El trabajo descrito fue apoyada por el Centro de Cornell sobre el microambiente y la metástasis a través Número U54CA143876 Premio del Instituto Nacional del Cáncer. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Cáncer o el Instituto Nacional de Salud. Este trabajo fue financiado, además, en parte por la National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).

El protocolo siguiente es para la producción de un dispositivo microtubo clave. 1. Preparación de la solución de nanotubos de halloysita <ol><li> Baño de ultrasonidos (10-13 W (RMS)) 250 l solución de nanotubos de halloysita (6,6% en peso en agua) 30 seg. Solución de enfriamiento con agua fría y ultrasonidos repetir una vez. Enfriar de nuevo. </li><li> Dibujar solución sonicado en una jeringa, colocar un filtro de 0,45 micras jeringa, y solución de filtro en el tubo de microcentrífuga limpio. Vortex la solución ocasionalmente para mantener la homogeneidad. </li></ol> 2. El recubrimiento de la superficie interior con microtubos de nanotubos de halloysita <ol><li> Obtener 50 cm de sección larga de la Micro-Renathane microtubing (300 m de diámetro interior, 35,3 l volumen interior). Corte un extremo del microtubo en una diagonal y se insertan en un pedazo pequeño adaptador IDEX. Insertar la aguja de una jeringa 3/10 cc 29G en el otro extremo del microtubo. </li><li> Para limpiar el microtubo, colocar el extremo abierto del microtubo (el extremocon el adaptador) en etanol al 70% y un empate ~ 50 l de etanol en la jeringa para llenar microtubo. </li><li> Lavar el etanol a partir del microtubo dibujando un volumen suficiente de agua destilada en la jeringa. </li><li> Retire la jeringa del microtubo, vaciar la jeringa, y luego vuelva a colocar en el microtubo. </li><li> Preparar una solución de 0,02% w / v de poli-L lisina en agua. Extraer 50 l en el microtubo y dejar reposar durante 5 min a temperatura ambiente (TA). </li><li> Dibuja 100 l solución filtrada de nanotubos en el microtubo y dejar incubar durante 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Dibuja de agua de 100 l por el microtubo para enjuagar la solución de nanotubos. Permitir microtubo recubierto para sentarse, lleno de agua, durante la noche a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Preparación de Microtubos para el aislamiento de la célula <ol><li> Preparar una solución de 10 mg / ml de proteínas G en fosfato 1X Dulbecco (PBS, pH 7,0 a 7,2). Extraer 50 l de PBS a través microtubo y luego dibujar 50 l dela solución de proteína-G y permitir a incubar durante 1,5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Prepare una solución que contenía 5 mg / mL de E-selectina-IgG y 50 ug / ml de anticuerpos (anti-EpCAM para las muestras de cáncer de la mayoría de los anti-PSMA de muestras de cáncer de la próstata) en PBS. Extraer 50 L de la E-selectina y solución de anticuerpos en el microtubo y dejar incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Adhesión celular no específica se bloquearon con proteínas de la leche al 5%. Preparar una solución de 5% (w / v) de proteína de la leche en PBS. Dibujar 50 l solución proteína de la leche en el microtubo y permitir a incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Extraer 50 l de PBS en el tubo y dejar a temperatura ambiente hasta que las muestras de sangre o de la capa leucocitaria están listos para su procesamiento. </li><li> 10 minutos antes de usar el microtubo para el aislamiento, dibujar 50 l de PBS que ha sido saturada con Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) para activar las moléculas de selectina. </li></ol> 4. Preparación de muestras para el aislamiento de células <ol><li> Dibujar o obtener 10 ml de sangre del paciente en heparinizadatubo. </li><li> Colocar 10 ml de Ficoll-Paque solución de aislamiento de linfocitos en 50 ml tubo de centrífuga. Suavemente la capa 10 ml de sangre entera en la parte superior de Ficoll para que no se mezcle la sangre y Ficoll. </li><li> Se centrifuga a 2000x g durante 15 min a 4 ° C con una desaceleración mínima. </li><li> Retire la capa de la capa leucocitaria y el lugar en el