نشكر أعضاء آخرين في فريق ليون iGEM INSA-ENS (فيفيان Chansavang، دوموند ماتيلد، ألكسندر دوبري، Geffroy ميلاني، Gonthier كليمنس، Jaulin مارجو، هاج أوريلي، Goki لي، Poinsot توماس، بيريل روير برتراند، Soula جولي، مايكل Vonzy بيار إيف زوندل، سفيان Bouhmadi، Brette أوليفييه، Chambonnier جايل، ايزارد لورا، Kroiss Aurianne، فيليب لوجون، رودريغ أنياس، Rondelet ارنو، وسيلفي Reverchon ديجاردان فاليري)، الرعاة على دعمهم المالي (BIOMERIEUX، ASSYSTEM، EDF، مؤسسة INSA، ENS ليون وإدارة العلوم البيولوجية INSA ليون)، F. Wisniewski صبغ للقراءة نقدية لهذه المخطوطة والدكتور CC سزي هدية التوتر. B. مرساة يتلقى دكتوراه الزمالة من منطقة الرون ألب.

1. Biobrick تصميم وتجميع OPERON Curli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد منظمة الوراثية وتوطين الإشارات الذاتية النسخي ومتعدية من الجينات curli. يتم جمع هذه المعلومات في قواعد البيانات المتخصصة مثل RegulonDB أو ب EcoGene والانتهاء من قراءة متأنية من المنشورات ذات الصلة. أجريت في إدارة البيانات وسيليكو preanalysis مع مدير استنساخ البرمجيات ج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد متواليات ذات الصلة الترميز. وقد تم اختيار مجموعة من خمسة جينات حاجة على الاطلاق لتخليق curli (csgB ومونومرات csgA الألياف الترميز) والتصدير (csgE csgF وcsgG، ترميز معقدة إفراز كيرلين) لبناء OPERON الاصطناعية. استخراج تسلسل اختيارهم من قاعدة البيانات في شكل FASTA. كما هو الكتلة csgGFE العقاقير في E. الجينوم القولونية، وتحويل هذا التسلسل في counterp في تكملة عكسالفن استنساخ باستخدام أدوات إدارة العمليات&gt; جزيء عملية&gt; عكس الجزيء. لصق تسلسل csgEFG وراء csgBA باستخدام وظيفة &quot;Ligate&quot; (استنساخ&gt; Ligate). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المروج المناسبة. عن طريق وضع الجينات الخمس المختارة curli تحت سيطرة المروج P RCN، ومن المتوقع أن يكون أكثر من curli المنتجة في وجود الكوبالت والنيكل. موضع RCN بترميز مضخة مسؤولة عن هروب رأس المال وإزالة السموم ني شركة (ركونا) وما شابه ذلك من وفلزية المنظم-(rcnR). RcnR تسيطر على التعبير عن الجينات وركونا الخاصة استجابة لني والتعاون 19. تسلسل RCN تضم CDS rcnR، كانت المنطقة كلها RCN بين الجينات بالإضافة إلى النيوكليوتيدات 41 الأولى من ركونا placedin أمام تسلسل خيالي csgBAEFG (الشكل 1، وتقدم تسلسل بناء على كونه البيانات التكميلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين النسخيالاشارات. تمت إضافة موقع مثالي ملزمة الريبوسوم (أو الكمال RBS = AAGGAGGTATATA) أمام ATG الأول من تسلسل الحمض النووي csgBA. تمت إضافة RBS 2 مثالية أمام تسلسل csgEFG. تم الحفظ RBS الذاتية للcsgB والجينات وcsgF csgG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتناسب المعايير iGEM، يجب يحيط الجهاز عن طريق بادئة BioBrick القياسية واللاحقة، التي تحتوي على مواقع لتقييد RI إيكو، PST I (اختصار) وجمعية مهندسي البترول وXba I I (لاحقة). لصق متواليات المقابلة في نهاية كل من د الجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القضاء على أي RI إيكو، PST I، I جمعية مهندسي البترول وXba موقع الاعتراف I في الجهاز. لزيادة تسهيل عملية التجميع، قد الجزء BioBrick نفسها لا تحتوي على أي من هذه المواقع قيود. في تحليل تقييد سيليكون للجهاز كشف أحد الباسيفيكي I موقع في التسلسل csgA، موقع واحد I PST في تسلسل rcnRوموقع واحد RI منظمة التعاون الاقتصادي في الجين csgE. وتقع هذه المواقع على التوالي في المركز 80 (Mut1)، 1340 (Mut2) و1830 (Mut3) من تسلسل الجهاز (بيانات تكميلية) وجرى تعديل على النحو التالي من الطفرات الصامتة. CTGCAG تغيير موقع Mut1 I PST في CGTCTG CTGCAG تغيير موقع Mut2 I PST في CAGCAG Mut3 موقع ايكو RI GAATTC تغير في GAATT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل من خلال المحاكاة باستخدام برنامج ترجمة استنساخ مدير (عملية&gt; جزيئات عملية&gt; جزيئات ترجم). استخدام برنامج المحاذاة تسلسل BLAST للتحقق من تماثل تام بين البروتين نوع curli البرية والبروتينات المشفرة بواسطة OPERON الاصطناعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمر OPERON الاصطناعية. وكان شريكنا الخدمات التجارية توليف الجينات وتتوفر العديد من الشركات في جميع أنحاء العالم من، Genecust (لوكسمبورغ). وقد وردت 4 ميكروغرام من OPERON الاصطناعي (3165 BP) بعد أسابيع قليلة ومدرجة ضمن pUC57 (pIG2). </li></ol>2. تصور وقياس البكتيريا تمسكا على البوليستيرين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر من لوحة البوليسترين 24-جيدا مع 2 مل من المتوسط ​​M63 الحد الأدنى (الجلوكوز 0.2٪) وتطعيم كل بئر مع 106 الخلايا من ثقافة بين عشية وضحاها. تنمو البكتيريا في C ° 30 لمدة 18 إلى 48 ساعة دون أن تهتز. كل عمود (4 آبار) يمثل الطريقة. إضافة كمية مناسبة من الكوبالت (25 الى 100 ​​ملم) والمضادات الحيوية (الأمبيسلين 100 μg.L -1) عند الحاجة. وتستخدم الصفوف 3 الأولى من لوحة 24-جيدا لتحديد البكتيريا الملتصقة عن طريق حساب متوسط ​​التكرار 3، يستخدم اليسار الصف الأخير لتصور بيوفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للصفوف 3 الأولى من لوحة 24 أيضا: لكل بئر، واستعادة طاف يحتوي على خلايا العوالق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بعناية كل بئر مع 1 مل من M63 وحمام سباحة غسل 1 مل مع طاف الأولية التي تم الحصول عليها في 2.2). ويشار إلى هذه المجموعة باسم خلايا السباحة (= S). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد بيوفيلم في 1 مل سو M63 عن طريق كشط وpipetting صعودا وهبوطا (= B). دوامة 15 ثانية. تقدير عدد البكتيريا سطح المرفقة والسباحة من الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600) لإعطاء نسبة الالتزام المقابلة لكل طريقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حساب النسبة المئوية للانضمام باستخدام الصيغة: Bx100 / (+ B 3xS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط لفي الصف الأخير من لوحة 24 أيضا: تجاهل الخلايا العوالق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع 1 مل من M63 في بيوفيلم التي وضعت على الجزء السفلي من اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف لوحة مفتوحة لمدة 1 ساعة عند 80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من الكريستال البنفسجي 20٪ لمدة 2 دقيقة في كل تليها يغسل جيدا من قبل واسعة مع الماء لتصور سطح البكتيريا المرفقة. ثلاثة فحوصات مستقلة (لوحات) يجب أن يتم لضمان التكاثر. </li></ol> 3. تصور البكتيريا تمسكا على الزجاج بواسطة المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على هيكل الفلورسنت. وE. سلالة الإشريكية ه SCC1 التي constitutivelذ عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) لا فرق مع ملاحظتها من سلالة الأم MG1655 20 هو مجموعة مناسبة لتحمل البلازميد الاصطناعية curli OPERON. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل SCC1 مع pIG2 بلازميد (= OPERON curli الاصطناعية المدرجة في RI إيكو / الباسيفيكي I موقع البلازميد pUC57) للحصول على سلالة S23. تحويل SCC1 مع عنصر تحكم بلازميد (pUC18) للحصول على سلالة تحكم S24 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو بين عشية وضحاها من precultures S23، وعلى رقابة (S24) سلالات في 30 ° C في M63 المتوسطة تستكمل مع الجلوكوز (0.2٪) والأمبيسلين (100 μg.L -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 15 مل من المتوسط ​​في نفس أطباق بتري مع 100 ميكرولتر من precultures. إضافة تركيز مناسب من الكوبالت (أي 25 ميكرومتر) و لا تنسى سيطرة سلبية دون الكوبالت. إدخال 3 ساترة الزجاج مستطيلة في كل طبق بتري. احتضان بين عشية وضحاها في C ° 30 دون أن تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة جيئة وذهابام في طبق بتري واستنزاف بعناية. بعناية تنظيف الوجه السفلي مع الاشياء الصغيرة القطن المشبع مع الإيثانول ° 70 من محو كل بقايا البكتيرية. لمراقبة مبائر، وتنظيف طرفي العليا على بضعة ملليمترات للسماح التثبيت مزيد من ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تصور البكتيريا الملتصقة مباشرة ولكن بسرعة تحت المجهر مضان، ولكن تجنب بعناية تجفيف العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمراقبة مبائر، إيداع ساترة على شريحة زجاجية مع الوجه العلوي المشمولة بيوفيلم وضعها مواجهة. ثم يغطى بيوفيلم مع أكبر ساترة، فهو أمر ثابت إلى الشريحة الزجاجية مع الورنيش. عكس الإعداد بحيث سيكون بيوفيلم الآن على الوجه السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الإعداد تحت المجهر متحد البؤر الليزر. تم استخدام حق Axioplan2 LSM510 (زايس) مبائر المجهر الليزر في منصة و Platim. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع. GFP تثير في 488 نانومتر، وجمع مضان البكتيرية في نطاق 500 حتي 600 نانومتر<html> . استخدام الغمر 40X الهدف للحصول على النفط في الصور ليزر متحد البؤر المسح وضع. مسح الشامل الثلاثي الأبعاد هياكل الأغشية الحيوية من سطح صلب إلى واجهة مع النمو المتوسط، وذلك باستخدام خطوة من 1 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء ثلاثي الأبعاد مع برنامج توقعات IMARIS (Bitplane، زيوريخ، سويسرا). تحديد سمك بيوفيلم من خلال تحليل القيمة Z متوسط ​​طول المقاطع الطولية الإحصائية. ويمكن استخراج الكمي للbiovolumes بيوفيلم من مبائر Z-مداخن كما هو موضح في مكان آخر 22. </li></ol> وRegulonDB يقدم معلومات عن تنظيم الآلية OPERON والتحلل من النسخ إلى وحدات، والمروجين نوعها سيجما والجينات ومواقعها ملزمة الريبوسوم، الغلق، ومواقع الربط المنظمين النسخي محددة، فضلا عن منظمتهم في العبارات التنظيمية.وآخرون = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp (ب) قاعدة بيانات تحتوي على معلومات EcoGene محدثة حول E. القولونية K-12 وتسلسل الجينوم بروتيوم، بما في ذلك المراجع الجينات واسعة النطاق. وثمة تركيز كبير على EcoGene إعادة تقييم مواقع بداية الترجمة. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> ج <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> د <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php؟title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> ه هدية تشون تشاو سزي، نان يانغ التقنية جامعة سنغافورة. و Platim المجهرية منصة UMS3444 العلوم البيولوجية جيرلان - ليون الجنوب.

