükleotid sekansı csgBAEFG hayali (bütün yapının dizi ek veri olarak verilmiştir Şekil 1), bir ön placedin idi. </li><li> Transkripsiyonel Optimizesinyalleri. Mükemmel bir ribozom bağlanma sitesi (ya da mükemmel RBS = AAGGAGGTATATA) csgBA DNA dizisinin ilk ATG önünde ilave edildi. İkinci bir mükemmel RBS csgEFG sıra önünde ilave edildi. ÇSGB ve csgF ve csgG genleri için endojen RBS muhafaza edildi. </li><li> IGEM standartlara uyması için, cihazın Eco RI kısıtlama siteleri, Pst I (prefix) ve SPE I ve xba I (sonek) içeren standart bir BioBrick önek ve sonek ile çevrili olmalıdır. Cihaz d her iki ucunda karşılık gelen diziler yapıştırın. </li><li> Herhangi Eco RI, Pst I, SPE I ve cihazın xba Ben tanıma sitesi eleyin. Daha fazla montaj işlemi kolaylaştırmak için, BioBrick parçası kendisi bu kısıtlama sitelerin herhangi içeremez. Cihazın siliko kısıtlama analizi bir Pst I csgA sırayla yer rcnR sırayla, bir Pst I site açığacsgE gen ve bir Eco RI sitesi. Bu siteler sırasıyla aygıtı sırasını (ek bilgi) pozisyonu 80 (Mut1), 1340 (Mut2) ve 1830 (Mut3) bulunur ve sessiz mutasyonların tarafından aşağıdaki gibi modifiye edilmiştir. Mut1 Pst I site CGTCTG değişti CTGCAG Mut2 Pst I site CAGCAG değişti CTGCAG GAATT değişti Mut3 Eco RI sitesi GAATTC </li><li> Klon Manager yazılımı (Operasyon&gt; Proses molekülleri&gt; Tercüme moleküller) kullanarak çeviri simülasyon yoluyla çalıştırın. Yabani tip curli protein ve sentetik operon tarafından kodlanan proteinler arasında mükemmel bir homoloji doğrulamak üzere dizi hizalama programı BLAST kullanın. </li><li> Sentetik operon ısmarla. Ticari gen sentezi hizmetleri dünya çapında çok sayıda şirket edinilebilir, bizim ortak Genecust (Lüksemburg) idi. Yapay operon (3165 bp) 4 mikrogram birkaç hafta sonra alınan ve pUC57 (pIG2) yerleştirildi. </li></ol>2. Polistiren üzerine yapışkan bakteri görselleştirin ve sayısal <ol><li> M63 az orta (glikoz% 0.2) 2 ml ile 24 kuyu polistiren plakanın her doldurun ve bir gecede kültür 106 hücre ile her bir kuyunun aşılamak. Sallayarak olmadan 18 ila 48 saat boyunca 30 ° C&#39;de bakteriler büyümek. Her sütun (4 kuyu) bir yöntemdir temsil eder. Gerektiğinde uygun kobalt miktarı (25 ila 100 mM) ve antibiyotik (ampisilin 100 μg.L -1) ekleyin. 24-plaka ilk 3 satır 3 tekrarlar ortalayarak yapışık bakteri ölçmek için kullanılan, son satırın sol biyofilm görselleştirmek için kullanılır. </li><li> 24-plaka 3 İlk satır için: Her kuyucuk için, planktonik hücreleri içeren süpernatant kurtarabilirsiniz. </li><li> Dikkatle 1 M63 ml ve havuz 2.2 &#39;de elde edilen ilk süpernatant ile 1 ml yıkama) ile de her durulama. Bu yüzme havuz hücreleri (= S) olarak ifade edilir. </li><li> 1 ml o da biyofilm Kurtarkazıma ve yukarı ve aşağı pipetleme f M63 (= B). Vortex 15 sn. Her modalite karşılık bağlılığı yüzdesini vermek için 600 nm (OD600) de optik yoğunluk gelen yüzey bağlı ve yüzme bakteri sayısını tahmin edin. </li><li> Bağlılık yüzdesi formül kullanılarak hesaplanır: Bx100 / (3XS + B). </li><li> Sadece 24-plaka son satır için: planktonik hücreler atın. </li><li> M63 plakanın altındaki gelişen biyofilm 1 ml ile yıkayın. </li><li> 80 de 1 saat süre ile açık bir plaka kurutun ° C. </li><li> Iyi yüzey bağlı bakteri görselleştirmek için su ile yıkamalar geniş ardından, her içinde 2 dakika süreyle% 20 kristal menekşe renkli 100 ul ekle. Üç bağımsız testler (plakalar) tekrarlanabilirlik sağlamak için yapılmak zorundadır. </li></ol> 3. Mikroskopi tarafından Camına Bağlanan Bakteri görselleştirin <ol><li> Bir floresan şasi alın. E. Hangi constitutivel coli SCC1 e suşuy MG1655 20 plazmid taşıyan sentetik operon curli için uygun bir konak olan üst suşundan gözlenebilir bir fark ile yeşil flüoresan proteini (GFP) ifade eder. </li><li> S23 suşu elde pIG2 plazmid (Eco RI / Pst I pUC57 plazmid yerinde takılı = sentetik curli operon) ile SCC1 Transform. Kontrol suşu S24 21 elde etmek için plazmid bir kontrol (pUC18) ile SCC1 Transform. </li><li> S23 ve kontrol gecede precultures (S24) 30 suşu ° M63 glikoz ile desteklenmiş orta (% 0.2) ve ampisilin (100 μg.L -1) C büyütün. </li><li> Precultures 100 ul ile Petri kapları içinde aynı ortam, 15 ml inoküle. Kobalt (örn. 25 uM) ve uygun konsantrasyonda ilave edin ve kobalt olmaksızın negatif kontrol unutma. Her Petri kabındaki 3 dikdörtgen cam lamel tanıtın. Sallayarak olmadan 30 ° C&#39;de bir gece inkübe edin. </li><li> Fro lamel çıkarınPetri kabı ve dikkatlice boşaltın m. Her bakteriyel artıklarını silerek 70 ° etanol ile emprenye küçük bir pamuk malzeme ile alt yüzünü dikkatle temizleyin. Konfokal gözlem için, lamel daha fiksasyonu sağlamak için birkaç milimetre üzerinde hem üst biter temizleyin. </li><li> Bağlanan bakteri flöresanlı bir mikroskop altında gözlemlenerek, doğrudan fakat hızla, ama dikkatlice örnek kurumasını önlemek edilebilir. </li><li> Konfokal gözlem için, yüzü yukarı yerleştirilen biyofilm kapsadığı üst yüzü ile bir cam slayt üzerine lamel yatırmak. Biyofilm sonra reçine ile cam slayt sabitlenir daha büyük bir lamel ile kaplanır. Biyofilm şimdi alt yüzünde olacak şekilde kurulum Invert. </li><li> Konfokal lazer mikroskop altında kurulum yerleştirin. Bir sağ Axioplan2 LSM510 (Zeiss) konfokal lazer mikroskop Platim platformu f kullanıldı. </li><li> Ayarlama. Excite 488 nm&#39;de GFP ve aralığında bakteriyel floresans 500 ile 600 nm toplamak<html> . Konfokal tarama modu lazer görüntüleri almak için 40x yağ immersiyon objektif kullanın. 1 mikron bir adımı kullanarak katı yüzeyinden büyüme ortamı ile arayüz biyofilmlerin genel olarak üç boyutlu yapılar, tarama. </li><li> IMARIS yazılımı (Bitplane, Zürich, İsviçre) ile üç boyutlu projeksiyonlar gerçekleştirin. İstatistiksel boyuna kesitler boyunca ortalama z değeri analizi ile biyofilm kalınlığı belirleyin. 22, başka bir yerde tanımlandığı gibi biyofilm biovolumes kantitasyonu konfokal z-yığınlarının elde edilebilir. </li></ol> Bir RegulonDB transkripsiyon birimleri, proje ve sigma, genler ve ribozom bağlanma yerleri, sonlandırıcılar, spesifik transkripsiyonel bağlayıcı sitelerin yanı sıra, düzenleyici ifadeler içine kendi organizasyonu içine operon organizasyonu ve ayrışma ile ilgili mekanistik bilgi sağlar.et = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp b EcoGene veritabanı E. hakkında güncel bilgiler içermektedir coli K-12 genom ve kapsamlı gen bibliyografya dahil proteom dizileri. Büyük bir EcoGene odağı çeviri başlangıç ​​sitelerin yeniden değerlendirme olmuştur. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> c <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> d <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> Chun Chau Sze, Nan Yang Teknik Üniversitesi, Singapur e Hediye. f Platim mikroskopik platformu UMS3444 BioSciences&#39;ı Gerland - Lyon Sud.

