Wir danken andere Mitglieder der Lyon INSA-ENS iGEM Team (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon und Valérie Desjardin), unseren Sponsoren für ihre finanzielle Unterstützung (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon und dem Department of Biosciences INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dyé für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Dr. CC Sze für Stamm Geschenk. B. Drogue erhält einen Ph.D. Stipendium Région Rhône-Alpes.

Ein. BioBrick Design und Synthese des Curli Operon <ol><li> Bestimmung der genetischen Organisation und lokalisieren die endogenen transkriptionale und translationale Signale der Curli Gene. Diese Informationen werden in spezialisierten Datenbanken wie RegulonDB a oder b EcoGene gesammelt und ergänzt durch eine sorgfältige Lektüre einschlägiger Publikationen. Datenmanagement und in silico Voranalyse wurden mit Clone Manager-Software c durchgeführt. </li><li> Wählen Sie die relevanten kodierenden Sequenzen. Ein Satz von fünf Genen für zwingend erforderlich Curli Synthese (CSGB und CsgA Codierung Faser Monomere) und Ausfuhr (csgE CSGF und csgG, Codieren des Curlin Sekretion Komplex) wurden ausgewählt, um die synthetischen Operon konstruieren. Entpacken Sie die ausgewählten Sequenzen aus der Datenbank in FASTA-Format. Da der Cluster ist csgGFE Antisense in E. coli-Genom, wandeln diese Sequenz in ihrer reversen Komplement counterpart mit den Clone Manager-Tools Operations&gt; Prozess-Molekül&gt; Invert Molekül. Fügen Sie den csgEFG Reihenfolge hinter csgBA über die Funktion &quot;Ligieren&quot; (Clone&gt; Ligieren). </li><li> Fügen Sie den entsprechenden Promotor. Durch Platzieren der fünf ausgewählten Curli Gene unter Kontrolle des Promotors P rcn werden Curli vorhergesagt in Gegenwart von Kobalt und Nickel über-hergestellt werden. Der RCN-Locus kodiert für ein Effluxpumpe für Ni und Co Entgiftung (RCNA) und seinen zugehörigen Metallo-Regler (RCNR). RCNR steuert die Expression RCNA und eigener Gens als Reaktion auf Ni und Co 19. Der RCN-Sequenz, umfassend RCNR CDS, war die ganze rcn Zwischengenregion plus die 41 ersten Nukleotiden RCNA placedin vor dem csgBAEFG chimärische Sequenz (Abbildung 1, die Sequenz des gesamten Konstrukts als ergänzende Daten zur Verfügung gestellt). </li><li> Optimieren Sie die transkriptionelleSignale. Eine perfekte Ribosomenbindungsstelle (RBS = oder perfekte AAGGAGGTATATA) wurde vor der ersten ATG des csgBA DNA-Sequenz hinzugefügt. Eine zweite perfekte RBS wurde vor dem csgEFG Sequenz hinzugefügt. Endogene RBS für die CSGB und CSGF und csgG Gene wurden konserviert. </li><li> Um iGEM Standards passen, muss das Gerät mit einem Standard BioBrick Präfix und Suffix flankiert werden, die Restriktionsschnittstellen für EcoRI, Pst I (Präfix) und Spe I und Xba I (Suffix). Einfügen der entsprechenden Sequenzen an jedem Ende der Vorrichtung d. </li><li> Eliminieren jedes EcoRI, PstI, SpeI und XbaI-Erkennungsstelle in dem Gerät. Zur weiteren Montage zu erleichtern, kann der BioBrick Teil selbst enthalten keine dieser Restriktionsstellen. In silico Restriktionsanalyse des Gerätes ergab ein Pst I-Stelle in der CsgA Sequenz, ein Pst I-Stelle in der RCNR Folgeund eine Eco RI-Stelle in der csgE Gens. Diese Seiten sind jeweils in Position 80 (Mut1), 1340 (MUT2) und 1830 (MUT3) der Vorrichtung Sequenz (Ergänzungsdaten) befindet und wurden wie folgt durch stille Mutationen verändert. Mut1 Pst I-Stelle CTGCAG in CGTCTG verändert MUT2 Pst