我々はリヨン仁のENS IGEMチーム（ヴィヴィアンChansavang、マチルドデュモン、アレクサンドルデュプレイ、メラニージェフロア、クレメンスGonthier、マルゴージョラン、Aurélieハーグ、ゴキのLy、トーマスポアンソ、ベリルロイヤー·ベルトラン、ジュリーSoulaの、マイケルVonzyの他のメンバーに感謝、ピエール·イヴ·ズンデル、Soufiane Bouhmadi、オリビエBrette、ガエルChambonnier、ラウライザド、Aurianne Kroiss、フィリップジューヌ、アニエスRodrigue、アルノーロンドレ、シルヴィーReverchonとヴァレリーDesjardin）、彼らの財政支援（ビオメリュー、Assystem、EDFは、財団のために我々のスポンサークリティカルこの原稿の読み取りとひずみのギフトのための博士のCCセー用INSA、ENS-Lyonとバイオサイエンス仁リヨン学科）、F. Wisniewskiは染料。ドローグBには博士号を受け取る地方ローヌ=アルプからフェローシップ。

1。 CurliオペロンのBiobrickのデザインと合成<ol><li>遺伝子構成を決定し、curli遺伝子の内因性の転写および翻訳シグナルをローカライズします。これらの情報は、RegulonDB aまたはbとEcoGene専門データベースに収集され、適切な出版物を注意深く読むことによって完了します。データ管理とインシリコ preanalysis ではクローンマネージャーソフトウェアCで行われた。 </li><li>適切なコーディング配列を選択します。 curli合成（csgBとcsgAエンコード繊維モノマー）とエクスポート（csgE csgFとcsgG、curlin分泌複合体をコードする）のための5つの絶対に必要な遺伝子のセットが合成オペロンを構築するために選択した。 FASTAフォーマットでデータ·ベースから選ばれた配列を抽出。 csgGFEクラスタは、 大腸菌におけるアンチセンスであるとして大腸菌のゲノムは、その逆相補のcounterpにこのシーケンスを変換するクローンManagerツール操作を使用してアート&gt;プロセスの分子&gt;分子を反転します。関数&quot;ライゲート&quot;（クローン&gt;結紮）を使用してcsgBA背後csgEFGシーケンスを貼り付けます。 </li><li>適当なプロモーターを追加します。プロモーターP RCN、curliの制御下にある5つの選択curli遺伝子を配置することにより、コバルトとニッケルの存在下で過剰生産されると予測されています。 RCN軌跡は、NiおよびCo解毒（rcnA）及びその同族メタロレギュレータ（rcnR）を担当する排出ポンプをコードしている。 RcnRは、NiおよびCo 19に対応してrcnA、独自の遺伝子の発現を制御します。 rcnR CDS を含むRCNシーケンスは 、全体RCN遺伝子間領域プラスrcnAの41第一ヌクレオチドはcsgBAEFGキメラシーケンスのplacedinフロント（ 図1、構造全体の配列は、補足データとして提供される）であった。 </li><li>転写を最適化信号。完璧なリボソーム結合部位（または完璧RBS = AAGGAGGTATATA）がcsgBA DNA配列の最初のATGの前に追加されました。第二完璧RBSはcsgEFG配列の前に追加されました。 csgBとcsgFとcsgG遺伝子に対する内因RBSは保存されていた。 </li><li> IGEM基準に適合するように、デバイスを EcoRIの制限部位、PstIで （接頭辞） および Spe I および Xba I（接尾辞）を含む、標準BioBrick接頭辞と接尾辞により隣接されなければならない。装置Dのそれぞれの端に対応する配列を貼り付けます。 </li><li>任意のEcoRI、PstIで、SPE Iおよびデバイス内のXBA I認識部位を排除する。