Nous tenons à remercier les autres membres de l&#39;équipe iGEM INSA Lyon-ENS (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Ly Goki, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre-Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie et Valérie Desjardins Reverchon), nos commanditaires pour leur soutien financier (bioMérieux, Assystem, EDF, la Fondation INSA, ENS-Lyon et du Département des sciences biologiques de l&#39;INSA de Lyon), F. Wisniewski-Dyé pour la lecture critique de ce manuscrit et le Dr Sze CC pour le cadeau de souche. Drogue B. reçoit un doctorat bourse de recherche de la Région Rhône-Alpes.

1. Conception et synthèse BioBrick de l&#39;opéron Curli <ol><li> Déterminer l&#39;organisation génétique et de localiser les signaux de transcription et de traduction endogènes des gènes curli. Ces informations sont rassemblées dans des bases de données spécialisées telles que RegulonDB un ou ECOGENE b et complétée par une lecture attentive des publications pertinentes. Gestion des données et de pré-analyse in silico ont été réalisées avec le logiciel Clone directeur c. </li><li> Sélectionnez les séquences codantes pertinents. Un ensemble de cinq gènes absolument nécessaires pour la synthèse des curli (CSGB et des monomères de l&#39;ACPS en fibre de codage) et à l&#39;exportation (CSGE csgF et csgG, codant pour le complexe sécrétion Curlin) ont été sélectionnés pour construire l&#39;opéron synthétique. Extraire les séquences choisies à partir de la base de données au format FASTA. Comme le cluster csgGFE est antisens dans E. génome coli, convertir cette séquence dans son counterp complément inversetechnique en utilisant les outils Operations Manager Clone molécule&gt; Processus&gt; Inverser la molécule. Coller la séquence csgEFG derrière csgBA en utilisant la fonction &quot;Ligate&quot; (Clone&gt; Ligate). </li><li> Ajouter le promoteur approprié. En plaçant les cinq gènes sélectionnés curli sous le contrôle du promoteur P rcn, curli sont prévus pour être trop produit en présence de cobalt et de nickel. Le locus rcn code pour une pompe à efflux responsables de désintoxication Ni et Co (ARCM) et son apparenté métallo-régulateur (RMRC). RMRC contrôle l&#39;expression de son gène et RCNA propre en réponse à Ni et Co 19. La séquence comprenant rcn CDS RMRC, la région intergénique rcn ensemble ainsi que les 41 premiers nucléotides de RCNA était avant placedin de la séquence csgBAEFG chimérique (Figure 1, la séquence de toute la construction est prévu en tant que données supplémentaires). </li><li> Optimiser la transcriptionsignaux. Une parfaite du site de fixation des ribosomes (RBS ou parfait = AAGGAGGTATATA) a été ajouté en face du premier ATG de la séquence d&#39;ADN csgBA. Un deuxième RBS parfaite a été ajouté à l&#39;avant de la séquence csgEFG. RBS endogène pour la CSGB et les gènes csgF et csgG ont été conservés. </li><li> Pour adapter les normes iGEM, l&#39;appareil doit être encadré par un préfixe standard BioBrick et le suffixe, contenant des sites de restriction pour EcoRI, Pst I (préfixe) et Spe I et Xba I (suffixe). Coller les séquences correspondant à chaque extrémité de l&#39;appareil d. </li><li> Éliminer toute Eco RI, Pst I, Spe I et le site Xba reconnaissance I dans l&#39;appareil. Pour faciliter le processus de montage ultérieur, la partie BioBrick lui-même ne peut contenir aucun de ces sites de restriction. Dans l&#39;analyse de restriction in silico de l&#39;appareil a révélé un site Pst I dans la séquence csgA, un site Pst I dans la séquence RMRCet un site Eco RI dans le gène CSGE. Ces sites sont situés respectivement en position 80 (Mut1), 1340 (Mut2) et 1830 (mut3) de la séquence des unités (données supplémentaires) et ont été modifiés par suite des mutations silencieuses. Mut1 site Pst I CTGCAG changé dans CGTCTG Mut2 site Pst I CTGCAG changé dans CAGCAG Mut3 GAATTC site Eco RI changé dans GAATT </li><li> Courir à travers la simulation traduction en utilisant le logiciel de gestion Clone (&gt; Fonctionnement molécules processus&gt; Traduire molécules). Utiliser le programme BLAST séquence d&#39;alignement pour vérifier l&#39;homologie parfaite entre la protéine de type sauvage curli et les protéines codées par l&#39;opéron de synthèse. </li><li> Commandez le opéron synthétique. Les services commerciaux de synthèse de gènes sont disponibles à partir de nombreuses sociétés à travers le monde, notre partenaire a été GeneCust (Luxembourg). 4 pg de l&#39;opéron artificiel (3165 pb) ont été reçus quelques semaines plus tard et inséré dans pUC57 (pIG2). </li></ol>2. Visualiser et de quantifier les bactéries adhérentes sur polystyrène <ol><li> Remplir chaque puits d&#39;une plaque de polystyrène de 24 puits avec 2 ml de milieu minimum M63 (0,2% de glucose) et inoculer chaque puits avec 106 cellules d&#39;une culture de la nuit. Croître les bactéries à 30 ° C pendant 18 à 48 heures sans agitation. Chaque colonne (4 puits) représente une modalité. Ajouter la quantité voulue de cobalt (25 à 100 mM) et un antibiotique (ampicilline 100 μg.L -1) en cas de besoin. Les 3 premières rangées de la plaque de 24 puits sont utilisés pour quantifier les bactéries adhérentes faisant la moyenne des 3 répétitions, la dernière ligne gauche est utilisé pour visualiser le biofilm. </li><li> Pour les 3 premières rangées de la plaque de 24 puits: pour chaque puits, récupérer le surnageant contenant les cellules planctoniques. </li><li> Rincer soigneusement chaque puits avec 1 ml de M63 et de la piscine de lavage