<ol>
	<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+sensor+cell+arrays.">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li><li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array.">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li><li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes.">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li><li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli.">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li><li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains:+role+of+flagella,+curli+and+colanic+acid.">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li><li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation.">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li><li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces:+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression.">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li><li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg(II).">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li><li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Zn(II),+Cu(II),+and+Fe(II)+ions+to+Alzheimer's+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence.">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li><li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis.">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li><li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli.">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li><li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli.">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li><li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation.">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li><li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpxR/OmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli.">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li><li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis.">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li><li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive.">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li><li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12.">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li><li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site:+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt.">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li><li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context.">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli.">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li><li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere:+new+perspectives+for+studying+microbial+communities.">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li><li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Adhesives. , (2006).</li><li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method.">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device.">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li><li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria.">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li><li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in molecular genetics. , (1972).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الخطوات الحاسمة الخطوة الأكثر أهمية في هذا النهج البيولوجيا التركيبية هو تصميم الجينات. تصميم الجينات الاصطناعية يجب أن يكون دقيق لضمان إنتاج نظام فعال. وقد تم تجميع اثنين من الجينات ترميز أحادية الألياف والبروتينات ترميز الجينا...

الانضمام إلى الدعم غير الحيوية البكتيرية تلعب دورا رئيسيا في خلايا الوقود المعالجة البيولوجية، أو التحفيز الأحيائي الميكروبية. عمليات المعالجة البيولوجية استخدام قدرات الكائنات الحية الدقيقة لتحلل المواد العضوية، أو لتعديل توزيع المعادن (الشلل، التطاير) أو انتواع. ويلاحظ في هذه الأنشطة المفيدة النظم الإيكولوجية المائية والأرضية، ولكن أيضا في النظم الاصطناعية وضعت لمعالجة المياه الملوثة من النفايات الصناعية والمنزلية. كثافة ونوعية للنشاط الميكروبي تعتمد على العوامل الفيزيائية والكيميائية، ولكن أيضا على نمط الحياة من الكائنات الحية الدقيقة (التعويم الحر أو تضمينها داخل بيوفيلم). ويرتبط تشكيل بيوفيلم مع الأيض تعزيز المقاومة لمبيدات الحشرات عن طريق آليات متنوعة. ولذلك يجب تشجيع هذه الظاهرة في معظم عمليات المعالجة البيولوجية. وعلاوة على ذلك، تم خلايا الإشريكية القولونية الهندسية للسيطرة على تشكيل بيوفيلم تطبيقها بنجاح علىشل خلية كاملة على أجهزة استشعار biochips 