R01HL082694 (JW);; Amerikan Kalp Derneği, Kurucular bağlı (0855943D, GG); Bu çalışma Sağlık 1R21HL092370-01 Ulusal Enstitüsü (GG), 1R01 HL095764-01 (GG) tarafından finanse edildi Stony Wold - Herbert Fonu, New York (SHP).

1. Hazırlık <ol><li> Aşağıdaki gibi aşağıdaki çözümler ve borular (Tablo 1) hazırlanması: <ol><li> Hanks çözeltisi, herhangi bir kalsiyum, magnezyum veya gösterge penisilin (100 U / ml) / streptomisin (100 mg / ml). </li><li> Fosfat salin (PBS), 1x, hiçbir kalsiyum, magnezyum hiçbir tamponlu. </li><li> Etanol,% 70, 500 ml olun. </li><li> Formaldehit Buffered, PBS ile% 7-10, 500 ml olun. </li><li> Anestezi çözümler: <ol><li> Avertin. Dikkatle 2,2,2-Tribromoethanol 5 g 2-Metil-2-butanol, 5 ml ekleyin. Bir kere çözülmüş, karanlıkta oda sıcaklığında stok solüsyonu tutun. Stok solüsyon 0.25 ml almak ve cam alt şişe içinde 10 ml 1xPBS ile seyreltin. 37 alüminyum folyo, yer ile şişe sarın ° C çözülmüş ve daha sonra kısım 5 ml polipropilen tüpler içine ve buzdolabında tutun kadar. Deneyin sabahı bir tablet ısıtın. </li><li> Barbiturat. % 2.6 barbitürat sol vermek PBS ile stok solüsyon seyreltinution. Polipropilen tüplere 3-4 ml alikotları yerleştirin. </li></ol></li></ol></li><li> Üç işlikler (Şekil 1) düzenleyin. </li><li><ol><li> Alan A: Çalışma formuna çalışmada kimlik numarası, tarih, vücut ağırlığı, sağ kalp ağırlıkları, sol kalp ve septum kaydetmek için; vücut ağırlığı belirlemek için hassas terazi (0.01 gr hassasiyet az 0-50 g); mikro ölçeği: aşağıdaki öğeleri düzenleyin 0.001 g hassasiyet de kalp ağırlıkları belirlemek; (cerrahi aletler, tekneler tartın; anestezi çözümleri (açıkça işaretlenmiş); sıvı nitrojen ile küçük Dewar; buz ile yalıtılmış bir kap; tüpleri ve 24-plaka kan ve doku örnekleri (Tablo 1) toplamak Tablo 2, Şekil 2) ve araçlar (Tablo 1) temizlemek için çözümler. </li><li> Alan B: diseksiyon mikroskobu, bir amplifikatör ve dizüstü bilgisayara bağlı bir basınç kontrol ünitesine bağlı sağ kalp kateteri: aşağıdaki öğeleri düzenleyin. Kateter içine yerleştirilmiştirsu içeren bir beher. Cerrahi aletler (Tablo 2), optimal uzunluğu sütür kesim parçaları ve bir tekne tartın içine yerleştirilen düzenleyin; bant (otoklav bandı optimal) Optimum uzunluğu ve genişliğine kesilmiş ve kolay erişim için mikroskop veya laboratuar tezgah üzerinde dizilmiş; pamuklu ve saç çıkarıcı çözüm. Çalışmanın başlangıcında kateter kalibre edin. </li><li> Alan C:; trakeal kanül; 1 ml şırınga; sütür uygun uzunlukta kesilmiş ve bir tartmak tekne içine yerleştirilir; sıvı nitrojen ile küçük Dewar; buz ile yalıtılmış bir kap; tüpleri ve 24-plaka BAL toplamak için büyüteç objektif: aşağıdaki öğeleri düzenleyin ve doku örnekleri (Tablo 1), cerrahi aletler (Tablo 2); çözümleri BAL gerçekleştirmek ve trakeal kanül ve aletleri (Tablo 1) temizlemek için. </li></ol></li></ol> 2. Sağ Kalp Kateterizasyonu <ol><li> Yavaşça içine fare koyarak bir hassas terazi kullanarak fare tartılır b tartmakyulaf. Yavaşça ve sessizce hayvan işlemek için emin olun. Ağırlığı kaydedin. Açıklanan protokol, jugular damar çapı basınç kateter yerleştirmek zorunda olduğu için 20 g veya daha fazla olan fareler için en iyi şekilde çalışır, fakat damar yeterince büyük olduğu sürece, daha küçük fareleri (17 g ya da daha fazla) kateterize mümkündür. </li><li> , Avertin 20 g 200 ul vermek için, örneğin, vücut ağırlığı (tercihen 10 ul / g), isteğe göre enjeksiyon yoluyla fare uyuşturmak için 25 g vermek 250 ul, 30 g 300 ul verir. Tam enjeksiyon hacmi fare suşu bağlı olarak ayarlanması gerekmektedir. Stres anestezik yanıtı değiştirebilir çünkü yavaşça ve sessizce hayvan işlemek için emin olun. </li><li> Çift pilili kağıt mendil üzerine fare sedatize sonra, yer. Kağıt üzerinde kimlik numarasını not edin. Yavaşça cerrahi alan