<ol>
	<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+sensor+cell+arrays.">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li><li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array.">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li><li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes.">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li><li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli.">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li><li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains:+role+of+flagella,+curli+and+colanic+acid.">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li><li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation.">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li><li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces:+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression.">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li><li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg(II).">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li><li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Zn(II),+Cu(II),+and+Fe(II)+ions+to+Alzheimer's+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence.">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li><li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis.">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li><li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli.">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li><li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli.">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li><li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation.">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li><li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpxR/OmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli.">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li><li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis.">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li><li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive.">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li><li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12.">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li><li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site:+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt.">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li><li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context.">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli.">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li><li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere:+new+perspectives+for+studying+microbial+communities.">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li><li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Adhesives. , (2006).</li><li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method.">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device.">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li><li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria.">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li><li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in molecular genetics. , (1972).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Kritik adımlar Bu sentetik biyoloji yaklaşımda en önemli adım gen tasarımıdır. Sentetik gen tasarım etkili bir sistem üretimi sağlamak için titiz olmak zorundadır. Nükleer atık ve biyo-dekontaminasyon: kendi salgı sisteminin içinde yer proteinleri kodlayan elyaf monomerler ve üç gen kodlayan iki gen bir roman uygulama için yeni bir işlevsel birim oluşturmak için güçlü ve metal-uyarılabilir kolaylaştırıcı ile monte edilmiştir. Planlı ve tahmin edildiği gibi, bu ...

