Il lavoro descritto è stato sostenuto dal Centro Cornell sul microambiente e metastasi attraverso il numero di U54CA143876 Award dal National Cancer Institute. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Cancer Institute e il National Institutes of Health. Questo lavoro è stato inoltre finanziato in parte da una National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).

Il protocollo seguito è per la produzione di un dispositivo microtubo singolo. 1. Preparazione della soluzione Nanotubi Halloysite <ol><li> Sottoporre ad ultrasuoni (10-13 W (rms)) 250 microlitri soluzione di nanotubi halloysite (6,6% in peso in acqua) 30 sec. Soluzione di raffreddare con acqua fredda e sonicazione ripetere una sola volta. Raffreddare di nuovo. </li><li> Disegna la soluzione sonicato in una siringa, collegare un filtro per siringa 0,45 micron, e la soluzione di filtro in provetta per microcentrifuga pulita. Vortex la soluzione di tanto in tanto per mantenere l&#39;omogeneità. </li></ol> 2. Rivestimento di superficie Conetti interno con nanotubi halloysite <ol><li> Ottenere 50 cm lungo tratto di Micro-Renathane microtubing (300 micron di diametro interno, 35,3 microlitri di volume interno). Tagliare un&#39;estremità della provetta in diagonale e inserire in un piccolo pezzo adattatore IDEX. Inserire l&#39;ago di una siringa 3/10 cc 29G nell&#39;altra estremità della provetta. </li><li> Per pulire la provetta, posizionare l&#39;estremità aperta della provetta (finecon l&#39;adattatore) in etanolo al 70% e il pareggio ~ 50 microlitri di etanolo nella siringa per riempire provetta. </li><li> Sciacquare la produzione di etanolo da provetta disegnando un volume generoso di acqua distillata nella siringa. </li><li> Staccare la siringa dal microprovetta, svuotare la siringa, e quindi ricollegare alla provetta. </li><li> Preparare una soluzione di 0,02% w / v poli L-lisina in acqua. Disegnare 50 pl nella provetta e lasciare riposare per 5 min a temperatura ambiente (RT). </li><li> Disegnare 100 ul di soluzione nanotubo filtrata nella provetta e consentire ad incubare per 3 minuti a RT. </li><li> Disegnare 100 microlitri di acqua attraverso la provetta per sciacquare la soluzione nanotubo. Lasciare microprovetta rivestito di sedersi, riempita con acqua, durante la notte a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Preparazione di Microtubes per l&#39;isolamento cellulare <ol><li> Preparare una soluzione di 10 ug / mL proteina G in fosfato di Dulbecco 1X salina tamponata (PBS, pH 7,0 - 7,2). Disegnare 50 microlitri di PBS attraverso provetta e quindi disegnare 50 pl dila proteina-G soluzione e consentono di incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Preparare una soluzione contenente 5 pg / mL E-selectina-IgG e 50 ug / ml di anticorpo (anti-EpCAM per la maggior parte dei campioni di cancro, anti-PSMA per campioni di cancro della prostata) in PBS. Estrarre 50 pl della E-selectina e la soluzione di anticorpi nella provetta e permettono di incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Non specifica adesione cellulare è bloccato con le proteine ​​del latte del 5%. Preparare una soluzione di 5% (w / v), proteine ​​del latte in PBS. Estrarre 50 pl soluzione di proteina del latte nella provetta e consentire ad incubare per 1 ora a RT. </li><li> Disegnare 50 microlitri di PBS nella provetta e lasciare a temperatura ambiente fino a quando i campioni di sangue o cappotto buffy sono pronti per l&#39;elaborazione. </li><li> 10 min prima di utilizzare il microprovetta per l&#39;isolamento, disegnare 50 pl PBS che è stato saturato con Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) per attivare le molecole selectina. </li></ol> 4. Preparazione dei campioni per l&#39;isolamento delle cellule <ol><li> Disegnare o ottenere 10 mL di sangue dal paziente in eparinizzatotubo. </li><li> Place 10 mL Ficoll-Paque soluzione di isolamento dei linfociti in tubo da 50 ml centrifuga. Delicatamente sangue intero strato 10 mL sopra Ficoll per non mescolare il sangue e Ficoll. </li><li> Centrifugare a 2000x g per 15 min