avec 1 ml du surnageant initial obtenu en 2.2). Cette catégorie est appelé en tant que cellules de natation (= S). </li><li> Récupérer le biofilm dans 1 ml of M63 par grattage et aspiration et refoulement (= B). Vortex 15 sec. Estimer le nombre de bactéries en surface jointes et la natation à partir de la densité optique à 600 nm (DO600) pour donner le pourcentage adhésion correspondant à chaque modalité. </li><li> Le pourcentage d&#39;adhérence est calculée en utilisant la formule: BX100 / (3XS + B). </li><li> Seulement pour la dernière rangée de la plaque de 24 puits: jeter les cellules planctoniques. </li><li> Rinçage avec 1 ml de M63 le biofilm qui s&#39;est développé sur la partie inférieure de la plaque. </li><li> Sécher la plaque ouverte pendant 1 heure à 80 ° C. </li><li> Ajouter 100 ul de violet cristal 20% pendant 2 min dans chaque puits suivi par des lavages importants avec de l&#39;eau afin de visualiser les bactéries de surface inscrits. Trois essais indépendants (plaques) doivent être effectués pour s&#39;assurer de la reproductibilité. </li></ol> 3. Visualisez les bactéries adhérentes sur le verre par microscopie <ol><li> Obtenir un châssis fluorescent. L&#39;E. souche E. coli SCC1 qui constitutively exprime la protéine fluorescente verte (GFP), sans différence notable de la souche MG1655 20 est un hôte approprié pour la synthèse du plasmide portant l&#39;opéron curli. </li><li> Transformer SCC1 avec le plasmide pIG2 (= opéron synthétique curli inséré à l&#39;Eco RI / Pst I du plasmide site de pUC57) pour obtenir la souche S23. Transformer SCC1 avec un plasmide contrôle (pUC18) pour obtenir la souche témoin S24 21. </li><li> Cultivez précultures nuit du S23 et du contrôle (S24) des souches à 30 ° C en moyenne M63 supplémenté avec du glucose (0,2%) et de l&#39;ampicilline (100 μg.L -1). </li><li> Inoculer 15 ml du même milieu en boîtes de Pétri avec 100 ul de la pré-cultures. Ajouter à la concentration appropriée de cobalt (soit 25 uM) et n&#39;oubliez pas le contrôle négatif sans cobalt. Introduire 3 lamelle de verre rectangulaire dans chaque boîte de Pétri. Incuber une nuit à 30 ° C sans agitation. </li><li> Enlever les lamelles vientm la boîte de Pétri et soigneusement égoutter. Nettoyer soigneusement la face inférieure d&#39;une étoffe de coton imprégné de petite éthanol à 70 ° par essuyer tout résidu bactérien. Pour l&#39;observation confocale, nettoyer les deux extrémités supérieures sur quelques millimètres pour permettre la fixation supplémentaire de la lamelle. </li><li> Bactéries adhérentes peuvent être visualisés directement, mais rapidement sous microscope à fluorescence, mais soigneusement éviter le séchage de l&#39;échantillon. </li><li> Pour l&#39;observation confocale, déposer la lamelle sur une lame de verre avec la face supérieure recouverte par le film biologique placé face vers le haut. Le biofilm est ensuite recouvert d&#39;une lamelle couvre-objet plus grand, qui est fixé sur la lame de verre avec vernis. Inverser la configuration pour que le biofilm sera désormais sur la face inférieure. </li><li> Placez la configuration sous le microscope laser confocal. Un droit Axioplan2 LSM510 (Zeiss) microscope confocal au laser a été utilisé à la plate-forme de f Platim. </li><li> Définition. GFP exciter à 488 nm, et de recueillir la fluorescence bactérienne dans la plage de 500 à 600 nm<html> . Utilisez 40x objectif à immersion d&#39;huile d&#39;acquisition d&#39;images à balayage laser confocal Mode. Balayer l&#39;ensemble des structures tridimensionnelles des biofilms de la surface du solide à l&#39;interface avec le milieu de croissance, à l&#39;aide d&#39;une étape consistant à 1 um. </li><li> Effectuer projections tridimensionnelles avec Imaris logiciel (Bitplane, Zürich, Suisse). Déterminer l&#39;épaisseur du biofilm par l&#39;analyse de la valeur moyenne z le long de sections longitudinales statistiques. Quantification des biovolumes biofilm peut être extraite de confocale z-piles comme décrit par ailleurs 22. </li></ol> un RegulonDB fournit des informations sur l&#39;organisation mécanique opéron et leur décomposition en unités de transcription, des promoteurs et leur type sigma, des gènes et de leurs sites de liaison ribosomale, des terminateurs, des sites de liaison spécifiques de régulateurs transcriptionnels, ainsi que leur organisation en phrases réglementaires.et = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp b La base de données contient des informations actualisées ECOGENE sur le E. coli K-12 du génome et du protéome des séquences de gènes, y compris des bibliographies étendues. Une attention ECOGENE majeur a été la réévaluation des sites d&#39;initiation de la traduction. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> c <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> d <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> cadeau de Chun Chau e Sze, Nan Yang Technical University, Singapour. f Platim microscopique plate-forme UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les étapes critiques L&#39;étape la plus critique dans cette approche de la biologie synthétique est la conception gène. Conception gène synthétique doit être méticuleux pour assurer une production efficace du système. Deux gènes codant pour les monomères de fibres et de trois gènes codant pour des protéines impliquées dans leur système de sécrétion ont été assemblés avec un promoteur fort et inductible métal pour créer une nouvelle unité fonctionnelle pour une nouvelle a...