I-Stelle CTGCAG in CAGCAG verändert MUT3 Eco RI Website GAATTC in GAATT verändert </li><li> Run durch die Übersetzung Simulation mit dem Clone-Manager-Software (Operation&gt; Process Moleküle&gt; Translate Moleküle). Verwenden der Sequenz-Alignment-Programm BLAST, um die perfekte Homologie zwischen dem Wildtyp Curli Protein und den Proteinen, die von dem synthetischen Operon kodiert verifizieren. </li><li> Bestellen Sie die synthetischen Operon. Kommerzielle Gensynthese Dienstleistungen sind von zahlreichen Unternehmen weltweit zur Verfügung, war unsere Partner GeneCust (Luxemburg). 4 ug des künstlichen Operons (3165 bp) wurden einige Wochen später und erhielt eingefügt in pUC57 (pig2). </li></ol>2. Visualisieren und quantifizieren adhärenten Bakterien auf Polystyrol <ol><li> Füllen Sie jede Vertiefung einer 24-well Polystyrol Platte mit 2 ml M63 Minimalmedium (Glucose 0,2%) und impfen jede Vertiefung mit 106 Zellen einer Übernachtkultur. Bakterien wachsen bei 30 ° C für 18 bis 48 Stunden ohne Schütteln. Jede Säule (4 Wells) eine Modalität. Hinzufügen die richtige Menge an Cobalt (25 bis 100 mM) und Antibiotikum (Ampicillin 100 μg.L -1), wenn nötig. Die drei ersten Zeilen der 24-Well-Platte verwendet werden, um die adhärenten Bakterien durch Mittelung der 3 Wiederholungen zu quantifizieren, wird die letzte Reihe links verwendet werden, um den Biofilm zu visualisieren. </li><li> Für die ersten 3 Zeilen der 24-Well-Platte: für jeden gut erholen Der Überstand mit den planktonischen Zellen. </li><li> Spülen Sie jede Vertiefung mit 1 ml der M63 und Pool die 1 ml Waschpuffer mit dem ersten Überstand in 2,2) erhalten. Dieser Pool wird als Schwimmen Zellen (= S) bezeichnet. </li><li> Recover den Biofilm in 1 ml of M63 durch Schaben und Auf-und Abpipettieren (= B). Vortex 15 sec. Schätzung der Anzahl der oberflächengebundenen und Schwimmen Bakterien aus der optischen Dichte bei 600 nm (OD600), um die Haftung Prozentsatz entsprechend jeder Modalität zu ergeben. </li><li> Der Prozentsatz der Adhärenz wird unter Verwendung der Formel berechnet wird: BX100 / (3xS + B). </li><li> Nur für die letzte Zeile der 24-Well-Platte: verwerfen planktonischen Zellen. </li><li> Spülen mit 1 ml M63 der Biofilm, der auf der Unterseite der Platte entwickelt hatte. </li><li> Trocknen des offenen Platte für 1 h bei 80 ° C. </li><li> Je 100 ul 20% Kristallviolett für 2 min in jeder Vertiefung durch extensive Waschungen mit Wasser, um die oberflächengebundenen Bakterien visualisieren. Drei unabhängige Assays (Platten) müssen durchgeführt werden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. </li></ol> 3. Visualisieren adhärenten Bakterien auf Glas durch Mikroskopie <ol><li> Holen Sie sich einen fluoreszierenden Chassis. Die E. coli-Stamm, der SCC1 e constitutively drückt grün fluoreszierendes Protein (GFP) mit keiner beobachtbaren Unterschied gegenüber der Elternstammes MG1655 20 ist ein geeigneter Wirt für das Plasmid tragenden das synthetische Curli Operons. </li><li> Transformieren SCC1 mit dem pig2 Plasmid (= synthetischer Curli Operon am EcoRI / Pst I-Stelle des pUC57-Plasmid eingefügt), um die Dehnung S23 erhalten. Transformieren SCC1 mit einer Steuerung Plasmid (pUC18) zum Erhalt der Kontrolle Stamm S24 21. </li><li> Über Nacht wachsen Vorkulturen des S23 und der Kontrolle (S24) Stämme bei 30 ° C in M63-Medium mit Glucose (0,2%) und Ampicillin (100 μg.L -1). </li><li> Beimpft 15 ml des gleichen Mediums in Petrischalen mit 100 ul der Vorkulturen. Fügen Sie den entsprechenden Konzentration von Kobalt (dh 25 uM) und vergessen Sie nicht die negative Kontrolle ohne Kobalt. Führen Sie 3 rechteckige Deckglas in jeder Petrischale. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C ohne Schütteln. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas from die Petrischale und sorgfältig abtropfen lassen. Säubern Sie die untere Fläche mit einem kleinen Baumwoll Zeug mit 70 ° Ethanol durch Abwischen jede bakterielle Rückstände imprägniert. Für konfokale Beobachtung, reinigen beide oberen Enden von einigen wenigen Millimetern bis weitere Fixierung des Deckplättchens ermöglichen. </li><li> Adhärenten Bakterien können direkt visualisiert werden aber schnell unter dem Fluoreszenzmikroskop, aber sorgfältig vermieden Trocknen der Probe. </li><li> Für die konfokale Beobachtung, hinterlegen das Deckglas auf einem Objektträger aus Glas mit der Oberseite durch den Biofilm platziert Gesicht bedeckt. Der Biofilm wird dann mit einer größeren Deckglas, das auf dem Glasobjektträger fixiert mit Lack bedeckt ist. Kehren Sie die Setup, so dass der Biofilm wird nun auf der unteren Fläche sein. </li><li> Legen Sie die Setup unter dem konfokalen Laser-Mikroskop. Ein Recht Axioplan2 LSM510 (Zeiss) konfokalen Laser-Mikroskop wurde am Platim Plattform f verwendet. </li><li> Einstellung. Excite GFP bei 488 nm, und sammelt das bakterielle Fluoreszenz im Bereich von 500 bis 600 nm<html> . Verwenden 40x Ölimmersionsobjektiv zum Importieren von Bildern in der Laser Scanning konfokalen Modus. Tasten die gesamte dreidimensionale Strukturen der Biofilme von der festen Oberfläche zu der Grenzfläche mit dem Wachstumsmedium, wobei ein Schritt von 1 um. </li><li> Führen dreidimensionale Projektionen mit Imaris Software (Bitplane, Zürich, Schweiz). Bestimmen Biofilmdicke durch die Analyse der durchschnittlichen statistischen Wert entlang z Längsabschnitte. Quantifizierung von Biofilm Biovolumina aus konfokalen z-Stapel entnommen werden, wie an anderer Stelle beschrieben 22. </li></ol> ein RegulonDB liefert mechanistische Informationen über Operon Organisation und ihre Zerlegung in Transkriptionseinheiten, Promotoren und deren Sigma-Typs, Gene und ihre Ribosomenbindungsstellen, Terminatoren, spezifische Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren, sowie ihre Organisation in regulatorischen Phrasen.et = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp b Die EcoGene Datenbank enthält aktuelle Informationen über die E. coli K-12 Genom-und Proteom-Sequenzen, einschließlich der umfangreichen Gen-Bibliographien. Ein wesentlicher EcoGene Fokus war die Neubewertung der Translationsstart Seiten. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> c <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> d <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> e Gift of Chun Chau Sze, Nan Yang Technischen Universität Singapur. f Platim mikroskopische Plattform UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Kritische Schritte Der wichtigste Schritt in diese synthetischen Biologie Ansatz ist das Gen-Design. Synthetisches Gen-Design hat akribisch zu sein, um ein effizientes System Produktion zu gewährleisten. Die Biodekontamination kerntechnischer Abstrom: zwei Gene, die die Faser und drei Monomeren Proteine ​​kodierenden Genen in ihrer Sekretionssystem beteiligt waren mit einem starken und Metall-induzierbaren Promotor, eine neue Funktionseinheit für eine neuartige Anwendung erstellen zusamme...