nuevo tubo. </li><li> Lavado de la capa leucocitaria con PBS (centrifuga a 230x g durante 10 minutos, descartar el sobrenadante). </li><li> Resuspender las células con 1 ml de solución amortiguadora de lisis de glóbulos rojos y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente para lisar los eritrocitos. </li><li> Añadir 10 ml de PBS, mezclar suavemente, y se centrifuga a 230x g durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado con cuidado en 3 a 4 ml de PBS +. </li></ol> 5. Celda de aislamiento <ol><li> Conecte un extremo del microtubo funcionalizado a una jeringa de 5 ml con adaptadores de IDEX. </li><li> Insertar la jeringa en una bomba de jeringa. </li><li> Sumergir el extremo abierto del microtubo funcionalizado en la célula suspension. </li><li> Procesar la suspensión celular a través de la microtubo de 1 a 4 ml / h. </li><li> Transferir el extremo abierto del microtubo a un tubo que contenía PBS + y dibujar 300 L + PBS en jeringa a 0,016 ml / min para eliminar las células no unido y débilmente ligados desde el microtubo. </li><li> Coloque el extremo abierto del microtubo en un tubo limpio. Desconecte la jeringa del microtubo y adjuntar una jeringa precargada con Accutase. Suavemente perfundir Accutase suficiente en el microtubo para llenar (~ 50 l) y se deja incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Coloque una jeringa precargada con 1 ml de medio de crecimiento (79% de RPMI, FBS al 20%, 1% de penicilina estreptomicina) y perfundir en microtubo, recogiendo efluente en cultivo de tejidos tratados bien placa. </li><li> Las células de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 bajo condiciones de humedad. </li></ol> 6. Los resultados representativos El objetivo de esta técnica consiste en aislar células viables de cáncer de la sangre de pacientes con cáncer. Existen varios métodos para identificar las células cancerosas en la cultura, la verificación necesaria para el éxito del dispositivo. Hemos elegido para teñir las células en cultivo con anticuerpos contra restos epiteliales tales como EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial) o PSMA (antígeno prostático específico de membrana), además de DAPI para identificar los núcleos de células intactas (Fig. 2 y 3). El número de células cancerosas capturados utilizando esta técnica es necesariamente una función del número de CTC en la muestra de partida, y la variabilidad del paciente puede ser alto. En el procesamiento de las muestras tomadas de pacientes diagnosticados con cáncer en estadio IV, que habitualmente capturan entre 100 y 500 células cancerosas por el tubo de sangre, en el grado de pureza&gt; 50%. Inmediatamente después de aislamiento, un mayor número de leucocitos contaminantes pueden estar presentes. Sin embargo, estos números se agota después de incubación en medio de cultivo durante un máximo de 5 días. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Esquema de microtubo funcionalizado para el aislamiento de la CTC, mostrando selectina mediada por laminación seguido mediada por anticuerpos adhesión estática. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Figura 2. Los datos representativos de aislamiento CTC de muestras de sangre extraídas de un paciente con cáncer de mama y un paciente de cáncer de pulmón. El número de células viables positivamente identificados como CTC basado en la tinción EpCAM está representado por las barras de sólidos y se refieren a la ordenada izquierda y el porcentaje de células que fueron identificadas como CTC en comparación con el número total de células capturadas está representado por las barras abiertas y medido en la ordenada derecha. Los resultados son los siguientes cinco días de cultivo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografías representativas de los donantes separados (A y B) de CTC en la cultura 5 días posteriores a isolatien una muestra de cáncer de la sangre del paciente. Las células fueron teñidas con fluorescencia para EpCAM con AlexaFluor 488 (verde) y 4 &#39;,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para visualizar el núcleo (azul).

