Bu protokol, knock-out veya knock-in hatları oluşturmak için CRISPR-Cas9 kullanır. Bu tekniğin en büyük avantajı, özellikle acemi araştırmacılar için takip etmek basit ve verimli olmasıdır. Hücre geçişi için, iki dakika boyunca 37 santigrat derece plaka başına% 0,25 tripsin EDTA iki mililitre ile gece kültürlü hücreleri tedavi.
Hücreler plaka diplerinden kalktığında, enzimatik reaksiyonu iki mililitre hücre kültürü ortamıyla nötralize edin ve hücre süspansiyonuna konik bir tüpe aktarın. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve sayma için taze hücre kültürü orta beş mililitre pelet resuspend. Sonra tohum 1.8 kez 10 beşinci hücrelere bir kuyu içine 24-iyi doku kültürü plaka bir gecede kültür için 37 derece santigrat ve% 5 karbondioksit.
Hücrelerin transfeksiyonu için, deneysel tasarım aveğine ve imalatçının talimatlarına uygun olarak, uygun transfeksiyon reaktifi hacmine CRISPR plazmid konsantrasyonu içeren uygun bir transfeksiyon karışımı hacmi ekleyin. Transfeksiyon karışımını önerilen süre boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yattıktan sonra, çözeltiyi hücrelere damla şeklinde ekleyin. Daha sonra yavaşça plakayı karıştırıp %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş 37 derece lik bir inkübatöre yerleştirin.
Transfeksiyon sonunda, sadece gösterildiği gibi hücreleri ayırmak ve santrifüj ile müstakil hücreleri toplamak için tripsin-EDTA 150 mikrolitre ekleyin. PBS'deki %2'lik fetal büyükbaş serumdaki peleti yeniden askıya alın ve hücreleri 30 mikrometrelik bir örgü süzgeçten beş mililitrefloresan aktif hücre ayıklama veya FACS tüpüne filtreleyin. Daha sonra akış sitometreüzerinde negatif bir kontrol kapısı ayarlamak ve transfected hücreleri crispr plazmid üzerinde floresan marker göre hücre kültürü orta 100 mikrolitre içeren bir tüp içine transfeksiyon için kullanılan sıralamak için transfected hücreleri kullanın.
Transfected hücrelerin tüm toplandığında, maksimum hızda santrifüj ile hücreleri pelet ve hücre kültürü orta 300 mikrolitre pelet resuspend. 24 kuyulu doku kültürü plakasının bir kuyuya 200 mikrolitre hücre tohumve 37 derece lik bir inkübatörde hücrelerin birkaç gün iyileşmesini sağlar. Kalan 100 mikrolitre lik hücreyi maksimum hızda beş dakika boyunca peletleyin ve standart DNA çıkarma protokollerine göre ortaya çıkan peletten genomik DNA ayıklayın.
Daha sonra, 10 mikrolitre polimeraz zincir reaksiyonu tamponu, bir mikrolitre deoksinükleotid karışımı, 2,5 mikrolitre kullanıcı tanımlı ters astar, 0,5 mikrolitre DNA polimeraz, 2-5 mikrolitre çıkarılan genomik DNA şablonu ve 50 mikrolitrelik son bir hacme reaksiyon getirmek için yeterli çift distile su ekleyin. Karışımı bir termal döngücüzerinde çalıştırın ve standart protokollere göre 1X TAE tampon kullanarak %2'lik agarose jelüzerindeki reaksiyonu çözün. Polimeraz zinciri reaksiyon ürün çıkarmak ve üreticinin talimatlarına göre bir jel çıkarma kiti kullanarak DNA arındırmak için temiz, keskin bir neşter kullanın.