Abiyotik destek Bakteriyel yapışma biyoremediasyonunun, biyokataliz veya mikrobiyal yakıt hücreleri önemli bir rol oynar. Biyoremediasyon süreçleri organik maddelerin düşmeye veya metal dağılımı (immobilizasyon, buharlaşma) veya türleşme değiştirmek için mikroorganizmaların kapasiteleri kullanmak. Bu yararlı faaliyetler endüstriyel ve evsel atıkların kirli su tedavisi için geliştirilen yapay sistemleri de karasal ve sucul ekosistemlerde görülen, fakat. Mikrobiyal aktivite yoğunluğu ve kalitesi değil, aynı zamanda mikroorganizmaların yaşam tarzı (serbest yüzen veya biyofilm içine gömülü) üzerine, fiziko-kimyasal etkenlere bağlıdır. Biyofilm oluşumunu farklı mekanizmalar ile biyosit direnç teşvik bir metabolizma ile ilişkilidir. Bu olgu dolayısıyla en biyoremediasyonun süreçlerinde teşvik edilecektir. Ayrıca, biyofilm oluşumunu kontrol etmek için mühendislik Escherichia coli hücreleri başarıyla uygulanmışbioçipler 2-3 tam hücreli sensörleri hareketsiz. Metallerin yüksek konsantrasyonu mikroorganizmaların adaptasyonu hücre içine metal konsantre çeşitli hücre dışı matris bileşenleri için bu gibi adsorpsiyon gibi mekanizmalar, akış pompasının aktivasyonu ya da spesifik taşıyıcılar aracılığıyla gerçekleşir. Genetik mühendisliği yoluyla bu bakteri etkinlikler Artıran özellikle Raghu ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi zayıf miktarda yüksek derecede toksik metaller halinde de, laboratuar ölçeğinde metal kirliliğinin etkili ve ucuz bir tedavi sağlar. 2008 4. Bakteriyel iyileştirme bu durumda, iyon değişim reçineleri kullanan klasik kimyasal işlemler ile karşılaştırıldığında, bir rekabetçi ve maliyet tasarrufu yöntemi temsil eder. Yazarlar E. tarif coli şasi genetik bir çok kopyasını dönüşümden sonra bir plazmid sağlayan aşırı akış pompası kodlama gen rcnA eledi ve tarafından kobalt alımını ve ilk saklama için tasarlanmıştırkobalt için tercihli alımını taşıyıcı. Böyle bir gerilme radyoaktif atık tedavi etmek için iyon değiştirme reçineleri için etkili bir alternatif olarak görünmektedir, ama önemli bir mesele çözümlenmemiş işlemi 4 sonunda kirlenmiş bakteri geri kazanılmasıdır. Çalışmalarımızın amacı, cam veya plastik gibi abiyotik destekleri ayrılmamak için özel tasarlanmış bir zorlanma mümkün mühendisi nedenle oldu. Adhezinleri ve Gram-bakteri tespit yapışık fimbrialar bütünü Arasında, biz curli üretim sağlayan bir sistem tasarlamak için seçtim. Curli E. çıkıntı ince (2-5 nm çapında) ve yüksek agregatif amiloid lifler bir kristalin-olmayan ve çözünmeyen matris olarak 5-7 coli ve Salmonella yüzey. Curli aynı zamanda cansız yüzeyler ve biyofilmlerin 8 gelişme kolonizasyonu yer alırlar. Son zamanlarda Curli cıva iyonlarını 9 bağlamak için gösterilmiştir. Amiloidleri yüksek gerçekten sahip olduğu bilinenörneğin Cu 2 gibi metallerin iyonları için afinite +, Zn 2 + ve Fe 3 + 10. Bu özellik daha da metal kirli atık su arındırma artırabilir. CSG küme curli elyaf üretimi için sorumludur ve iki divergently transkripsiyonu operonlar (Şekil 1) teşkil edilir. ÇSGB, csgA ve csgC genlerin iki curli alt birimleri, CsgA ve ÇSGB kodlama, duygusu operon oluşturmaktadır. CsgC curli biyogenezi sistemi içinde redoks aktivite yer olması ve gözenek davranışı 11 CsgG etkileyecek gibi görünüyor. Bununla birlikte, curli üreten bakterilere çoğunda csgC yokluğunda da protein curli biyogenez üzerindeki kontrolü sadece bir sekunder seviyesi sağlar gösterir. Sistemi basitleştirmek için, biz gen az sayıda çalışmayı tercih edilmiştir. CsgDEFG düzenleme ve ulaşım gerekli proteinlerin operonencodesCsgA ve ÇSGB hücre yüzeyi için. CsgD csgBAC operonunun bir transkripsiyon aktivatörü ve curli fimbriya ve bu tür selüloz 12 gibi diğer biyofilm parçaların üretimi kontrol ederek ve inhibe kamçı üretimi 13 ile biyofilmin oluşumunun kontrol edilmesinde önemli bir rol oynar. CsgE, CsgF ve CsgG büyük curli protein alt birim CsgA çözünür bir protein olarak salgılanır, üzerinden dış-membran içine bir curli-özgü salgı cihaz oluşturmaktadır. CsgA polimerizasyonu ile oluşan zar-bağlı protein nucleator ÇSGB (14 gözden) üzerine, in vivo olarak bağlıdır. Çeşitli iki-bileşenli sistemler içeren karmaşık bir düzenleyici yollar curli 15-16 gen ekspresyonunu kontrol etmek için gösterilmiştir. Bu karmaşık düzenlemeler bakteriler çevresel uyaranlara yanıt olarak curli üretimi yoluyla kalın biyofilmlerin formu sağlamak, fakat endüstriyel uygulamalar için kontrol etmek zordur. Met kurtarma kolaylaştırmak içinbir endüstriyel işlem sırasında bakteriler al-doldurulmuş, bir katı destek bakteri tespit aslında iyi tanımlanmış bir parametreye (ler) i tarafından kontrol edilmesi gerekmektedir. Curli ve yapışık özelliklerini kendi amiloid doğaya 17 ile bağlantılıdır ve biyoremediasyonun süreçlerini iyileştirmek için kullanılan olabilir, ama basit ve kolayca kontrol cihazı oluşturulmak zorundadır. Bu 7 genlerin 18 arasında, 5 bir dizi kesinlikle curli sentezi (ÇSGB ve csgA kodlama elyaf monomerler) ve ihracat (csgE csgF ve csgG, curli salgılanması karmaşık kodlama) için genler gerekli sentetik operon oluşturmak için seçilmiştir. Curli &quot;doğal&quot; düzenlemesi, tasarlanmış ve sentezlenmiştir güçlü ve kobalt-overinducible organizatörü (Şekil 2) kontrol altında bu 5 CSG ​​genleri içeren sentetik operon kaçmak için. Curli kodlama bölgenin adım adım analiz ve fonksiyonel bir syn için tasarım prosedürüsempatik operon tarif edilmektedir. Polistiren ve cam bakteriyel yapışmayı görselleştirmek ve ölçmek için iki yöntem açıklanmaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> sentetik P RCN ihtiva eden bir 3165 bp EcoRI / PstI fragmanı pUC57 ile (pMB1 ori, 2710 bp) - csgBAEFG operon; Amp r </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Amp r, (pMB1 ori, 2686 bp) ÇOKLU plazmid </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP etiketli MG1655, CC Sze hediye) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> 2 CoCl </td><td> Sigma </td><td></td><td> 0.1 M stok çözelti oda sıcaklığında </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> 24-kuyulu plakalı </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> Polistiren 24-kuyucuğu </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