さらに組立工程を容易にするために、BioBrickパーツ自体はこれらの制限部位のいずれかを含めることはできません。デバイスのin silico制限分析でcsgA配列において、1 PstIでサイト、rcnR配列において、1 PstI部位を明らかにしたcsgE遺伝子と1 EcoRI部位。これらのサイトは、それぞれの位置80（MUT1）、1340（Mut2）とデバイス·シーケンスの1830（Mut3）（補足データ）に置かれ、サイレント突然変異によって次のように変更されました。 CGTCTGで変更CTGCAG MUT1 PstI部位 CAGCAGで変更Mut2 PstI部位CTGCAG GAATTで変更Mut3 EcoRI部位のGAATTC </li><li>クローンManagerソフトウェア（動作&gt;プロセスの分子&gt;翻訳分子）を使用して翻訳シミュレーションを通して実行されます。野生型curliタンパク質や合成オペロンにコードされるタンパク質の間の完全な相同性を確認するために配列アラインメントプログラムBLASTを使用しています。 </li><li>合成オペロンを命ずることができる。商用遺伝子合成サービスは世界中で数多くのメーカーから提供されています、私たちのパートナーはGenecust（ルクセンブルク）であった。人工オペロン（3165 bp）の4μgの数週間後に受信したpUC57（pIG2）に挿入した。 </li></ol>2。ポリスチレンに付着細菌を可視化し、定量化<ol><li> M63最少培地（グルコース0.2％）2mlを24ウェルポリスチレンプレートの各ウェルを記入し、一晩培養した培養液の106細胞を用いて各ウェルに接種。振とうせずに18から48時間30℃でバクテリアを育てています。各列（4ウェル）はモダリティを表す。必要なときに適切なコバルトの量（25〜100 mM）および抗生物質（アンピシリン100μg.L-1）を追加します 。 24ウェルプレートの3最初の行は3回の繰り返しを平均化することにより、付着細菌を定量化するために使用され、残された最後の行は、バイオフィルムを可視化するために使用されています。 </li><li> 24ウェルプレートの3最初の行の場合 ：各ウェルについて、浮遊細胞を含む上清を回収する。 </li><li>慎重に1 M63 mlのプール2.2で得られた初期上清で1mlの洗浄）で各ウェルを洗浄してください。このプールは、水泳細胞（= S）と呼ばれています。 </li><li> 1ミリリットルoのバイオフィルムを回復こすると上下にピペッティングによるF M63（A = B）。ボルテックス15秒。各モダリティに対応順守率を与えるために600nm以下（OD 600）での光学密度から表面接続およ​​び水泳の細菌の数を見積もります。 </li><li>アドヒアランスの割合は、以下の式を用いて算出しています：BX100 /（3xS A + B）。 </li><li> 唯一 、24ウェルプレートの最後の行の ：浮遊細胞を破棄します。 </li><li> M63プレートの底に開発したバイオフィルムの1ミリリットルで洗浄すること。 </li><li> 80℃で1時間のオープンプレートを乾燥℃に</li><li>よく表面付着細菌を可視化するために、水との広範な洗浄に続いて、それぞれの中で2分間20％クリスタルバイオレットの100μlを添加する。 三つの独立したアッセイ（プレート）は、再現性を確保するために実行する必要があります。 </li></ol> 3。顕微鏡によるガラス上の付着細菌を可視化<ol><li>蛍光シャーシを入手してください。 E. constitutivel 大腸菌 SCC1 電子株yは親株MG1655 20から観察可能な違いは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドベアリング合成curliオペロンに適したホストです。 </li><li> S23の株を取得したプラスミドpIG2（=合成curliオペロンはプラスミドpUC57 の EcoRI / PST I部位に挿入）でSCC1を変換します。対照菌株のS24 21を取得するコントロールプラスミド（pUC18に）でSCC1を変換します。 </li><li> S23のと制御の一晩前培養（S24）、30日時点での株°M63グルコースを添加した培地（0.2％）とアンピシリン（100μg.L-1）のCを栽培しています。 </li><li>前培養液100μlを持つペトリ皿内の同じ培地15mlに植菌する。コバルト（ すなわち 25μM）の適切な濃度を追加し、コバルトなしのネガティブコントロールを忘れてはいけません。各ペトリ皿の3角型のガラスカバースリップをご紹介します。振盪せずに30℃で一晩インキュベートする。 </li><li>あちこちにカバースリップを削除シャーレと慎重にドレインメートル。すべての細菌の残留物を拭き取ることにより70℃のエタノールを含浸させた小さな綿のもので、下面を丁寧に清掃してください。共焦点顕微鏡観察のために、カバースリップのさらなる定着を可能にするために数ミリ上で両方の上端部を清掃してください。 </li><li>付着細菌を蛍光顕微鏡下で直接可視化したが、すぐに、しかし慎重にサンプルの乾燥を避けることができます。 </li><li>共焦点顕微鏡観察のために、表向きに配置バイオフィルムで覆われて上面にスライドガラス上にカバースリップを預ける。バイオフィルムは、その後、ワニスをガラススライドに固定されている大規模なカバーガラスで覆われている。バイオフィルムは今下面にすることができるようになるという設定を反転します。 </li><li>共焦点レーザー顕微鏡下でセットアップを置きます。右Axioplan2 LSM510（Zeiss）を共焦点レーザー顕微鏡はPlatimプラットフォームf で使用されていました。 </li><li>設定。エキサイト488nmでGFPおよび範囲内細菌の蛍光を収集する500から600 nmの<html> 。共焦点レーザー走査型モードで画像を取得するために40倍油浸対物レンズを使用しています。 1μm以下のステップを使用して、増殖培地で固体表面からインターフェイスにバイオフィルムの全体的な三次元構造をスキャンします。 </li><li> IMARISソフトウェア（ビットプレン、チューリッヒ、スイス）と3次元投影を行う。統計的縦断面に沿って平均z値の分析によりバイオフィルムの厚さを決定します。別の場所で説明されているように22バイオフィルムbiovolumesの定量化は、共焦点のzスタックから抽出することができる。 </li></ol> RegulonDBは、転写ユニット、プロモーターとそのシグマ型、遺伝子およびそれらのリボソーム結合部位、ターミネーター、特定の転写調節因子の結合部位、ならびに規制フレーズを自分たちの組織にオペロンの組織とその分解についてのメカニズムに関する情報を提供しています。ら= &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp B EcoGeneデータベースは、 大腸菌についての最新情報が含まれて大腸菌 K-12ゲノムおよび広範な遺伝子を含む書誌プロテオーム配列。主要EcoGeneフォーカスが翻訳開始部位の再評価されています。 <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> C <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> dの <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> チュンチャウセー、ナンヤン工科大学、シンガポールの電子ギフト 。 F Platim顕微鏡プラットフォームUMS3444バイオサイエンスジェルラン-リヨンシュッ。

