وأيد العمل الذي وصفه مركز كورنيل في المكروية والإنبثاث من خلال عدد جائزة U54CA143876 من المعهد الوطني للسرطان. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة. وقد تم تمويل هذا العمل بالإضافة إلى ذلك في جزء منه من قبل مؤسسة العلوم الوطنية زمالة بحوث دراسات عليا (ADH).

البروتوكول التالي لإنتاج جهاز microtube واحد. 1. إعداد الحل الأنابيب الجزيئية Halloysite <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن (10-13 واط (RMS)) 250 أنابيب halloysite ميكرولتر حل (6.6٪ من وزن في الماء) و 30 ثانية. بارد حل مع الماء البارد وصوتنة تكرار مرة واحدة. تبريد مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم حل sonicated إلى حقنة، ونعلق حقنة 0.45 ميكرون مرشح ومرشح حل في أنبوب microfuge نظيفة. دوامة الحل في بعض الأحيان للحفاظ على التجانس. </li></ol> 2. طلاء السطوح الداخلية Microtube مع أنابيب Halloysite <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على 50 سم مقطع طويل من الصغرى، Renathane microtubing (300 قطرها ميكرون الداخلية، 35،3 حجم الداخلية ميكرولتر). خفض واحدة من نهاية microtube في قطر، وإدراجها في قطعة صغيرة محول آيدكس. إدراج إبرة حقنة من 1 29G 3/10 سم في الطرف الآخر من microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتنظيف microtube، ووضع نهاية مفتوحة من microtube (نهايةمع محول) في الايثانول 70٪ وتعادل ~ 50 ميكرولتر الايثانول في حقنة لملء microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الايثانول من microtube عن طريق رسم حجم سخية من الماء المقطر إلى الحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل المحقنة من microtube، تفريغ حقنة، ثم أعد للmicrotube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل من 0.02٪ W / V-L يسين بولي في الماء. تجتذب 50 ميكرولتر في microtube والسماح للجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم 100 ميكرولتر حل أنابيب المصفاة في microtube والسماح لاحتضان لمدة 3 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم 100 ميكرولتر المياه من خلال microtube لشطف خارج الحل أنابيب. تسمح microtube المغلفة للجلوس، مملوءة بالماء، بين عشية وضحاها في RT. </li></ol> 3. إعداد Microtubes لعزل الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزنة يعد حل من 10 ميكروغرام / مل G بروتين في الفوسفات 1X Dulbecco في المياه المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7،0-7،2). تجتذب 50 ميكرولتر من خلال برنامج تلفزيوني microtube ثم ارسم ميكرولتر من 50الحل بروتين-G، والسماح لاحتضان لمدة 1.5 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول يحتوي على 5 ميكروغرام / مل E-selectin-IgG و 50 ميكروغرام / مل الأجسام المضادة (المضادة للEpCAM لعينات معظم السرطان، ومكافحة PSMA لعينات من سرطان البروستاتا) في برنامج تلفزيوني. تجتذب 50 ميكرولتر من selectin-E و حل الأجسام المضادة في microtube والسماح لاحتضان لمدة 2 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم منع التصاق الخلايا غير محدد مع بروتين الحليب بنسبة 5٪. يعد حل من 5٪ (W / V) بروتين الحليب في برنامج تلفزيوني. تجتذب 50 بروتين الحليب ميكرولتر حل في microtube والسماح لاحتضان لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجتذب 50 PBS ميكرولتر في أنبوب وتترك على RT حتى عينات من الدم أو معطف بوفي على استعداد للمعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 دقيقة قبل لاستخدام microtube للعزلة، تجتذب 50 PBS ميكرولتر التي تم مشبعة كا 2 + (&quot;برنامج تلفزيوني +&quot;) لتنشيط الجزيئات selectin. </li></ol> 4. إعداد العينات لعزل الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم أو الحصول على 10 مل من الدم من المريض إلى heparinizedأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 10 مل Ficoll-Paque حل العزلة اللمفاويات إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي. بلطف طبقة من الدم الكامل 10 مل على رأس Ficoll حتى لا تخلط الدم وFicoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في ز 2000x لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية مع تباطؤ الحد الأدنى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طبقة