temizlemek için boynun ventral yönü içine epilasyon losyonu sürün. Kağıda geri fare yerleştirin ve 1-2 dakika bekleyin. </li><li> Ventral saç kaldırnazikçe pamuklu çubukla tüylerin çıkış yönünün tersine saçını okşayarak tarafından boyun. </li><li> Dikkatlice ayak refleks yokluğu denetleyerek anestezi yeterli derinliği belirlemek: Fare, ayak kıstırma tepki vermez. </li><li> Hızlı ve rahat çalışma, sağ kalp kateterizasyonu kalan en iyi, 3-6 dk 10 dakikadan fazla sürmemelidir. Bu kateter damar içine kayma ve nem tabakası üzerinde damar içinde hareket etmesi gerekir, çünkü doku dışarı kuru değil önemlidir. Prosedürün tutarlı bir zamanlama grupları arasında karşılaştırılabilir veri üretimi için önemlidir. </li><li> Kağıt mendil ve strafor tahta üzerine kağıt mendil ile transferi Yeri fare geri. Otoklav bandı kullanarak yerine pençeleri ve baş Fix. </li><li> Altçeneleri dan sternum (göğüs-kemiği) için cilt kesi olun. </li><li> Sağ juguler ven bir açığa altçeneleri doğru tiroid büyük yukarı dikkatlice teşrihnd trakea. </li><li> Sıra strafor kurulu yaklaşık 0.8x büyütme (toplam büyütme [mercek x göz Adet] yer ve objektif zaten odak düzlemi ile diseksiyon mikroskobu altında fare tutan yaklaşık 8x olduğunu. </li><li> Dikkatlice cerrahi forseps ile çevreleyen bağ dokusu kaldırarak sağ juguler ven microdissect. </li><li> Sağ juguler venin üstüne yerleştirin sütür iki adettir. Küçücük bir damla ven kan akışını kapatmak için altçeneleri yakın dikiş Kravat, damar çevresinde gevşek bir düğüm de sternum / göğüs kemiği en yakın sütür koyun. Bir sonraki ven delik bulmak için kan küçük damlama kullanabilirsiniz, gerekli olması halinde. </li><li> Nefes alın ve mercek aracılığıyla damarın üzerinde gözlerini tutmak için (boyun ve çene kasları gevşetmek) dinlenebilir. Bu ellerinizi ve parmaklarınızı sorunsuz ve rahat, güvenli hareket sağlayacaktır. Yakın tarafında forseps ile ven tutarkenaltçeneleri, diğer taraftan tarafından işletilen mikro-makas kullanarak iki sütür arasındaki damarın içine bir delik kesti. Mikro-makas yere koy, ve el gevşemiş tutarak, kateter için hissediyorum. Hafifçe başparmak ve ilk parmak (Şekil 3) arasında tutarak kateter almak. Ven deliğine kateter yerleştirin. </li><li> Yavaşça sağ kalp (Şekil 3) içine kateter ilerlemek. Kateter takılması gerekir ne kadar yaklaşık bir dizin vermek ve monitör gözlemlemek kateter de işaretlerini gözlemleyin. Basınç eğrileri gösterilir sonra, yavaşça kateter etrafında alt dikiş sıkıştırın. Kateter bir bobin verir çekme gücüne sahip olduğundan ve fare solunumu ve kalp atışı yapıştırmayın ayrıca, bant kullanarak kateter hareket eklemek için. </li><li> Daha sonraki analizler için 2 dakika için Tutanak basıncı ölçümleri (Şekil 4). </li><li> Kateter tutarak dikiş açın, sonra yavaşça Geri alkateter ettik. Basınç dönüştürücü arkasındaki bölümü silin, su ile beher içine geri yerleştirin. Basınç dönüştürücü dokunmayın. </li><li> Ötenazi alan A, kan ve dalak dokusunun toplama kağıt mendil üstüne fare aktarın. Cerrahi aletler temizleyin. </li><li> Bir sonraki hayvan ile prosedürü başlatın. Basınç eğrisi (2.15) kaydetmek için beklerken zamanlama izin yaparken, anestezik enjekte edilir. </li></ol> 3. Kan ve Dalak Örnekleri Koleksiyonu <ol><li> Çözümü, fare başına 400 ul barbitürat ve 1-2 dk bekleyin enjekte. Bu rutin havası olurken fare yanlışlıkla avertin-anestezi kurtarmak ihtimalini önlemek için laboratuvarımızda yapılmaktadır. Deney uygun standardizasyon fare başına barbitürat çözelti aynı dozda enjekte, kan ve hasat öncesi zaman aynı miktarda bekleme ile elde edilir. Kurumsal Hayvan Bakım tarafından izin ve Komite kullanın ve varsagibi uzun hayvanlara önce dikkatle kan kaybı ile anestezi derinliği için izlenir olarak, bu adım göz ardı edilebilir. </li><li> Karın