a 4 ° C con decelerazione minima. </li><li> Rimuovere lo strato di rivestimento buffy e il luogo in nuova provetta. </li><li> Lavare il buffy coat con PBS (centrifugare a 230x g per 10 min, scartare il surnatante). </li><li> Risospendere delicatamente le cellule con 1 ml di tampone di lisi RBC e incubare per 10 min a RT per la lisi degli eritrociti. </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS, mescolare delicatamente e centrifugare a 230x g per 10 min. Eliminare il supernatante e risospendere delicatamente il pellet in 3 a 4 mL PBS +. </li></ol> 5. Cella di isolamento <ol><li> Collegare una estremità della provetta funzionalizzato ad una siringa da 5 ml con adattatori IDEX. </li><li> Inserire la siringa su una pompa a siringa. </li><li> Immergere l&#39;estremità aperta della provetta funzionalizzato nella cella suspension. </li><li> Elabora la sospensione cellulare attraverso la provetta a 1 a 4 mL / h. </li><li> Trasferire l&#39;estremità aperta della provetta in una provetta contenente PBS + 300 + e disegnare ul PBS nella siringa a 0,016 mL / min per rimuovere le cellule non legato e vagamente legate dalla provetta. </li><li> Posizionare l&#39;estremità aperta della provetta in una provetta pulita. Staccare la siringa dal microprovetta e allegare una siringa preriempita con Accutase. Delicatamente perfusione Accutase abbastanza in provetta da riempire (~ 50 mL) e lasciar incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Attaccare una siringa preriempita con 1 mL di mezzo di crescita (79% RPMI, FBS 20%, streptomicina 1% di penicillina) e profumato in provetta, raccogliendo effluente in coltura di tessuto trattati bene piastra. </li><li> Cellule di coltura a 37 ° C e 5% CO 2 in condizioni umidificati. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi L&#39;obiettivo di questa tecnica è quella di isolare cellule tumorali vitali dal sangue di pazienti affetti da cancro. Esistono diversi metodi per identificare le cellule tumorali in coltura, una verifica necessaria di successo dispositivo. Abbiamo scelto per colorare le cellule in coltura con anticorpi contro porzioni epiteliali come EpCAM (molecola di adesione cellulare epiteliale) o PSMA (antigene di membrana specifico della prostata), oltre a DAPI per identificare nuclei intatti cellule (Fig. 2 e 3). Il numero di cellule tumorali catturato utilizzando questa tecnica è necessariamente una funzione del numero di CTC nel campione iniziale, e la variabilità del paziente può essere elevato. Nel trattamento di campioni prelevati da pazienti con diagnosi di tumori stadio IV, che abitualmente catturano tra 100 e 500 cellule tumorali per provetta di sangue, a purezze&gt; 50%. Immediatamente dopo isolamento, un maggior numero di leucociti contaminanti possono essere presenti. Tuttavia, questi numeri saranno esaurite incubazione seguente terreno di coltura per un massimo di 5 giorni. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Schema della provetta funzionalizzata per l&#39;isolamento CTC, mostrando selectina-mediata rotolamento seguito da anticorpo-mediata adesione statica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Figura 2. Dati rappresentativi di isolamento CTC da campioni di sangue prelevato da un paziente cancro al seno e un malato di cancro ai polmoni. Il numero di cellule vitali identificabili come CTC base colorazione EpCAM è rappresentato dalle barre solide e riguardano l&#39;ordinata di sinistra e la percentuale di cellule che sono stati identificati come CTC rispetto al numero totale di cellule catturate è rappresentato dalle barre aperte e misurato sulla ordinata di destra. I risultati vengono dopo cinque giorni di coltura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Micrografie rappresentativi Figura 3. Da donatori diversi (A e B) della CTC nella cultura 5 giorni successivi alla intercettaza partire da un campione di sangue del paziente cancro. Le cellule sono state colorate per fluorescenza con EpCAM AlexaFluor 488 (verde) e 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per visualizzare il nucleo (blu).