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特別な利害関係は宣言されません。

重要なステップこの合成生物学のアプローチの中で最も重要なステップは、遺伝子の設計です。合成遺伝子の設計は、効率的なシステムの生産を確保するために細心でなければならない。核廃液のバイオ除菌：その分泌系に関与するタンパク質をコードファイバモノマー及び3つの遺伝子をコードする2つの遺伝子は、新規アプリケーションのための新しい機能的なユニット?...

非生物的サポートに細菌付着はバイオレメディエーション、生体触媒または微生物燃料電池に大きな役割を果たしている。バイオレメディエーションプロセスは、有機物を分解する微生物の能力を使用したり、金属分布（固定、揮発）、または分化を修正することができます。これらの有益な活動は、水生·陸生生態系ではなく、産業や家庭排水の汚染水を処理するために開発された人工システムで観察されています。微生物の活動の強度や品質はもちろんのこと、微生物のライフスタイル（フリーフローティングまたはバイオフィルム中に埋め込まれている）で、物理化学的要因に依存する。バイオフィルム形成は、多様なメカニズムによって殺生物剤に抵抗性を促進する代謝に関連付けられています。この現象は、したがって、ほとんどのバイオレメディエーションプロセスに奨励される。また、バイオフィルム形成を制御するためのエンジニアリング大腸菌細胞が正常に適用されているバイオチップ2-3全細胞センサーを固定。 金属の高濃度の微生物の適応は、そのような細胞外マトリックス成分への吸着、細胞内に金属を集中することができる排出ポンプまたは特定のキャリアの活性化などの多様なメカニズムを介して行われます。ラグーらによって説明されているように遺伝子工学を介してこれらの細菌の活動を後押しすることは、特に弱い量で毒性の高い金属の場合には、実験室規模での金属汚染を効率的かつ安価な治療を可能にします2008年4。細菌の修復は、このケースでは、イオン交換樹脂を用いた古典的な化学プロセスに比べて競争力のあるコスト削減方法を表しています。著者らは、Eを説明大腸菌シャーシは遺伝のマルチコピープラスミド許可過剰生産と排出ポンプをコードする遺伝子rcnAをノックアウトすることで、次に変換によってコバルト取り込みおよび保持第一のために設計コバルトの選択的取り込みとトランスポーターはこのような歪みは、放射性廃液を治療するために、イオン交換樹脂への効率的な代替として表示されますが、重要な未解決の問題は、プロセス4の終わりに汚染された菌の回復です。私たちの仕事の目的は、ガラスやプラスチックなどの非生物的支持に固執することができるカスタム設計された菌株を設計することであった。 アドヘシンおよびグラム細菌で同定付着線毛の全体のセットの中で、我々はcurli生産を可能にするシステムを設計することを選んだ。 Curliは大腸菌から突出薄い（2-5 nmの直径）と高凝集アミロイド繊維である非結晶性と不溶性マトリックス5月7日として大腸菌やサルモネラ表面。 Curliも無生物表面とバイオフィルム8の開発の植民地化に関与している。 Curliは最近水銀イオン9を結合することが示された。アミロイドは確かに高い有することが知られている例えば、Cu 2 +、Zn 2 +及びFe 3 +の10のような金属イオンに対する親和性。このプロパティには、さらに金属汚染排水の除染が向上する場合があります。 CSGクラスタはcurli繊維の製造を担当し、2発散転写オペロン（ 図1）で構成されている。 csgB、csgAとcsgC遺伝子は 2 curliサブユニット、CsgAとCsgBをコード化して、センスオペロンを構成している。 CsgCはcurli生合成システム内レドックス活性に関与しているように見えるとCsgG孔11動作に影響を与える。しかし、curli生産菌の大部分におけるcsgCの不在は、対応するタンパク質がcurli生合成を制御するための唯一のsecundaryレベルを提供することを示しています。システムを簡素化するために、私たちは、遺伝子の最小数で動作するように選択されています。 csgDEFGは規制と輸送に不可欠なタンパク質をoperonencodesCsgAとCsgBの細胞表面へ。 CsgDはcsgBACオペロンの転写活性化因子であるとcurli線毛、セルロース12など他のバイオ成分の産生を制御することによって阻害すると鞭毛生産13によるバイオフィルム形成の制御において重要な役割を果たしています。 CsgE、CsgFとCsgGは主要curliサブユニット蛋白質CsgAが可溶性タンパク質として分泌され、それを通して外膜におけるcurli固有分泌装置を構成する。 CsgAの重合が膜結合核タンパク質CsgB（14件中）のin vivoで依存しています。いくつかの2成分系を含む複雑な調節経路がcurli遺伝子発現15から16を制御することが示されている。これらの複雑な規制は、細菌が環境手がかりに応答curliの産生を介して厚いバイオフィルムを形成することができますが、産業用アプリケーション向けに、制御するのは困難です。 Metの回復を容易にするために工業プロセス中のアル·ぬいぐるみ細菌、固体支持体への細菌の固定は確かに明確に定義されたパラメータ（s）によって制御される必要がある。 curliの付着特性は、それらのアミロイド性質17にリンクされており、バイオレメディエーションプロセスを改善するために使用することができますが、単純かつ容易に制御されたデバイスを作成する必要があります。 これらの7つの遺伝子18の中でも、curli合成（csgBとcsgAは繊維モノマーをコードする）と輸出（csgE csgFとcsgG、curli分泌複合体をコードする）のための5絶対に必要な遺伝子のセットが合成オペロンを構築するために選択した。 curliの&quot;自然な&quot;規制を逃れるために、強力かつコバルトoverinducibleプロモーターの制御（ 図2）の下で、これらの5 CSG ​​遺伝子を含む合成オペロンを設計し、合成した。 curliコード領域のステップ·バイ·ステップの分析と機能合成するための設計手順断定的なオペロンが記載されている。ポリスチレンやガラスへの細菌付着を可視化し、定量化するための二つの方法が説明されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td>合成P RCNを含む3165 bpのEcoRI / PstIフラグメントを持つpUC57（pMB1 ORI、2710 bp）の- csgBAEFGオペロン;アンプR </td></tr><tr><td> pUC18を</td><td></td><td></td><td>アンプR、（pMB1 ORI、2686 bp）を多コピープラスミド</td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1（= GFPタグMG1655は、CCセーの贈り物）/ pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td>のCoCl 2 </td><td>シグマ</td><td></td><td> 0,1 Mのストック溶液は、室温で維持</td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </TD&gt; </tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>ヌンク</td><td> 55429 </td><td>ポリスチレン24ウェルプレート</td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