معطف بافي والمكان في أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الغلالة الشهباء مع برنامج تلفزيوني (الطرد المركزي في ز 230x لمدة 10 دقيقة، تجاهل طاف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend بلطف خلايا مع 1 مل العازلة تحلل RBC واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT إلى ليز كريات الدم الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل PBS، مزيج بلطف، وأجهزة الطرد المركزي في ز 230x لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وresuspend بلطف بيليه في برنامج تلفزيوني مل 3 إلى 4 +. </li></ol> 5. زنزانة انفرادية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعلق واحدة من نهاية microtube functionalized إلى حقنة 5 مل باستخدام محولات آيدكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الحقنة على مضخة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغرق في النهاية المفتوحة للmicrotube functionalized في suspensio الخليةن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة تعليق الخلية من خلال microtube في 1-4 مل / ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل نهاية مفتوحة للmicrotube على أنبوب يحتوي على برنامج تلفزيوني ورسم + 300 + PBS ميكرولتر إلى حقنة في 0.016 مل / دقيقة لإزالة غير منضم والخلايا ملزمة فضفاضة من microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع نهاية مفتوحة للmicrotube في أنبوب نظيف. قطع المحقنة من microtube ونعلق حقنة مملوءة مسبقا مع Accutase. يروي بلطف Accutase بما فيه الكفاية في microtube لملء (~ 50 ميكرولتر) والسماح لاحتضان في RT لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعلق حقنة مملوءة مسبقا مع 1 مل من وسائط النمو (79٪ RPMI، FBS 20٪، 1٪ البنسلين ستربتومايسين)، ويروي في microtube، وجمع مياه الصرف الصحي المعالجة في زراعة الأنسجة بشكل جيد لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا ثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في ظل ظروف مرطب. </li></ol> 6. ممثل النتائج الهدف من هذه التقنية هو عزل الخلايا السرطانية قابلة للحياة من الدم لمرضى السرطان. توجد عدة أساليب للتعرف على الخلايا السرطانية في الثقافة؛ التحقق اللازمة للنجاح الجهاز. اخترنا لصبغ الخلايا في الثقافة مع الأجسام المضادة ضد الأنصاف الظهارية مثل EpCAM (الظهارية جزيء التصاق الخليوي) أو PSMA (مستضد البروستات غشاء محدد)، بالإضافة إلى دابي لتحديد سليمة نوى الخلايا (الشكل رقم 2 و 3). القبض على عدد من الخلايا السرطانية باستخدام هذه التقنية هو بالضرورة وظيفة من عدد من التدرجي في العينة ابتداء، وتقلب المريض يمكن أن تكون عالية. في تجهيز العينات المأخوذة من المرضى الذين شخصت مع سرطان المرحلة الرابعة، ونحن قبض على الخلايا السرطانية بشكل روتيني بين 100 و 500 في أنبوب من الدم، في درجات نقاء&gt; 50٪. فورا بعد العزلة، قد أعداد أكبر من الكريات البيض تلويث تكون موجودة. ولكن أن تستنفد هذه الأرقام حضانة التالية في ثقافة المتوسط ​​لمدة تصل إلى 5 أيام. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <stرونغ&gt; الشكل 1. تخطيطي من microtube functionalized لعزل لجنة مكافحة الإرهاب، والتي تبين selectin بوساطة المتداول تليها الأضداد بوساطة الالتصاق ثابت. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> الشكل 2. بيانات الممثل من العزلة لجنة مكافحة الإرهاب من عينات الدم المأخوذة من الثدي المصاب بالسرطان والمريض بسرطان الرئة. ويمثل عدد الخلايا التي تم تحديدها بصورة إيجابية قابلة للحياة كما جنة مكافحة الإرهاب تقوم على تلطيخ EpCAM بواسطة قضبان الصلب وتتعلق الإحداثي اليسار والنسبة المئوية للخلايا التي حددت على أنها لجنة مكافحة الإرهاب بالمقارنة مع العدد الكلي للخلايا استولت تمثله الحانات مفتوحة و تقاس على الإحداثي الصحيح. النتائج وبعد خمسة أيام في الثقافة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> الميكروسكوب الممثل الشكل 3. من الجهات المانحة منفصلة (A و B) من لجنة مكافحة الإرهاب في الثقافة 5 أيام لاحقة لisolatiعلى عينة من دم المريض بالسرطان. تم صبغ fluorescently الخلايا لEpCAM مع AlexaFluor 488 (أخضر) و 4 &#39;،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لتصور نواة (الأزرق).