Burada açıklanan yöntem, E. yeniden dizayn oluşmaktadır Güçlü ve metalden-overinducible promotörün kontrolü altında curli genlerin en az sayıda montaj göre, bakteriyel yapışmayı ve bunun sonucunda elde görüntülenmesi ve miktarlarının coli içinde yapışma özellikleri. Bu yöntem uygun mühendislik soyutlama ilkeleri ve sentetik biyoloji standardizasyonu ve BBa_K540000 BioBrick sonuçları (En yeni BioBrick cihazı, mühendislik, iGEM 2011) geçerlidir. İlk adım, yabani tip soyla arasında yapışma yeteneklerinin arttırılması bu nedenle metal yanıt olarak curli aşırı ayrılmış sentetik operonunun tasarımı içerir, ve. Orijinal curli operon transkripsiyonel ve translasyonel sinyalleri optimize etmek ve curli &quot;doğal&quot; düzenleme kaçmak için siliko güncellenmiştir. Bu yaklaşım, başarı ile curli üretim bizim mevcut anlayış test etmek izin verdi. Moreover, basit bir metal-düzenlenmiş arttırıcının için endojen karmaşık organizatörü (10&#39;dan fazla transkripsiyonel tanımlanır) geçerek curli yönetmelik basitleştirilmesi kontrol etmek çok daha kolay uyum sağlar. İkinci adım basit yöntemlerin uygulanması ile uyum yeteneklerini kalitatif ve kantitatif değerlendirmesini içerir. Bu yöntemler, biyofilm oluşumunda rol oynayan biyolojik yapıların ne olursa olsun bakteri yapışık bir geniş aralık için de geçerlidir. 24-iyi polistiren plakalar Aderans testi kristal viyole boyandıktan sonra bakteriyel biyofilm hızlı bir ön görselleştirme sağlar. Bu niteliksel test yapışma yüzdesi ölçümü ile bilenmiş olabilir. Böyle bir yöntem çok basit ama iyi bir tekrarlanabilirlik ve yeniden hem de daha önce 1 açıklandığı gibi sadece kristal violet boyama daha doğru. Floresans ve lazer conf tarafından cam slaytlar GFP etiketli bakteri GörselleştirmeÖcal mikroskopi fenomen doğrudan gözlem ile 24 oyuklu plaka deney ile elde edilen sonuçlar güçlendirmek için izin verir.