ここで説明する方法は、 大腸菌を再設計することで構成されています強いと金属overinducibleプロモーターの制御下にcurli遺伝子の最小数を組み立てることにより、細菌の付着の結果として生じるゲインを可視化し、定量化における大腸菌の付着特性。この方法では、適切な工学的合成生物学の抽象化と標準化の原則、BBa_K540000 Biobrick（ベスト新Biobrick機器、エンジニアリング、IGEM 2011）の結果を適用します。 最初のステップは、金属に反応して、したがって、野生型株の付着力を高めることにcurli過剰生産に専念して合成オペロンのデザインで構成されています。オリジナルcurliオペロン転写および翻訳シグナルを最適化し、curliの&quot;自然な&quot;規制を逃れるためにin silicoで変更されました。このアプローチでは、成功を収めてcurli生産の私達の現在の理解度をテストすることができました。 Moreoverは、単純な金属調節プロモーターに内因性の複雑なプロモーター（10以上の転写調節因子が同定される）スイッチングによりcurli規制を簡素化すると制御への付着が非常に容易になります。 第二段階は、単純なメソッドの実装によって付着力の定性的および定量的評価が含まれています。これらの方法にかかわらず、バイオフィルム形成に関与する生物学的構造の付着細菌の広い範囲に適用されます。 24ウェルポリスチレンプレートで付着試験は、クリスタルバイオレット染色後の細菌バイオフィルムの迅速な予備可視化を提供します。この定性検査は、アドヒアランスの割合の定量化によって先鋭化することができます。このような方法は非常にシンプルでありながら優れた再現性と再現性の両方で以前に1に記載のように唯一のクリスタルバイオレット染色よりも正確です。蛍光またはレーザーのconfによりスライドガラス上のGFPタグ細菌の可視化OCAL顕微鏡は、現象を直接観察することにより、24ウェルプレート試験で得られた結果を強化することができます。

EのシーケンスをCSG野生型の in silico In アノテーション転写および翻訳シグナルの最適化に関連する大腸菌 K12は、 図3（補足データでフルシーケンス）に示すように、単一の合成curliオペロンP RCN-CSGを設計することができました。プロトコル2とプロトコル3 curli生産に伴うアドヒアランスを可視化し、定量化するために使用された。各ウェル...