2-3. التكيف من الكائنات الحية الدقيقة لتركيزات عالية من المعادن عن طريق آليات متنوعة يحدث مثل الامتزاز على مكونات المصفوفة خارج الخلية، تفعيل مضخة هروب رأس المال أو شبكات محددة قادرة على تركيز المعادن في الخلية. تعزيز هذه الأنشطة البكتيرية عن طريق الهندسة الوراثية يسمح العلاج الفعال والرخيص من التلوث بالمعادن في نطاق المختبر، وخاصة في حالة المعادن السامة جدا في ضعف الكمية كما وصفها راغو وآخرون 2008 4. المعالجة البكتيرية يمثل في هذه الحالة وسيلة إنقاذ تنافسية والتكلفة مقارنة العمليات الكيميائية الكلاسيكية باستخدام راتنجات التبادل الأيوني. وصف الكتاب وE. هيكل القولونية المعدلة وراثيا لامتصاص القشور والاحتفاظ الاولى ضرب الترميز الجينات هروب رأس المال مضخة ركونا، وبعد ذلك تحول مع نسخة متعددة البلازميد الإفراط في الإنتاج مما يسمح لأحدنقل مع امتصاص تفضيلية للالكوبالت. هذه السلالة يظهر كبديل فعال لراتنجات التبادل الأيوني لعلاج النفايات السائلة المشعة، ولكن القضية الرئيسية التي لم تحسم بعد التعافي من البكتيريا الملوثة في نهاية عملية 4. وكان الهدف من عملنا لذا لهندسة سلالة مصمم خصيصا قادرة على التمسك الدعم غير الحيوية مثل الزجاج أو البلاستيك. من بين مجموعة كاملة من adhesins وخمل تمسكا المحددة في الغرام البكتيريا، اخترنا لتصميم نظام يسمح curli الإنتاج. Curli هي الألياف اميلويد رقيقة (2-5 نانومتر قطر) وحصري جدا أن تبرز من E. كولاي والسالمونيلا وسطح مصفوفة غير البلورية وغير قابلة للذوبان 5-7. وتشارك أيضا في Curli استعمار السطوح غير الحيوية، وتطوير الأغشية الحيوية 8. عرضت مؤخرا لربط أيونات Curli الزئبق 9. ومن المعروف بالفعل اميلويدس لامتلاك عاليةلأيونات المعادن تقارب مثل النحاس 2 +، 2 + الزنك والحديد 3 + 10. قد هذه الخاصية زيادة تحسين إزالة التلوث من النفايات السائلة الملوثة المعادن. الكتلة إداراته مسؤولة عن إنتاج الألياف curli وتشكل اثنين من operons المحولة divergently (الشكل 1). و، csgB csgA والجينات csgC تشكل OPERON المعنى، وهما ترميز الوحدات الصغرى curli، وCsgA CsgB. CsgC يبدو أن يشاركوا في أي نشاط الأكسدة داخل منظومة نشوء حيوي curli وتؤثر على السلوك CsgG المسام 11. ومع ذلك، فإن عدم وجود csgC في معظم البكتيريا المنتجة للcurli يشير إلى أن البروتين المقابل يوفر فقط على مستوى secundary من السيطرة على نشوء حيوي curli. لتبسيط النظام، وقد اخترنا العمل مع الحد الأدنى لعدد الجينات. وcsgDEFG operonencodes البروتينات الضرورية في تنظيم وسائل النقلمن CsgA وCsgB إلى سطح الخلية. CsgD هو المنشط النسخي من OPERON csgBAC ويلعب دورا رئيسيا في السيطرة على تشكيل بيوفيلم عن طريق التحكم في إنتاج مكونات وخمل curli بيوفيلم أخرى مثل السليلوز 12 و من خلال منع انتاج السوط 13. CsgE، وCsgF CsgG تشكل جهاز إفرازية curli محددة في الغشاء الخارجي من خلالها، ويفرز الوحيدات curli الرئيسية CsgA البروتين وبروتين قابل للذوبان. البلمرة من CsgA يعتمد في الجسم الحي على CsgB غشاء محدد البروتين nucleator (تم استعراضها في 14). وقد ثبت مسارات التنظيمية المعقدة التي تنطوي على العديد من أنظمة ثنائية المكون للسيطرة على التعبير الجيني curli 15-16. هذه الأنظمة المعقدة تسمح للبكتيريا لتشكيل الأغشية الحيوية سميكة عن طريق إنتاج curli استجابة لمنبهات البيئة، ولكن يصعب التحكم في التطبيقات الصناعية. لتسهيل انتعاش الحدآل محشوة البكتيريا أثناء العملية الصناعية، تثبيت البكتيرية إلى دعم قوي يحتاج في الواقع إلى أن يسيطر عليها المعلمة واضحة المعالم (ق). وترتبط خصائص ملتصقة بهم من curli إلى 17 اميلويد الطبيعة، ويمكن استخدامها لتحسين عمليات المعالجة البيولوجية، ولكن جهاز أبسط والسيطرة عليها بسهولة لابد من خلق. وقد تم اختيار هذه الجينات بين 7 18، ومجموعة من 5 مطلوب على الاطلاق الجينات لتخليق curli (csgB ومونومرات csgA الألياف الترميز) والتصدير (csgE csgF وcsgG، ترميز معقدة إفراز curli) لبناء OPERON الاصطناعية. هربا من &quot;الطبيعي&quot; تنظيم curli، وOPERON الاصطناعية تضم هذه الجينات إداراته 5 تحت سيطرة المروج قوية والكوبالت overinducible-(الشكل 2) تم تصميم وتوليفها. التحليل خطوة بخطوة في المنطقة curli ترميز وتصميم الإجراء لSYN الوظيفيةويرد وصف thetic OPERON. وأوضح طريقتين لتصور وقياس الالتزام البكتيرية إلى البوليسترين والزجاج.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (pMB1 أوري، 2710 BP) مع جزء EcoRI 3165 / PstI بي بي الاصطناعية التي تحتوي على P RCN - csgBAEFG OPERON؛ الأمبير ص </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> بلازميد Multicopy (pMB1 أوري، 2686 BP)، ص الأمبير </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP الموسومة MG1655، هدية من سزي CC) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> 2 كوكلي </td><td> سيجما </td><td></td><td> أبقى 0،1 محلول M في درجة حرارة الغرفة </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </TD&gt; </tr><tr><td> 24 لوحة جيدا </td><td> نونك </td><td> 55429 </td><td> البوليسترين 24 وحات جيدة </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