içine kesi olun. Kaudal ven (vena kava) açın ve bir transfer pipet kullanarak kan toplamak. </li><li> Dalak çıkarın veya Eppendorf tüp ve sıvı azot içinde ek dondurucuya dalak bir parça veya tek hücre sonraki hazırlanması için de içeren Hanks tamponu içine 24 plaka içine. </li><li> BAL toplanması, akciğer lenf nodu, akciğer ve kalp dokuları için işlik C doku kağıt üstüne fare aktarın. Cerrahi aletler temizleyin. </li></ol> 4. Akciğer ve Kalp Örnekleri Koleksiyonu <ol><li> Kas ve bağ dokusu trakea ücretsiz teşrih. Trakea altında yerleştirilmesi forseps aracılığıyla dikiş çekin. Hafifçe bir delik kesmek için yeterince streç oluşturur. Nazik streç bakımı, biraz döndürerek hareket kullanan trakeal kanül takın ve sütür kanül intyer o. Hanks çözüm bir damla eklemek gerekirse trakeal kanül yerleştirilmesi için, trakea nemli olduğundan emin olun. Prosedürü boyunca, nefes el hareketleri güvenli ve pürüzsüz tutmak için, boyun ve çene kasları gevşer. </li><li> Dikkatle karın sonundan başlayarak göğüs-kemiği kaldırarak göğüs kafesini açmak teşrih. Bu çok zor lenf düğümü bulmak için yapacak çünkü toraks içeriğini rahatsız etmeyin. </li><li> Yavaşça Hanks tamponu 1 ml ekleyerek bronkoalveoler lavaj (BAL) gerçekleştirin, yavaşça şırınga açmak ve BAL sıvısı almak. 3 kez, buz üzerinde yakın tüp ve yerde tekrarlayın. Işlem boyunca, şırınga ile bağlanır trakeal kanül ucunda gözler tutun. Akciğerlerin enflasyon ve deflasyon gözlemlemek için toraks Glance. </li><li> , Forseps bir set ile göğüs kafesi duvarı tutarak bulma ve başka bir forseps ile lenf nodu alarak Hasat akciğer lenf nodu. 24 plaka içine yerleştirin lenf nodu. Bu k önemlidirŞimdi nerede aramak için: boyun başlayarak, (Şekil 5) farenin sağ tarafındaki kaburga kafesinin giriş bulmak ve omurga üzerinde görünüyor. </li><li> Doku kağıt üzerinde Hasat kalp ve yer. Dikkatle septum yanında diseksiyon ile sağ kalp ayırın. A, tartmak sıvı nitrojen içinde dondurarak snap Eppendorf tüpleri içine ağırlık ve yere kaydetmek için işlik aktarın. </li><li> Ana bronş kapatmak için sol lobun etrafında dikiş yerleştirin. Eppendorf tüp ve tek hücre süspansiyonları daha sonra izolasyonu için Hanks çözeltisi içeren bir 24 plaka bir kuyunun içine sıvı azot veya bir yerde ek dondurucuya sol lobun ücretsiz yer teşrih. </li><li> Yaklaşık takın. 0.5 ml kalan akciğer lobu içine trakeal kanül aracılığı ile formaldehid çözeltisinin tamponlu. Enflasyon sonra, formaldehit solüsyon içeren 50 ml&#39;lik tüp içine toraks ve yerin akciğer lobları dışarı teşrih. Alternatif bir çalışma tasarımı için, akciğerlere optimum şişirilir edilebilirmal medya (OCT, PBS 1:4 seyreltilerek) kesme ve frozen sonraki hazırlanması için sulandırılmamış Ekim içeren bir kalıp içinde donmuş. Başka bir çalışmada tasarım çırpıda dondurulmuş akciğer dokusu ve akciğerlerden çıkan tek hücre süspansiyonları elde sebep olabilir. Bu durumda, enflasyon gereklidir: Kalan akciğer lobu teşrih; iyi içeren Hanks tamponu içine 24 plaka içine toraks ve yerden onları almak. </li><li> Hanks tamponu ile durulayarak temiz trakeal kanül, Kaldır, cerrahi aletler temizleyin. </li></ol> 5. Sağ Kalp Kateter Yaratılan Basıncı Eğrileri Analizi Kaydedilen sağ ventrikül basınç verileri her kayıt grup kimliğinin hiçbir bilgi ile LabChart 7 yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. 20&#39;den fazla eğrileri rastgele seçilmiş ve her eğri için azami ve asgari ventrikül basıncı arasındaki farkı (ΔP) ölçülür. Ortalama ΔP doğru v vermek için hesaplanırentricular sistolik basınç.

<ol>