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	<li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+for+the+capture+and+manipulation+of+circulating+tumor+cells.">Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood.">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells.">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li><li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells:+a+new+model+for+metastasis.">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+Building+a+framework.">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li><li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow.">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li><li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis.">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li><li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade:+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation.">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 .</li><li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip.">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li></ol>

MRK es asesor científico de la CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

A menudo es el caso de que los primeros pasos en el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos del cáncer utilizan líneas celulares de cáncer, que se parecen a las células cancerosas cuestionable primarios todavía permanecen en uso debido a su facilidad de uso en el laboratorio. La investigación sobre el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer podría ser más rápida si las células cancerosas humanas primarias se utilizaron a principios de la investigación novela. CTC son el tipo más fácilmente accesible de células cancerosas, debido a su presencia en la sangre y la facilidad de una extracción de sangre estándar. Además, las células tumorales circulantes representan un paso necesario en el proceso de metástasis 5,6, por lo que su importancia para la enfermedad y de utilidad para la orientación de nuevos fármacos es clara. Aislamiento de CTC de la sangre in vitro se complica por sus bajas concentraciones: del orden de un millón de leucocitos por uno o por billón de eritrocitos 7. La mayoría de los métodos actuales para la detección de CTC en la sangre, incluyendo el de la célula única técnica aprobada por la FDA<html> Buscar (Veridex), dañar o destruir las células en el proceso de detección, lo que impide su uso más allá de la enumeración. El método descrito anteriormente no pone en peligro la viabilidad celular y por lo tanto abre la puerta a futuras investigaciones clínicas sobre el cáncer. A medida que la recuperación de células intactas es el objetivo de esta técnica, es imperativo que las células se maneja con cuidado, especialmente durante las etapas de separación de sangre. Hay un número de parámetros sintonizables en este sistema que pudiera ser alterada para lograr un mejor rendimiento dependiendo de las características críticas tales como el tipo de cáncer. En los pasos descritos anteriormente, se había optado por utilizar EpCAM como un anticuerpo específico de CTC para todos los tipos de cáncer, excepto cuando se procesan las muestras de cáncer de próstata, en el que lucha contra la PSMA se utilizó. Sustituciones adicionales de cáncer de anticuerpos específicos ciertamente puede ser utilizado para mejorar el rendimiento de los pacientes individuales. Además, las concentraciones de selectina y el anticuerpo se puede alterar para mejorar la captura de 8. &quot;&gt; Una característica esencial del dispositivo es la incorporación de E-selectina moléculas sobre la superficie. E-selectina se expresa normalmente en la superficie luminal de las células endoteliales y la función de reclutar rápidas leucocitos se desplazan a sitios de inflamación. Leucocitos que fluyen a enlazar de forma transitoria moléculas de selectina, dando como resultado una más lenta, el comportamiento rodadura que facilita la unión más lenta y más fuerte de la célula al endotelio por integrinas. evidencia experimental convincente que hace que existe el caso que CTC puede extravasación por un mecanismo similar 9,10. La inclusión de selectina también permite que el dispositivo para operar a velocidades de flujo mayores, las tasas que de otro modo prevenir las células de la unión a anticuerpos 11. Así, nuestro dispositivo fisiológicamente imita una vénula para capturar biomimetically fluye CTC sin causar daño celular. Rendimiento del dispositivo mejorado se puede atribuir a la adición de la capa de nanotubos halloysita a la superficie luminaldel dispositivo. Estudios anteriores han demostrado que hay tres componentes principales de la capa de nanotubos que permite una funcionalidad mejorada. En primer lugar, el revestimiento nanotubo proporciona mayor área superficial, lo que permite una mayor deposición de proteínas en la superficie 4. En segundo lugar, en la realización de microscopía de fuerza atómica en el recubrimiento de nanotubos se ha determinado que los nanotubos individuales sobresalen de la superficie en el flujo. Esto permite que las moléculas de selectina para ser presentado tanto como una micra por encima de la superficie para que las células pueden ser capturados y reclutados a la superficie anterior en su trayectoria a través del tubo 4. Por último, el recubrimiento de nanotubos halloysita es capaz de prevenir la adhesión de leucocitos y la difusión en la superficie, lo que permite una reducción del número de leucocitos capturados junto con el CTC y por tanto, mayores subsiguientes purezas CTC 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 300 tubos de ID de mensajería unificada </td><td> Braintree Científico </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Aumentar la tubería para la conexión a la jeringa </td><td> IDEX de Salud y Ciencia </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> Jeringa de 5 ml para la bomba </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Conector pequeño a un tubo grande </td><td> IDEX de Salud y Ciencia </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Conector gran tubo a la jeringa </td><td> IDEX de Salud y Ciencia </td><td> F-120 y P 659- </td></tr><tr><td> Jeringa para microtubo (jeringa de insulina U-100 3/10cc 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Plus </td><td> GE Healthcare Bio-Sciences AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1.000 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Proteína G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Anticuerpo Humano EpCAM/TROP-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA anticuerpos (GCP-04) </td><td> abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> Placas de 96 pocillos (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Bloqueador de Grado no leche en polvo, 300 g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Los nanotubos de halloysita </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Carbonato de Calcio, 5g </td><td> Aldrich Química </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc ug Quimera, 100 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> Medio RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poli-L lisina 0,1% w / v en agua </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> De Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Modelo 100 </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> Atlanta bioquímicos </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> La penicilina estreptomicina </td><td> Sigma vida Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