L&#39;adhérence des bactéries à l&#39;appui abiotiques jouent un rôle majeur dans les piles à combustible bioremédiation, biocatalyse ou microbienne. Procédés de bioremédiation utiliser les capacités des micro-organismes pour dégrader les substances organiques, ou de modifier la distribution des métaux (immobilisation, volatilisation) ou spéciation. Ces activités bénéfiques sont observés dans les écosystèmes aquatiques et terrestres, mais aussi dans les systèmes artificiels développés pour traiter l&#39;eau polluée de déchets industriels et domestiques. L&#39;intensité et de la qualité de l&#39;activité microbienne dépend de facteurs physico-chimiques, mais aussi sur le mode de vie des micro-organismes (flottement libre ou encastré dans biofilm). La formation d&#39;un biofilm est associée à une résistance à promouvoir le métabolisme des biocides par des mécanismes divers. Ce phénomène va donc être encouragée dans la plupart des processus de bioremédiation. En outre, les cellules d&#39;Escherichia coli ingénierie pour contrôler la formation du biofilm a été appliquée avec succès àimmobiliser la cellule entière capteurs sur les biopuces 2-3. Adaptation des micro-organismes à forte concentration de métaux se fait par des mécanismes divers tels que l&#39;adsorption sur les composants de la matrice extracellulaire, l&#39;activation de la pompe d&#39;efflux ou supports spécifiques capables de concentrer le métal dans la cellule. Stimuler ces activités bactériennes par génie génétique permet un traitement efficace et pas cher de pollution par les métaux à l&#39;échelle du laboratoire, en particulier dans le cas des métaux hautement toxiques en faible quantité, comme décrit par Raghu et al. 2008 4. Assainissement bactérienne représente dans ce cas une méthode économie compétitive et rentable par rapport aux procédés chimiques classiques utilisant des résines échangeuses d&#39;ions. Les auteurs ont décrit un E. châssis coli génétiquement modifié pour l&#39;absorption et la rétention de cobalt par KO première pompe d&#39;efflux du gène codant RCNA, puis par transformation avec un plasmide multicopie surproduction permettant detransporteur avec captation préférentielle pour le cobalt. Une telle souche apparaît comme une alternative efficace aux résines échangeuses d&#39;ions pour le traitement des effluents radioactifs, mais une question essentielle non résolue est la récupération de bactéries contaminés à la fin de la procédure 4. L&#39;objectif de notre travail était donc de concevoir une souche conçu sur mesure pour coller sur des supports abiotiques tels que le verre ou le plastique. Parmi l&#39;ensemble des adhésines et des fimbriae adhérent identifiés dans bactéries Gram-, nous avons choisi de concevoir un système permettant la production de curli. Curli sont des fibres amyloïdes minces (2-5 nm de diamètre) et très agrégative qui font saillie à partir de la E. coli et Salmonella surface sous forme de matrice non cristalline insoluble et 5-7. Curli sont également impliqués dans la colonisation des surfaces abiotiques et le développement de biofilms 8. Curli ont été récemment montré à lier les ions de mercure 9. Amyloïdes sont en effet connus pour posséder une grandeaffinité pour les ions de métaux tels que le Cu 2 +, Zn 2 + et Fe 3 + 10. Cette propriété pourrait améliorer encore la décontamination des effluents pollués métalliques. Le cluster csg est responsable de la production de fibres curli et est constitué de deux opérons divergente transcrites (Figure 1). Le CSGB, csgA et les gènes SCSC constituent l&#39;opéron sens, codant pour les deux sous-unités curli, l&#39;ACPS et CSGB. SCSC semble être impliqué dans une activité redox dans le système de la biogenèse des curli et d&#39;affecter le comportement des pores CsgG 11. Cependant, l&#39;absence d&#39;SCSC dans la majorité des bactéries productrices de curli indique que la protéine correspondante fournit seulement un niveau secundary de contrôle de la biogenèse des curli. Pour simplifier le système, nous avons choisi de travailler avec le nombre minimal de gènes. Le csgDEFG operonencodes protéines essentielles dans la régulation et le transportde l&#39;ACPS et CSGB à la surface cellulaire. CsgD est un activateur de la transcription de l&#39;opéron csgBAC et joue un rôle clé dans le contrôle de la formation de biofilms en contrôlant la production de fimbriae curli et les composants du biofilm d&#39;autres telles que la cellulose 12 et en inhibant la production flagelle 13. CSGE, CsgF et CsgG constituer un appareil de sécrétion curli spécifique dans la membrane externe à travers lequel la sous-unité protéique majeur curli ACPS est sécrétée comme une protéine soluble. La polymérisation de l&#39;ACPS dépend in vivo sur la CSGB membranaire des protéines de nucléation (revue dans 14). Voies de régulation complexes impliquant plusieurs systèmes à deux composants ont été montré pour contrôler l&#39;expression du gène curli 15-16. Ces règlements complexes permettent aux bactéries de former des biofilms épais via la production curli en réponse à des signaux environnementaux, mais sont difficiles à contrôler pour les applications industrielles. Afin de faciliter la reprise de l&#39;a rencontréal-farcies bactéries au cours d&#39;un processus industriel, la fixation des bactéries sur un support solide doit en effet être contrôlé par le paramètre bien défini (s). Les propriétés adhérentes de curli sont liés à leur 17 nature amyloïde et pourrait être utilisé pour améliorer les processus de bioremédiation, mais un dispositif simple et facile à contrôler doit être créé. Parmi ces 7 gènes 18, un ensemble de 5 gènes absolument nécessaire pour la synthèse des curli (CSGB et des monomères de l&#39;ACPS en fibre de codage) et à l&#39;exportation (CSGE csgF et csgG, codant pour le complexe sécrétion curli) ont été sélectionnés pour construire l&#39;opéron synthétique. Pour échapper à la régulation «naturelle» des curli, un opéron synthétique comprenant ces 5 gènes CSG sous le contrôle d&#39;un promoteur fort et le cobalt-overinducible (figure 2) a été conçu et synthétisé. L&#39;analyse pas-à-pas de la région codant pour curli et la procédure de conception pour un fonctionnement synthétique opéron sont décrits. Deux méthodes permettent de visualiser et de quantifier l&#39;adhérence bactérienne au polystyrène et le verre sont expliqués.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (pMB1 ori, 2710 pb) avec un 3165 pb EcoRI / PstI contenant la synthèse P rcn - csgBAEFG opéron; Ampr </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Plasmide multicopie (pMB1 ori, 2686 pb), Ampr </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP-étiqueté MG1655, don de CC Sze) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl 2 </td><td> Sigma </td><td></td><td> 0,1 M solution de conservées à la température ambiante </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> Plaque de 24 puits </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> Polystyrène plaques à 24 puits </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