<ol>
	<li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+for+the+capture+and+manipulation+of+circulating+tumor+cells.">Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood.">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells.">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li><li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells:+a+new+model+for+metastasis.">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+Building+a+framework.">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li><li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow.">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li><li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis.">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li><li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade:+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation.">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 .</li><li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip.">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li></ol>

MRK è un consulente scientifico di CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

E &#39;spesso il caso che i primi passi nella scoperta di nuove terapie contro il cancro utilizzano linee di cellule tumorali, che somigliano discutibile per le cellule tumorali primarie pur rimanendo in uso a causa della loro facilità d&#39;uso in laboratorio. La ricerca lo sviluppo di nuove terapie oncologiche sarebbe accelerato se primarie cellule tumorali umane sono state utilizzate prima nella ricerca romanzo. CTC sono il tipo più facilmente accessibile di cellule del cancro, a causa della loro presenza nel sangue e la facilità di un prelievo di sangue standard. Inoltre, cellule tumorali circolanti rappresentano un passo necessario nel processo di metastasi 5,6, quindi la loro rilevanza per la malattia e l&#39;utilità per il targeting di nuovi farmaci è chiaro. Isolamento di CTC dal sangue in vitro è complicata dal loro basse concentrazioni: dell&#39;ordine di uno per milione leucociti o uno per miliardo eritrociti 7. La maggior parte degli attuali metodi per la rilevazione CTC nel sangue, compreso l&#39;unico approvato dalla FDA Cella tecnica<html> Cerca (Veridex), danneggiare o distruggere le cellule nel processo di rilevamento, escludere l&#39;utilizzo di là di enumerazione. Il metodo sopra descritto non compromette la vitalità cellulare e apre quindi la porta per la futura ricerca clinica sul cancro. Poiché il recupero di cellule intatte è l&#39;obiettivo di questa tecnica, è imperativo che le cellule essere maneggiato con cura, in particolare durante le fasi di separazione sangue. Ci sono un certo numero di parametri regolabili in questo sistema che possa essere modificato per ottenere una resa migliore a seconda delle caratteristiche critiche come tipo di cancro. Nelle fasi sopra descritte, abbiamo scelto di utilizzare EpCAM come CTC anticorpo specifico per tutti i tipi di cancro, tranne quando il trattamento di campioni di cancro della prostata, in cui anti-PSMA è stato usato. Altre sostituzioni di tumore-specifici anticorpi possono certamente essere utilizzato per migliorare le prestazioni per i singoli pazienti. Inoltre, le concentrazioni selectina e anticorpo può essere modificata per migliorare la cattura 8. &quot;&gt; Una caratteristica essenziale del dispositivo è l&#39;incorporazione di E-selectina molecole sulla superficie. E-selectina è normalmente espressa sulla superficie luminale delle cellule endoteliali e la funzione di assumere rapido movimento leucociti ai siti di infiammazione. Leucociti Flowing legano a transitoriamente molecole selectina, causando un più lento, comportamento a rotazione che facilita legame più lento e più forte della cella all&#39;endotelio da integrine. convincente evidenza sperimentale esiste che rende il caso che CTC può travasare da un meccanismo simile 9,10. L&#39;inclusione di selectina anche consente al dispositivo di funzionare a portate maggiori, aliquote che impedirebbero cellule di legarsi ad anticorpi 11. Così il dispositivo imita fisiologicamente uno venule per catturare biomimeticamente fluisce CTC senza causare danno cellulare. Prestazioni del dispositivo migliorato può essere attribuito al aggiunta del rivestimento nanotubo halloysite alla superficie luminaledel dispositivo. Studi precedenti hanno dimostrato che ci sono tre componenti principali del rivestimento nanotubi che permette una migliore funzionalità. In primo luogo, il rivestimento nanotubo fornisce una superficie maggiore, consentendo una maggiore deposizione di proteine ​​sulla superficie 4. In secondo luogo, nell&#39;esecuzione di microscopia a forza atomica sul rivestimento nanotubo abbiamo determinato che i singoli nanotubi sporgono dalla superficie nel flusso. Questo permette molecole selectina essere presentate come una delle molte micron dalla superficie in modo che le cellule possono essere catturato e assunti alla superficie anteriore nella loro traiettoria attraverso il tubo 4. Infine, il rivestimento nanotubo halloysite è in grado di prevenire l&#39;adesione dei leucociti e la diffusione sulla superficie, consentendo un ridotto numero di leucociti catturati insieme al CTC e quindi una maggiore purezza successive CTC 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 300 tubi ID um </td><td> Braintree Scientific </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Ingrandita della tubazione per il collegamento a siringa </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> 5 ml per pompa siringa </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Piccolo connettore per tubi di grandi dimensioni </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Connettore del tubo grande per siringa </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> F-120 e P-659 </td></tr><tr><td> Siringa per microprovetta (siringa da insulina 3/10cc U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque plus </td><td> GE Healthcare Bio-Sciences AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Proteina G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Anticorpo umano EpCAM/TROP-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA anticorpi (GCP-04) </td><td> abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> Piastre a 96 pozzetti (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Grade Blocker non grasse del latte a secco, 300g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Nanotubi halloysite </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Carbonato di calcio, 5g </td><td> Aldrich Chimica </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> RPMI Media 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poly-L lisina 0,1% w / v in acqua </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Di Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Modello 100 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Atlanta Biochemicals </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Penicillina Streptomicina </td><td> Sigma vita Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