	<li>Price, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Inflammation in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 141, 210-221 (2012).</li><li>Olschewski, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathophysiology+and+therapy+of+pulmonary+hypertension.">Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension.</a> J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).</li><li>Hassoun, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+growth+factors,+and+pulmonary+vascular+remodeling.">Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).</li><li>Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension.</a> J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).</li><li>Steudel, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+pulmonary+hypertension+and+right+ventricular+hypertrophy+after+chronic+hypoxia+in+mice+with+congenital+deficiency+of+nitric+oxide+synthase+3.">Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3.</a> J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).</li><li>Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+serine+elastase+inhibitor+elafin+protects+transgenic+mice+from+hypoxic+pulmonary+hypertension.">Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension.</a> Circulation. 105, 516-521 (2002).</li><li>Guignabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2-mediated+loss+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+in+mice+causes+PDGF+receptor-beta-dependent+pulmonary+arterial+muscularization.">Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).</li><li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+in+transgenic+mice+expressing+a+dominant-negative+BMPRII+gene+in+smooth+muscle.">Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle.</a> Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).</li><li>Cook, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+eNO+and+pulmonary+iNOS+expression+in+eNOS+null+mice.">Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice.</a> Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).</li><li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+expressing+BMPR2R899X+transgene+in+smooth+muscle+develop+pulmonary+vascular+lesions.">Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+fibroblast+growth+factor-2+signaling+contributes+to+altered+endothelial+phenotype+in+pulmonary+hypertension.">Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).</li><li>Daley, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+arterial+remodeling+induced+by+a+Th2+immune+response.">Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response.</a> J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+endothelial+injury,+and+persistent+pulmonary+hypertension+in+heterozygous+BMPR2-mutant+mice.">Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).</li><li>Thibault, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+assessment+of+murine+pulmonary+arterial+pressure:+validation+and+application+to+models+of+pulmonary+hypertension.">Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension.</a> Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).</li><li>Otto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+and+right+heart+failure+in+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+type+I+receptor-deficient+mice.">Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice.</a> Circulation. 110, 3245-3251 (2004).</li><li>Burton, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+leukocyte+recruitment+via+CXCR1/2+inhibition+stops+the+progression+of+PAH+in+mice+with+genetic+ablation+of+endothelial+BMPR-II.">Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II.</a> Blood. 118, 4750-4758 (2011).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+in+TNF-alpha-overexpressing+mice+is+associated+with+decreased+VEGF+gene+expression.">Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression.</a> J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).