La méthode décrite ici consiste à redessiner E. coli propriétés d&#39;adhérence par assemblage au nombre minimum de gènes curli sous le contrôle d&#39;un promoteur fort et un métal overinducible, et à visualiser et de quantifier le gain résultant de l&#39;adhésion bactérienne. Cette méthode s&#39;applique principes d&#39;ingénierie appropriées de l&#39;abstraction et de la normalisation de la biologie synthétique, et les résultats de la BioBrick BBa_K540000 (Meilleur appareil BioBrick nouvelle, d&#39;ingénierie, iGEM 2011). La première étape consiste en la conception de l&#39;opéron de synthèse consacré à la surproduction curli en réponse à métal, et donc à augmenter les capacités d&#39;adhérence de la souche de type sauvage. L&#39;original a été modifié curli opéron in silico afin d&#39;optimiser signaux de transcription et de traduction et d&#39;échapper à la régulation «naturelle» des curli. Cette approche a permis de tester avec succès notre compréhension actuelle de la production curli. Moreover, simplifier la réglementation curli en commutant le promoteur endogène complexe (plus de 10 régulateurs transcriptionnels identifié) à un simple métal réglementé promoteur rend l&#39;adhésion beaucoup plus facile à contrôler. La deuxième étape comprend l&#39;évaluation qualitative et quantitative des capacités d&#39;adhérence par la mise en œuvre de méthodes simples. Ces méthodes sont applicables à un large éventail de bactéries adhérentes indépendamment des structures biologiques impliqués dans la formation de biofilm. Test d&#39;adhérence à des plaques de polystyrène de 24 puits fournit une visualisation rapide préliminaire du biofilm bactérien après coloration au cristal violet. Ce test qualitatif peut être aiguisé par la quantification du pourcentage d&#39;adhérence. Une telle méthode est très simple mais plus précis que coloration au violet de cristal que comme décrit précédemment 1 avec une bonne répétabilité et de reproductibilité. Visualisation des bactéries GFP-marqués sur des lames de verre par fluorescence ou conf lasermicroscopie ocal permet de renforcer les résultats obtenus avec le test de la plaque de 24 puits par l&#39;observation directe du phénomène.