Bakterielle Adhärenz gegenüber abiotischen Unterstützung spielt eine wichtige Rolle in Bioremediation, Biokatalyse oder mikrobielle Brennstoffzellen. Bioremediation Prozesse verwenden, die Kapazitäten von Mikroorganismen an organischen Substanzen zersetzen, oder um die Metallverteilung (Immobilisierung, Verflüchtigung) oder Speziation ändern. Diese positiven Aktivitäten sind in aquatischen und terrestrischen Ökosysteme beobachtet, sondern auch in den künstlichen Systeme entwickelt, um verschmutztes Wasser von Industrie-und Hausmüll zu behandeln. Die Intensität und die Qualität der mikrobiellen Aktivität auf die physikalisch-chemische Faktoren abhängen, sondern auch von der Lebensweise der Mikroorganismen (frei schwebenden oder eingebettet in Biofilm). Die Biofilmbildung ist mit einem Stoffwechsel fördern Resistenz gegen Biozide durch diverse Mechanismen verbunden. Dieses Phänomen wird daher in den meisten Prozessen Bioremediation gefördert werden. Außerdem hat Engineering Escherichia coli-Zellen, um die Biofilmbildung steuern erfolgreich angewendetimmobilisieren whole-cell-Sensoren auf Biochips 2-3. Adaption von Mikroorganismen zu hohe Konzentration an Metallen erfolgt über verschiedene Mechanismen, wie Adsorption an Komponenten der extrazellulären Matrix, die Aktivierung von Effluxpumpe oder spezifische Träger, die das Metall in die Zelle zu konzentrieren. Die Förderung dieser bakteriellen Aktivitäten über Gentechnik ermöglicht eine effiziente und billige Behandlung von Metall-Verschmutzung im Labormaßstab, insbesondere im Falle hoch giftiger Metalle in schwachen Menge von Raghu et al. 2008 4. Bakterielle Sanierung stellt in diesem Fall eine wettbewerbsfähige und kostensparende Methode im Vergleich zu den klassischen chemischen Prozessen unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen. Die Autoren beschreiben eine E. coli genetisch Chassis für Kobalt Aufnahme und Retention zuerst durch Ausschlagen der Effluxpumpe kodierenden Gen RCNA und dann durch Transformation mit einem Plasmid mit mehreren Kopien ermöglicht eine Überproduktion von entworfenTransporter mit bevorzugte Aufnahme für Cobalt. solcher Stamm erscheint als Alternative zu Ionenaustauscherharzen zu behandeln radioaktives Abwasser, sondern ein Schlüssel ungelöstes Problem ist die Rückgewinnung von kontaminierten Bakterien am Ende des Prozesses 4. Das Ziel unserer Arbeit war es daher, Ingenieur eine speziell angefertigte Belastung in der Lage, gegenüber abiotischen Trägern wie Glas oder Kunststoff haften. Unter der Gesamtheit der Adhäsine und Anhänger Fimbrien in Gram-Bakterien identifiziert, entschieden wir uns für ein System, curli Produktion zu entwerfen. Curli sind dünn (2-5 nm Durchmesser) und hoch aggregativen Amyloidfasern, die ragen aus dem E. coli und Salmonella Oberfläche als eine nicht-kristalline als auch unlösliche Matrix 5-7. Curli sind auch in der Besiedlung des abiotischen Oberflächen und die Entwicklung von Biofilmen 8 beteiligt. Curli wurden kürzlich gezeigt, binden Quecksilber-Ionen 9. Amyloide sind in der Tat bekannt, besitzen eine hoheAffinität für Metallionen wie Cu 2 +, Zn 2 + und Fe 3 + 10. Diese Eigenschaft könnte die weitere Verbesserung der Dekontamination von Metall verunreinigte Abwässer. Die CSG-Cluster ist verantwortlich für die Produktion von curli Fasern und besteht aus zwei divergent transkribierte Operons (Abbildung 1), gebildet. Die CSGB, CsgA und CSGC Gene bilden die Sinne Operon codiert die beiden curli Untereinheiten, CsgA und CSGB. CSGC scheint zu sein, beteiligt Redox-Aktivität innerhalb der curli Biogenese und zu beeinflussen CsgG Poren Verhalten 11. Allerdings zeigt die Abwesenheit von CSGC in der Mehrzahl der Curli produzierenden Bakterien, dass das entsprechende Protein nur einen sekundären Maß an Kontrolle über die Curli Biogenese bereitstellt. Um das System zu vereinfachen, haben wir ausgewählt, um mit einer minimalen Anzahl von Genen zu arbeiten. Die csgDEFG operonencodes Proteine ​​essentiell bei der Regulierung und Transportvon CsgA und CSGB zur Zelloberfläche. CsgD ist ein Transkriptionsaktivator der csgBAC Operon und spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Biofilmbildung durch Steuern der Erzeugung von Fimbrien Curli und andere Komponenten, wie Biofilm Cellulose 12 und durch die Hemmung der Produktion Flagellum 13. CsgE, CSGF und CsgG darstellen Curli-spezifischer sekretorischer Vorrichtung in der äußeren Membran, durch die der großen Untereinheit-Protein Curli CsgA als lösliches Protein sezerniert wird. Die Polymerisation von CsgA hängt in vivo an der membrangebundenen Proteins CSGB Nukleator (besprochen in 14). Komplexen Regulationsmechanismen, die mehrere Zweikomponentensysteme erwiesen sich Curli Genexpression 15-16 steuern. Diese komplexen Vorschriften erlauben Bakterien dicke Biofilme über die curli Produktion als Reaktion auf Umweltreize zu bilden, sind aber schwer zu für industrielle Anwendungen zu steuern. Um die Erholung der met erleichternal-gestopft Bakterien während eines industriellen Prozesses, bakterielle Fixierung auf einem festen Träger in der Tat muss von gut definierten Parameter (n) gesteuert werden. Die adhärenten Eigenschaften Curli sind, ihre Natur Amyloid 17 verbunden und könnten zur Bioremediation Prozesse zu verbessern, sondern ein einfacher und leicht zu kontrollierenden Gerät geschaffen werden. Von diesen 7 Gene 18, einen Satz von 5 absolut Gene für Curli Synthese (CSGB und CsgA Codierung Faser Monomere) und Ausfuhr (csgE CSGF und csgG, Codieren des Curli Sekretion Komplex) benötigt wurden ausgewählt, um die synthetischen Operon konstruieren. Um das &quot;natürliche&quot; Regulierung der curli, ein synthetisches Operon aus diesen 5 csg Gene unter der Kontrolle eines starken und Kobalt-overinducible Promotor (Abbildung 2) wurde entworfen und synthetisiert entkommen. Der Schritt-für-Schritt-Analyse des Curli kodierende Region und die Konstruktionsverfahren für eine funktionelle synthetische Operons beschrieben. Zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung bakterielle Adhärenz an Polystyrol und Glas werden erläutert.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> pig2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (pMB1 ori, 2710 bp) mit einem 3165 bp EcoRI / PstI-Fragment, welches die synthetische P rcn - csgBAEFG Operon; Amp r </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Multicopy Plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Amp r </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP-markierten MG1655, ein Geschenk von CC Sze) / pig2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl 2 </td><td> Sigma </td><td></td><td> 0,1 M Stammlösung bei Raumtemperatur gehalten </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> 24-Well-Platte </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> Polystyrol 24-Well-Platten </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