<ol>
	<li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+for+the+capture+and+manipulation+of+circulating+tumor+cells.">Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood.">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells.">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li><li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells:+a+new+model+for+metastasis.">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+Building+a+framework.">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li><li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow.">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li><li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis.">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li><li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade:+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation.">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 .</li><li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip.">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li></ol>

MRK هو المستشار العلمي للCellTraffix، وشركة (روتشستر، نيويورك).

هذا هو الحال غالبا أن الخطوات الأولى في اكتشاف علاجات جديدة للسرطان الاستفادة من خطوط الخلايا السرطانية، والتي تتحمل تشابه مشكوك فيه إلى الخلايا السرطانية الأولية لا تزال حتى الآن في استخدامها نظرا لسهولة استخدامها في المختبر. وسيتم التعجيل البحث في تطوير علاجات جديدة للسرطان إذا استخدمت الابتدائي الخلايا السرطانية البشرية في وقت مبكر في مجال البحوث رواية. لجنة مكافحة الإرهاب هي أكثر أنواع يمكن الوصول إليها بسهولة من الخلايا السرطانية، وذلك بسبب وجودها في الدم وسهولة بالتعادل الدم القياسية. وبالإضافة إلى ذلك، والخلايا السرطانية المنتشرة تمثل خطوة ضرورية في عملية الانبثاث 5،6، لذلك أهميتها بالنسبة للمرض وفائدة لاستهداف الأدوية الجديدة غير واضح. ومما يعقد من العزلة لجنة مكافحة الإرهاب من الدم في المختبر عن طريق تركيزها منخفض: بناء على أمر من واحد لكل مليون الكريات البيض أو واحد في المليار الكريات الحمراء 7. غالبية الطرق الحالية للكشف عن لجنة مكافحة الإرهاب في الدم، بما في ذلك تقنية خلية فقط وافقت عليها الهيئة<html> بحث (Veridex)، ضرر أو تدمير خلايا في عملية الكشف، مما يحول دون استخدام وراء التعداد. ووصف الأسلوب أعلاه لا يضر بقاء الخلية، وبالتالي يفتح الباب أمام البحوث السريرية في المستقبل على السرطان. كما استرداد خلايا سليمة هو الهدف من هذه التقنية، لا بد من أن يتم التعامل معها الخلايا مع الرعاية، وخصوصا خلال خطوات فصل الدم. هناك عدد من المعلمات في هذا النظام الانضباطي التي يمكن تغييرها لتحقيق تحسن العائد اعتمادا على الخصائص الحيوية مثل نوع السرطان. في الخطوات المذكورة أعلاه، ونحن قد اختارت لاستخدام EpCAM كما الأجسام المضادة لجنة مكافحة الإرهاب محددة لجميع أنواع السرطان إلا عند معالجة عينات من سرطان البروستاتا، حيث كان يستخدم لمكافحة PSMA. ويمكن بالتأكيد بدائل أخرى من السرطان محددة الأجسام المضادة يمكن استخدامها لتحسين الأداء الفردي للمرضى. وعلاوة على ذلك، يمكن تغيير selectin والأجسام المضادة تركيزات لتعزيز القبض على 8. &quot;&gt; سمة أساسية من سمات هذا الجهاز هو دمج E-selectin الجزيئات على السطح. E-selectin يتم التعبير عادة على سطح اللمعية من الخلايا البطانية وظيفة الكريات البيض لتوظيف سريع الانتقال إلى مواضع الالتهابات. الكريات البيض يتدفق إلى ربط عابر جزيئات selectin، مما أدى إلى سلوك أبطأ، المتداول الذي يسهل ملزم أبطأ وأكثر قوة من الخلية إلى البطانة بواسطة لل integrins. أدلة تجريبية مقنعة وجود هذا يدلل على أن لجنة مكافحة الإرهاب يمكن أن يتسرب من خلال آلية مماثلة 9،10. إدراج selectin أيضا يسمح بتشغيل جهاز بمعدلات أكبر تدفق، ومعدلات من شأنه أن يمنع ذلك من الربط إلى الخلايا الأجسام المضادة 11. وهكذا لدينا جهاز يحاكي فيزيولوجيا 1 الوريد لالتقاط biomimetically تدفق لجنة مكافحة الإرهاب من دون إلحاق الأذى الخلوية. ويمكن أن يعزى إلى تعزيز أداء الجهاز إضافة للطلاء أنابيب halloysite إلى السطح اللمعيةللجهاز. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هناك ثلاثة عناصر رئيسية للطلاء أنابيب التي تسمح لتحسين الأداء الوظيفي. أولا، طلاء أنابيب يتيح زيادة مساحة السطح، والسماح لأكبر ترسب البروتين على سطح ال 4. الثاني، في أداء ذرية المجهر قوة على طلاء أنابيب لقد توصلنا إلى أن الأنابيب النانومترية الفردية تبرز من السطح إلى تدفق. وهذا يسمح لتقديمها جزيئات selectin بقدر واحد ميكرون فوق السطح بحيث يمكن التقاط تلك الخلايا والمعينين على السطح في وقت سابق في مسارها من خلال أنبوب 4. وأخيرا، فإن طلاء أنابيب halloysite غير قادرة على منع التصاق الكريات البيض وتنتشر على السطح، والسماح لعدد أقل من كريات الدم البيضاء القبض على طول مع لجنة مكافحة الإرهاب، وبالتالي زيادة لاحقة درجات نقاء لجنة مكافحة الإرهاب 3.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> 300 أنابيب معرف ام </td><td> برينتري العلمية </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> أكبر أنبوب للاتصال محقنة </td><td> آيدكس علوم وصحة </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> 5mL حقنة لمضخة </td><td> دينار بحريني </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> صغيرة على أنبوب كبير موصل </td><td> آيدكس علوم وصحة </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> أنبوب موصل كبير لحقنة </td><td> آيدكس علوم وصحة </td><td> F-120 و P-659 </td></tr><tr><td> حقنة لmicrotube (3/10cc حقنة الأنسولين U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> دينار بحريني </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> النائب Biomedicals ذ م م </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque زائد </td><td> GE أشفthcare العلوم البيولوجية AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC تحلل العازلة (الواق EL، 1000mL) </td><td> QIAGEN </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> غرام من البروتين، 5 ملغ </td><td> CalBiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> الإنسان EpCAM/TROP-1 جسم </td><td> R &amp; D أنظمة </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA جسم (GCP-04) </td><td> abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> 96 لوحات جيدا (Microtest 96) </td><td> دينار بحريني الصقر </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> النشاف الصف بلوكير غير دهن الحليب الجاف، 300g </td><td> الحيوي راد مختبرات </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Halloysite الأنابيب النانومترية </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> كربونات الكالسيوم، 5G </td><td> الدريتش الكيمياء </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc الوهم، 100 ميكروغرام </td><td> R &amp; D أنظمة </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> RPMI متوسط ​​1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> بولي-L يسين 0.1٪ وزن / حجم المياه في </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> سونيك Dismembrator </td><td> فيشر العلمية </td><td> نموذج 100 </td></tr><tr><td> الأبقار مصل الجنين </td><td> الكيميائية الحيوية أتلانتا </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> سيغما الحياة Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