Annotation in silico de la séquence de type sauvage de csg E. coli K12 associée à l&#39;optimisation des signaux de transcription et de traduction a permis de concevoir la seule synthétique curli opéron P rcn-CSG représenté sur la figure 3 (séquence complète de données supplémentaires). Protocole n ° 2 et le protocole 3 ont été utilisés pour visualiser et quantifier l&#39;adhérence associée à la production curli. Utilisation coloration au cristal vio...

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

La conception d&#39;un encodage opéron synthétique à la fois l&#39;appareil sécrétoire et les monomères de fibres structurelles curli est décrite. Surproduction de ces amyloïdes et les polymères adhérentes permet un gain mesurable de l&#39;adhésion de l&#39;<em&gt; E. coli</em&gt; Châssis<sup&gt; 1</sup&gt;. Une façon simple de visualiser et de quantifier l&#39;adhérence sont expliqués.

Ingénierie bactéries adhérentes en créant un simple synthétique Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K vues.  Université de Lyon. La conception d'un encodage opéron synthétique à la fois l'appareil sécrétoire et les monomères de fibres structurelles curli est décrite. Surproduction de ces amyloïdes et les polymères adhérentes permet un gain mesurable de l'adhésion de l' E. coli Châssis 1. Une façon simple de visualiser et de quantifier l'adhérence sont expliqués.

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Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procédure pour l&#39;ingénierie du poumon

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Recherche

Bio-ingénierie

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

Synthétique, Multi-Layer, auto-oscillation de fabrication Vocal Modèle Fold

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analyser l&#39;internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d&#39;imagerie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Gradient de densité multicouche de polymérisation (DGMP): une nouvelle technique pour la création multi-compartiment, échafaudages personnalisables pour l&#39;ingénierie tissulaire

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Détection optique de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple par pinces optiques

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Génie tissulaire par Intrinsic vascularisation dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Chambre Ingénierie

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Reconnaissance moléculaire Ingénierie avec Polymères Bio-mimétiques sur simple Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.