rapid isolation of viable circulating tumor cells from patient blood samples

Las células tumorales circulantes (CTC) son células que difunden de un tumor primario en todo el sistema circulatorio y que en última instancia, pueden formar tumores secundarios en sitios distantes. CTC cuenta se puede utilizar para seguir la progresión de la enfermedad sobre la base de la correlación entre la concentración de CTC en la sangre y la gravedad de la enfermedad 1. Como una herramienta de tratamiento, CTC podría ser estudiado en el laboratorio para desarrollar terapias personalizadas. Para este fin, el aislamiento CTC debe causar ningún daño celular, y la contaminación por otros tipos de células, particularmente leucocitos, debe evitarse tanto como sea posible 2. Muchas de las técnicas actuales, incluida la única aprobada por la FDA para la enumeración de dispositivos CTC, destruir CTC como parte del proceso de aislamiento (para más información ver ref. 2). Un dispositivo de microfluidos para capturar viables CTC se describe, que consta de una superficie funcionalizada con E-selectina glicoproteína además de anticuerpos contra marcadores epiteliales 3. Para mejorar el rendimiento del dispositivoMance una capa de nanopartículas se ha aplicado consiste en nanotubos de halloysita, una de nanopartículas de arcilla aluminosilicato cosechado 4. Las moléculas de E-selectina proporcionar un medio para capturar movimiento rápido CTC que se bombea a través del dispositivo, dando una ventaja sobre los dispositivos de microfluidos alternativos en los que los tiempos de procesamiento ya son necesarios para proporcionar células diana con el tiempo suficiente para interactuar con una superficie. Los anticuerpos contra objetivos epiteliales proporcionar CTC-especificidad para el dispositivo, así como proporcionar un parámetro fácilmente ajustable para sintonizar aislamiento. Por último, el recubrimiento de nanotubos de halloysita permite el aislamiento significativamente mayor en comparación con otras técnicas, ayudando a capturar rápidamente las células en movimiento, proporcionando una mayor superficie para la adsorción de proteínas y leucocitos contaminantes repeler 3,4. Este dispositivo se produce por una técnica sencilla utilizando fuera de la plataforma materiales, y ha sido utilizado con éxito para capturar las células cancerosas de la sangre de metastásicopacientes con cáncer. Las células capturadas se mantienen durante un máximo de 15 días de cultivo después del aislamiento, y estas muestras suelen consistir en&gt; 50% de células viables de cáncer primario de cada paciente. Este dispositivo ha sido utilizado para capturar viables CTC tanto de sangre diluida conjunto y muestras de la capa leucocitaria. En última instancia, se presenta una técnica con la funcionalidad en un entorno clínico para desarrollar terapias personalizadas contra el cáncer.

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Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Células tumorales circulantes son aislados de la sangre de pacientes con cáncer sin causar daño celular. El aislamiento de las células tumorales se logra usando una superficie bimolecular de E-selectina además de anticuerpos contra marcadores epiteliales. Un recubrimiento de nanotubos específicamente promueve la adhesión de las células cancerosas que resulta en purezas de captura altas.

Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

26.5K vistas.  Cornell University. Células tumorales circulantes son aislados de la sangre de pacientes con cáncer sin causar daño celular. El aislamiento de las células tumorales se logra usando una superficie bimolecular de E-selectina además de anticuerpos contra marcadores epiteliales. Un recubrimiento de nanotubos específicamente promueve la adhesión de las células cancerosas que resulta en purezas de captura altas.

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Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

La detección y aislamiento de las células de melanoma circulantes mediante Flujometría fotoacústica

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Investigación

Bioingeniería

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Ácido hialurónico basado en hidrogeles de 3 dimensiones cultura de células de Glioblastoma derivados del paciente

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

Fabricación fantasma de alcohol polivinílico específica del paciente con ultrasonido y contraste de rayos X para la planificación de la cirugía de tumor cerebral

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Tejido conectivo de ingeniería humana derivado de fibroblastos para aplicaciones de detección

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.