الطريقة الموضحة هنا يتمثل في إعادة تصميم E. خصائص الالتزام القولونية عن طريق تجميع الحد الأدنى لعدد الجينات curli تحت سيطرة أحد المروجين قوية والمعادن overinducible، وتصور وقياس في الربح الناتج من الالتزام البكتيرية. هذا الأسلوب ينطبق مبادئ الهندسة المناسبة من التجريد وتوحيد البيولوجيا التركيبية، والنتائج في Biobrick BBa_K540000 (أفضل جهاز Biobrick جديدة وهندستها، iGEM 2011). الخطوة الأولى تتمثل في تصميم OPERON الاصطناعية المخصصة لفيض الإنتاج curli ردا على المعادن، وبالتالي في زيادة قدرات الانضمام للسلالة النوع البري. تم تعديل curli OPERON الأصلي في السيليكون من أجل تحسين إشارات النسخي ومتعدية والهروب من &quot;الطبيعي&quot; تنظيم curli. هذا النهج سمح لاختبار نجاح مع فهمنا الحالي للإنتاج curli. Moreoveص، وتبسيط تنظيم curli عن طريق التحول المروج الذاتية المعقدة (أكثر من 10 المنظمين النسخي المحددة) إلى المروج المعادن التنظيم بسيطة يجعل الالتزام أسهل بكثير للسيطرة. الخطوة الثانية تشمل التقييم النوعي والكمي لقدرات التزام تنفيذ طرق بسيطة. هذه الأساليب تنطبق على طائفة واسعة من البكتيريا الملتصقة بغض النظر عن الهياكل البيولوجية المشاركة في تشكيل بيوفيلم. اختبار في لوحات البوليسترين الالتزام 24 جيد يوفر التصور السريع الأولية للبيوفيلم البكتيريا بعد تلطيخ البنفسجي الكريستال. ويمكن شحذ هذا الاختبار النوعي من تحديد مقدار النسبة المئوية للانضمام. هذه طريقة بسيطة جدا ولكن أكثر دقة من تلطيخ فقط البنفسجي الكريستال كما هو موضح سابقا 1 مع التكرار على حد سواء جيدة والتكاثر. التصور من البكتيريا GFP-الموسومة على الشرائح الزجاجية من قبل مضان أو أسيوط الليزرالمجهر ocal يسمح لتعزيز النتائج التي تم الحصول عليها مع لوحة الاختبار 24 جيد من قبل الملاحظة المباشرة لهذه الظاهرة.