Ürünün konsantrasyonunu 260 nanometre absorbansta bir spektrofotometre kullanarak ölçün. İzole DNA 200 nanogram içeren bir tahlil karışımı hazırlayın, T7 enonukleaz I reaksiyon tampon iki mikrolitre, ve yeterli çift distile su karışımının son hacmi getirmek için 19 mikrolitre. Polimeraz zincir reaksiyonu ürününün belirtilen parametrelerde bir termal döngüde reanneal ve 5 birim T7 enonukleaz I'i 37 santigrat derecede 50 dakikalık bir kuluçka için reannealed ürünle karıştırın.
Kuluçka sonunda, 1X TAE tampon kullanarak% 2.5 agarose jel üzerinde sindirilmiş DNA çözmek ve uygun bir jel görüntüleme sistemi üzerinde jel görüntü. ImageJ'deki jel görüntüsünü açın ve bandın etrafına mümkün olduğunca sınırına yakın dikdörtgen bir kutu çizin. Alanın ortalama gri değeri ve tümleşik yoğunluk seçeneklerinin denetlendiğini onaylayan Analiz et ve Ölçümleri Ayarla'yı tıklatın.
Tamam'ı tıklatın ve Çözümle ve Ölçü'nü seçin. Ortalama veya ham yoğunluk yoğunluğu değeri, bant yoğunluğunun göstergesidir. Kültüre aktarılan hücreler konfluren olmaya başladıklarında, gösterildiği gibi tripsin-EDTA ile ayırın ve hücreleri 100 milimetrelik doku kültürü yemeğine seyrek olarak yerleştirin ve hücreleri hücre kültürünün kuluçka makinesine geri dönmeden önce tek tek kolonilerin büyümesine olanak sağlar.
Koloniler oluşmaya başladığında, her kuyuda 500 mikrolitre hücre kültürü ortamı içeren 24 kuyuluk bir plakanın tek tek kuyularına aktarılmak için tek tek kolonileri seçmek için dört X büyütmeli bir mikroskop kullanın. İpucubireysel kuyular içinde kolonilerin karıştırma önlemek için çevredeki koloniler dokunmaz dikkat edin veya seyrek koloni büyüme bir alanda seçim. Tüm klonlar seçildiğinde, kültürler konca gelene kadar plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Sindirilmemiş plazmidler süper kıvrılmış olduğundan, doğrusallaştırılmış benzerlerinden daha hızlı koşma eğilimindedirler. Oligonükleotidlerin CRISPR plazmid omurgasına başarılı bir şekilde klonlanıp klonlanadığını belirlemek için koloni PCR yapılır ve plazmidler ayıklanıp Sanger dizilimi için gönderilmeden önce pozitif klonlar aşılanır. Floresan sinyal plazmidlerin başarılı bir şekilde teslim edilmesiyle mikroskop altında kolayca görüntülenebilir ve transfected hücrelerin akış sitometrisine göre sıralanmasına izin verir.
Bir Agarose jel üzerinde gözlenen bantların yoğunlukları hesaplanır gibi, genomik DNA'nın dekolte verimliliğini kontrol etmek için bir T7 enonukleaz i test yapılır. Ayrıca, homoloji yönelimli onarım tabanlı bir deney hedef lokusbir kısıtlama alanı dahil etmek için tasarlanmıştır, bir kısıtlama parçası uzunluğu polimorfizm tsay ilgili bir kısıtlama enzimi ile yapılabilir. Bir protein kodlama geninin başarıyla inaktive edildiğini doğrulamak için, hedeflenen proteinin bulunmadığından emin olmak için batılı bir leke yapılabilir.
Transfeksiyon dan sonra hücrelerin sıralanması plazmidler dahil olmadan hücreleri ortadan kaldırır, daha sonraki aşamalarında bir knock-out veya knock-in gen sahip olarak taranan hücrelerin yüzdesini artırarak. Bu tekniğin geliştirilmesi ile, şimdi onların mekanizmasını anlamak için belirli hastalıkları modellemek için gen fonksiyonu ve knock-in hücre hatları çalışma knock-out hücre hatları üretmek edebiliyoruz.