rapid isolation of viable circulating tumor cells from patient blood samples

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono cellule che diffondono da un tumore primario in tutto il sistema circolatorio e che può in ultima analisi, formare tumori secondari in siti distanti. CTC conteggio può essere utilizzata per seguire la progressione della malattia in base alla correlazione tra la concentrazione CTC nel sangue e gravità della malattia 1. Come strumento di trattamento, CTC potrebbe essere studiata in laboratorio per sviluppare terapie personalizzate. A tal fine, isolamento CTC deve provocare alcun danno cellulare, e la contaminazione da altri tipi cellulari, in particolare leucociti, deve essere evitato il più possibile 2. Molte delle tecniche attuali, tra cui l&#39;unico dispositivo approvato dalla FDA per il conteggio CTC, distruggere CTC come parte del processo di isolamento (per maggiori informazioni vedi rif. 2). Un dispositivo microfluidico per catturare vitale CTC è descritto, costituito da una superficie funzionalizzata con E-selectina glicoproteina in aggiunta anticorpi contro marcatori epiteliali 3. Per migliorare prestazioni del dispositivomance un rivestimento di nanoparticelle è stato applicato costituito da nanotubi halloysite, un nanoparticelle alluminosilicato raccolto da argilla 4. Le E-selectina molecole forniscono un mezzo per catturare rapido movimento CTC che sono pompati attraverso il dispositivo, conferendo un vantaggio rispetto alle alternative dispositivi microfluidici cui tempi di trattamento più lunghi sono necessari per fornire cellule bersaglio con il tempo sufficiente per interagire con una superficie. Gli anticorpi a bersagli epiteliali fornire CTC-specificità al dispositivo, nonché fornire un parametro facilmente regolabile per sintonizzare isolamento. Infine, il rivestimento nanotubo halloysite permette di isolare significativamente maggiore rispetto ad altre tecniche, contribuendo a catturare le cellule si muovono veloci, fornendo maggiore area di superficie per l&#39;assorbimento delle proteine, e respingere leucociti contaminanti 3,4. Questo dispositivo è prodotto mediante una tecnica semplice utilizzando off the shelf materiali, ed è stata usata per catturare le cellule tumorali dal sangue di metastaticoPazienti con tumore. Cellule catturate vengono mantenute per un massimo di 15 giorni in coltura, previo isolamento, e questi campioni consistono tipicamente di&gt; 50% delle cellule tumorali vitali primarie di ogni paziente. Questo dispositivo è stato usato per catturare vitali CTC sia da sangue intero diluito e campioni di buffy coat. In definitiva, vi presentiamo una tecnica con la funzionalità in ambito clinico per sviluppare terapie oncologiche personalizzate.

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Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Cellule tumorali circolanti sono isolate dal sangue di pazienti affetti da cancro senza infliggere danni cellulari. Isolamento di cellule tumorali viene eseguita utilizzando una superficie bimolecolare di E-selectina in aggiunta agli anticorpi contro marcatori epiteliali. Un rivestimento nanotubo favorisce espressamente adesione cellulare del cancro con conseguente purezze cattura elevate.

Isolamento rapido di cellule tumorali circolanti da campioni di sangue del paziente

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

26.5K Views.  Cornell University. Cellule tumorali circolanti sono isolate dal sangue di pazienti affetti da cancro senza infliggere danni cellulari. Isolamento di cellule tumorali viene eseguita utilizzando una superficie bimolecolare di E-selectina in aggiunta agli anticorpi contro marcatori epiteliali. Un rivestimento nanotubo favorisce espressamente adesione cellulare del cancro con conseguente purezze cattura elevate.

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Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Ricerca

Bioingegneria

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolamento dei lipidi cellulari Goccioline: due tecniche di purificazione partire da cellule di lievito e placente umane

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e Coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Acido ialuronico base di idrogel per cultura 3-dimensionale delle cellule di Glioblastoma paziente-derivato

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

Fabbricazione fantasma di alcol polivinile specifico per il paziente con ultrasuoni e contrasto a raggi X per la pianificazione della chirurgia del tumore al cervello

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.