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

分泌装置とcurli繊維構造モノマーの両方をコードする合成オペロンの設計について説明する。これらのアミロイドと接着ポリマーの過剰産生の付着の測定可能なゲインを許可<em&gt; E大腸菌の</em&gt;シャーシ<sup&gt; 1</sup&gt;。アドヒアランスを可視化し、定量化するための簡単​​な方法を説明しています。

単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

engineering-adherent-bacteria-creating-single-synthetic-curli

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K ビュー.  Université de Lyon. 分泌装置とcurli繊維構造モノマーの両方をコードする合成オペロンの設計について説明する。これらのアミロイドと接着ポリマーの過剰産生の付着の測定可能なゲインを許可 E大腸菌のシャーシ 1。アドヒアランスを可視化し、定量化するための簡単​​な方法を説明しています。

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

遺伝学

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

生物工学

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced antibiotic resistance, which poses potential health dangers, but can also be beneficial for environmental applications such as purification of drinking water. The further development of anti-bacterial therapeutics and biofilm-inspired applications will require the development of reproducible, engineerable methods for biofilm creation. Recently, a novel method of biofilm preparation using a modified three-dimensional (3D) printer with a bacterial ink has been developed. This article describes the steps necessary to build this efficient, low-cost 3D bioprinter that offers multiple applications in bacterially-induced materials processing. The protocol begins with an adapted commercial 3D printer in which the extruder has been replaced with a bio-ink dispenser connected to a syringe pump system enabling a controllable, continuous flow of bio-ink. To develop a bio-ink suitable for biofilm printing, engineered Escherichia coli bacteria were suspended in a solution of alginate, so that they solidify in contact with a surface containing calcium. The inclusion of an inducer chemical within the printing substrate drives expression of biofilm proteins within the printed bio-ink. This method enables 3D printing of various spatial patterns composed of discrete layers of printed biofilms. Such spatially-controlled biofilms can serve as model systems and can find applications in multiple fields that have a wide-ranging impact on society, including antibiotic resistance prevention or drinking water purification, among others.

This article describes a method of transforming a low-cost commercial 3D printer into a bacterial 3D printer that can facilitate printing of patterned biofilms. All necessary aspects of preparing the bioprinter and bio-ink are described, as well as verification methods to assess the formation of biofilms.

Bioprinter で設計されたバイオフィルムの三次元パターン化

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

生物学

リーシュマニア症治療のためのテトラサイクリン制御合成回路の設計

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a step toward therapeutic intervention targeting host-associated factors that drive leishmaniasis. Synthetic biology entails the engineering of genetic components in an orthogonal and modular manner to precisely modulate biological systems, imparting novel functions to cells. In the presented study, elucidation of a systematic pipeline for the development of an inducible tetracycline-controlled (TetON)-based synthetic circuit was aimed at delivering succinate dehydrogenase as a therapeutic agent to facilitate the elimination of intracellular Leishmania parasites. The outlined protocol describes the designing of a synthetic circuit and its subsequent validation. The proposed strategy also concentrates on the incorporation of synthetic circuits in the plasmid backbone as a delivery vehicle. Additionally, delivery machinery employing polyplexes-based nano-particles for the delivery of synthetic circuits was used in murine macrophage cell lines without compromising the cellular morphology. Standardization of the method was conducted for selecting transfected cells and determining optimal induction concentration for synthetic circuit expression. Observations reveal a distinct reduction in intracellular parasite burden in transfected cells compared to infected cells. Pro-inflammatory cytokines were expressed post-infection in synthetic circuit transfected and induced cells as a mechanism to promote parasite elimination. This underscores the synthetic biology-based method as a potent approach in leishmaniasis by targeting host factors associated with disease progression.

著者スポットライト: リーシュマニア 大感染症における革新的な治療法のためのシステムと合成生物学の活用

Here, a protocol for designing, constructing, and delivering tetracycline-controlled based inducible synthetic circuit is presented. The effect of the synthetic circuits on parasite elimination and cytokine expression can be studied by channelizing the presented pipeline. This protocol is relevant for researchers studying synthetic circuit-based therapeutics in infectious diseases.

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

要約

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誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

抗生物質耐性の進化のマルチコピープラスミドのロールのテスト

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

Bioprinter で設計されたバイオフィルムの三次元パターン化

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

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サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

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感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

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化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

抗生物質耐性の進化のマルチコピープラスミドのロールのテスト