rapid isolation of viable circulating tumor cells from patient blood samples

الخلايا السرطانية المنتشرة (CTC) هي الخلايا التي تنشر من الورم الرئيسي طوال الدورة الدموية والتي يمكن أن تشكل في نهاية المطاف أورام ثانوية في مواقع بعيدة. ويمكن استخدام لجنة مكافحة الإرهاب لمتابعة العد تطور المرض على أساس العلاقة بين تركيز لجنة مكافحة الإرهاب في الدم، وشدة المرض 1. كأداة للعلاج، يمكن أن تدرس لجنة مكافحة الإرهاب في المختبر لتطوير علاجات شخصية. تحقيقا لهذه الغاية، لجنة مكافحة الإرهاب يجب أن لا تسبب أي العزلة تلف الخلايا، والتلوث بواسطة أنواع الخلايا الأخرى، وبخاصة الكريات البيض، لا بد من تجنبها بقدر الإمكان 2. العديد من التقنيات الحالية، بما في ذلك جهاز وافقت عليها الهيئة الوحيدة للتعداد لجنة مكافحة الإرهاب، وتدمير لجنة مكافحة الإرهاب كجزء من عملية العزلة (لمزيد من المعلومات، انظر المرجع 2). يوصف جهاز ميكروفلويديك للقبض على لجنة مكافحة الإرهاب قابلة للحياة، التي تتكون من سطح functionalized مع E-selectin بروتين سكري، بالإضافة إلى أجسام مضادة ضد علامات الظهارية 3. لتحسين ادائها جهازومانس طلاء جسيمات متناهية الصغر يمكن تطبيقه تتألف من الأنابيب النانومترية halloysite، وهي جسيمات متناهية الصغر ألومينوسيليكات تحصد من طين 4. الجزيئات E-selectin توفر وسيلة لالتقاط سريع لجنة مكافحة الإرهاب التي تتحرك من خلال ضخ الجهاز، والإقراض ميزة على أجهزة ميكروفلويديك بديل فيها أوقات أطول معالجة ضرورية لتوفير الخلايا المستهدفة مع ما يكفي من الوقت للتفاعل مع سطح. الأجسام المضادة لأهداف توفير الظهارية لجنة مكافحة الإرهاب، خصوصية إلى الجهاز، فضلا عن توفير معلمة قابل للتعديل بسهولة لضبط العزلة. وأخيرا، فإن طلاء أنابيب halloysite يسمح العزلة زيادة كبيرة بالمقارنة مع غيرها من التقنيات من خلال المساعدة في القبض على خلايا تتحرك بسرعة، وتوفير زيادة المساحة السطحية لامتصاص البروتين، وطارد للالكريات البيض تلويث 3،4. وينتج هذا الجهاز عن طريق تقنية بسيطة باستخدام قبالة الجاهزة للاستخدام المواد، واستخدمت بنجاح لالتقاط الخلايا السرطانية من الدم من النقيليمرضى السرطان. تتم المحافظة على الخلايا والقبض لمدة تصل إلى 15 يوما في أعقاب ثقافة العزلة، وهذه العينات عادة ما تتألف من&gt; 50٪ قابلة للحياة الخلايا السرطانية الأولية من كل مريض. وقد استخدم هذا الجهاز لالتقاط لجنة مكافحة الإرهاب قابلة للحياة من الدم على حد سواء كل المخفف وعينات معطف بوفي. في النهاية، نقدم تقنية مع وظيفة في عملية إعداد سريرية لتطوير علاجات السرطان الشخصية.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples at JoVE.com

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

يتم عزل الخلايا السرطانية تنتشر من الدم لمرضى السرطان دون إلحاق الضرر الخلوي. ويتم إنجاز عزل الخلايا السرطانية باستخدام سطح ثنائي الجزيء من selectin-E بالإضافة إلى أجسام مضادة ضد علامات الظهارية. وطلاء أنابيب يعزز تحديدا سرطان التصاق الخلية مما يؤدي إلى ارتفاع درجات نقاء القبض.

سريع عزل الخلايا السرطانية قابلة للحياة اعارة من عينات الدم من المريض

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

rapid-isolation-viable-circulating-tumor-cells-from-patient-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

26.5K Views.  Cornell University. يتم عزل الخلايا السرطانية تنتشر من الدم لمرضى السرطان دون إلحاق الضرر الخلوي. ويتم إنجاز عزل الخلايا السرطانية باستخدام سطح ثنائي الجزيء من selectin-E بالإضافة إلى أجسام مضادة ضد علامات الظهارية. وطلاء أنابيب يعزز تحديدا سرطان التصاق الخلية مما يؤدي إلى ارتفاع درجا...

Video: Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

كشف وعزل خلايا الميلانوما تعميم استخدام Flowmetry الضوئي

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

عزل الخلوية الدهون قطرات: اثنان تقنيات تنقية بدءا من خلايا الخميرة ومشيمة الآدمي

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

عزل خلايا ورم القولون الإنسان الأساسية من الأنسجة الجراحية وزراعة بشكل مباشر على لينة مرنة ركائز للالجر الخلوي

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من السمحاق السنخية البشرية وآثار فيتامين د على نشاط الخلايا المستمدة من السمحاق أوستيوجينيك

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

حمض الهيالورونيك أساس الهلاميات المائية للثقافة 3-الأبعاد من الخلايا جليوبلاستوما المستمدة من المريض

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

المريض خاص بوليفينيل الكحول تصنيع الوهمية مع الموجات فوق الصوتية والأشعة السينية على النقيض للتخطيط جراحة ورم الدماغ

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

الخلايا الليفية المشتقة من النسيج الضام البشري المهندسة لتطبيقات الفحص

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.