Die hier beschriebene Methode besteht in der Neugestaltung E. coli Hafteigenschaften durch Zusammensetzen der Mindestanzahl von Curli Gene unter der Kontrolle eines starken und Metall-overinducible Promotor und bei der Visualisierung und Quantifizierung der erhaltenen Verstärkung der bakteriellen Adhärenz. Diese Methode gilt entsprechende technische Prinzipien der Abstraktion und Standardisierung der synthetischen Biologie, und die Ergebnisse in der BBa_K540000 BioBrick (Best neuen BioBrick Gerät entwickelt, iGEM 2011). Der erste Schritt besteht in der Konstruktion des synthetischen Operon gewidmeten Curli Überproduktion in Reaktion auf Metall, und daher bei der Erhöhung der Adhärenz Fähigkeiten des Wildtypstamms. Die ursprüngliche curli Operon wurde in silico modifiziert, um Transkription und Translation-Signale zu optimieren und die Flucht der &quot;natürliche&quot; Regulierung der curli. Dieser Ansatz erlaubt es, mit Erfolg testen unser gegenwärtiges Verständnis von curli Produktion. Moreover, Vereinfachung des Curli Regulierung durch Schalten des endogenen Komplexes Promotor (mehr als 10 transkriptionellen Regulatoren identifiziert) zu einem einfachen Metall-regulierten Promotor macht Adhärenz viel einfacher zu steuern. Der zweite Schritt beinhaltet qualitative und quantitative Bewertung der Einhaltung Fähigkeiten durch Umsetzung von einfachen Methoden. Diese Verfahren sind für eine große Palette von anhaftenden Bakterien unabhängig von biologischen Strukturen im Biofilm-Bildung beteiligt. Adherence Test im 24-well Polystyrol-Platten bietet eine schnelle vorläufige Visualisierung des bakteriellen Biofilms nach Kristallviolettfärbung. Dieser qualitative Test kann durch die Quantifizierung der Prozentsatz der Einhaltung geschärft werden. Ein solches Verfahren ist sehr einfach, aber genauer als nur Kristallviolettfärbung wie vorher 1 mit sowohl einer guten Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit beschrieben. Visualisierung von GFP-markierten Bakterien auf Glasträger durch Fluoreszenz-oder Laser-confocal Mikroskopie ermöglicht, um die Ergebnisse mit dem 24-Well-Platte-Test durch direkte Beobachtung des Phänomens erhalten stärken.