E. vahşi tip CSG sırası siliko açıklama olarak transkripsiyonel ve translasyonel sinyallerin optimizasyonu ile ilişkili coli K12 tek sentetik curli operon P RCN-CSG Şekil 3 (tamamlayıcı veriler tam sırası) gösterilir tasarlamak için izin verdi. Protokol 2 ve 3 protokol curli üretimi ile ilişkili yapışma görselleştirmek ve ölçmek için kullanılmıştır. 24-iyi polistiren plakalar üzerinde kristal viyole boyama (protocole 2) her...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon at JoVE.com

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Bir sentetik operon kodlama hem salgı cihaz ve curli liflerin yapısal monomerlerin tasarımı açıklanmaktadır. Bu amiloidleri ve yapışık polimerlerin aşırı bir bağlılık ölçülebilir bir kazanç sağlar<em&gt; E. coli</em&gt; Şaşi<sup&gt; 1</sup&gt;. Aderans görselleştirmek ve ölçmek kolay yolları açıklanmıştır.

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

engineering-adherent-bacteria-creating-single-synthetic-curli

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K Görüntüleme.  Université de Lyon. Bir sentetik operon kodlama hem salgı cihaz ve curli liflerin yapısal monomerlerin tasarımı açıklanmaktadır. Bu amiloidleri ve yapışık polimerlerin aşırı bir bağlılık ölçülebilir bir kazanç sağlar E. coli Şaşi 1. Aderans görselleştirmek ve ölçmek kolay yolları açıklanmıştır.

Video: Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Akciğer Mühendisliği Prosedürü

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Biyomühendislik

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

Sentetik, Multi-Layer, Self-Salınımlı Vokal Fold Model Fabrikasyon

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optik Algılama<em&gt; E. coli</emMezopor Silikon Biyosensörlerin tarafından&gt; Bakteri

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Bir ıntrinsic Vaskülarizasyon tarafından Doku Mühendisliği<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku Mühendisliği Odası

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Tek Karbon Nanotüp Bio-mimetik Polimerler ile Mühendislik Moleküler Tanıma

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...