في سيليكو الشرح من تسلسل نوع من إداراته البرية E. وقد سمح القولونية K12 المرتبطة الأمثل للإشارات النسخي ومتعدية لتصميم واحد الاصطناعية curli OPERON P-RCN إداراته هو موضح في الشكل 3 (تسلسل كامل في البيانات التكميلية). واستخدمت بروتوكول بروتوكول...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon at JoVE.com

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

يوصف تصميم ترميز OPERON الاصطناعية على حد سواء جهاز إفرازية ومونومرات الهيكلية من ألياف curli. الافراط في هذه اميلويدس والبوليمرات تمسكا يسمح مكسب للقياس الانضمام لل<em&gt; E. القولونية</em&gt; حاوية<sup&gt; 1</sup&gt;. وأوضح طرق سهلة لتصور وقياس الالتزام.

الهندسة البكتيريا تمسكا من إنشاء واحدة الاصطناعية Curli OPERON

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

engineering-adherent-bacteria-creating-single-synthetic-curli

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K Views.  Université de Lyon. يوصف تصميم ترميز OPERON الاصطناعية على حد سواء جهاز إفرازية ومونومرات الهيكلية من ألياف curli. الافراط في هذه اميلويدس والبوليمرات تمسكا يسمح مكسب للقياس الانضمام لل E. القولونية حاوية 1. وأوضح طرق سهلة لتصور وقياس الالتزام.

Video: Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

الداخلي للهندسة الرئة

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

الاصطناعية ، ومتعدد الطبقات ، الذاتي تتأرجح صوتي تصنيع الغطاء النموذجي

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

التدرج الكثافة متعدد الطبقات البلمرة (DGMP): تقنية جديدة لإنشاء موضوع متعدد المقصورة، السقالات للهندسة الأنسجة تخصيص

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

كشف البصري<em&gt; E. القولونية</em&gt; البكتيريا عن طريق أجهزة الاستشعار السيليكون Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

هندسة الأنسجة عن طريق الجوهرية الأوعية الدموية في<em&gt; في فيفو</em&gt; غرفة هندسة الأنسجة

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

الاعتراف الجزيئية والهندسة مع البوليمرات الحيوية المحاكاة على واحدة المسورة الكربون الأنابيب النانومترية

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.