In silico Annotation des Wildtyp csg Sequenz von E. coli K12 mit der Optimierung der Transkription und Translation Signale zugeordnet erlaubt hat zu entwerfen das einzige synthetische curli Operon P rcn-csg in Abbildung 3 (ganze Folge in ergänzende Daten) angezeigt. Protokoll 2 und Protokoll 3 wurden verwendet, um visualisieren und quantifizieren Haftung mit curli Produktion verbunden. Mit Kristallviolettfärbung auf 24-Well Polystyrol-Platten (protocole 2) Biofilmbi...

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Das Design eines synthetischen Operon kodiert sowohl den sekretorischen Apparat und den strukturellen Monomere Curli Fasern beschrieben. Überproduktion dieser Amyloide und Anhänger Polymere ermöglicht einen messbaren Gewinn der Einhaltung der<em&gt; E. coli</em&gt; Chassis<sup&gt; 1</sup&gt;. Einfache Möglichkeiten zur Visualisierung und Quantifizierung Einhaltung erläutert.

Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K Aufrufe.  Université de Lyon. Das Design eines synthetischen Operon kodiert sowohl den sekretorischen Apparat und den strukturellen Monomere Curli Fasern beschrieben. Überproduktion dieser Amyloide und Anhänger Polymere ermöglicht einen messbaren Gewinn der Einhaltung der E. coli Chassis 1. Einfache Möglichkeiten zur Visualisierung und Quantifizierung Einhaltung erläutert.

Serie: Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Vorgehensweise für Lung Technik

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Forschung

Biotechnik

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

Synthetische Multi-Layer-, Selbst-Oszillierende Stimmlippen Modell Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Density Gradient Multilayered Polymerisation (DGMP): A Novel Technique für das Erstellen von Multi-Fach, Anpassbare Scaffolds für das Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...