</li><li>Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Short+Periods+of+Induced+Acute+Anoxia+Upon+Pulmonary+Artery+Pressures+in+Man.">The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man.</a> Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).</li><li>Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Pulmonary+Arterial+Blood+Pressure.">Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure.</a> Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).</li><li>Euler, U. S. V., Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+pulmonary+arterial+blood+pressure+in+the+cat.">Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat.</a> Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).</li><li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+prevents+hypoxic+pulmonary+hypertension+and+vascular+changes+in+rat.">Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat.</a> Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).</li><li>Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+pulmonary+circulation+after+chronic+hypoxia:+hemodynamic+and+structural+features.">Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features.</a> Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).</li><li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+pulmonary+blood+flow+affect+vascular+response+to+chronic+hypoxia+in+rats.">Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats.</a> Circ. Res. 52, 432-441 (1983).</li><li>Kugathasan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiopietin-1-Tie2+pathway+prevents+rather+than+promotes+pulmonary+arterial+hypertension+in+transgenic+mice.">The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice.</a> J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).</li><li>Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+tobacco+smoke+exposure+and+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).</li><li>Graham, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis-induced+experimental+pulmonary+hypertension:+role+of+interleukin-13+signaling.">Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling.</a> Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).</li><li>Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+disease+in+the+developing+world.">Pulmonary vascular disease in the developing world.</a> Circulation. 118, 1758-1766 (2008).</li><li>Crosby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Praziquantel+reverses+pulmonary+hypertension+and+vascular+remodeling+in+murine+schistosomiasis.">Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada özetlenen deneysel akışı akciğerler, kalp ve farelerde bağışıklık sistemi tepkilerin analizi için sağ ventrikül sistolik basıncı ve numune hasat hızlı ve eş zamanlı olarak ölçülmesini sağlar. Prosedür kalp fizyolojisi ölçümleri, mikro-diseksiyonu ve canlı hücre çalışmaları, histolojik analizler veya dokuların omics-analizi için sonraki doku hasat birleştirir. Tam prosedürü fare başına az 20 dakika sürer. Çünkü işlik organize iş akışının, 2-3 hayvanların aynı and...

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktifler </td></tr><tr><td> 2-Metil-2-butanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2,2,2-Tribromoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td> Dezenfektan sabun (Sarfiyat Sprey TB artı Steris) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1629-1608 </td><td></td></tr><tr><td> Etil Alkol, 200 Proof, Mutlak, Susuz ACS / USP Sınıf </td><td> PHARMCO-AAPER </td><td> 111000200 </td><td> Distile su ile% 70 sulandırınız </td></tr><tr><td> Formaldehit solüsyonu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td> 7-10% ması sulandırınızPBS stok çözeltisi ve su ile 1 x PBS arasında bir konsantrasyonda ldehyde yoğunlaşma </td></tr><tr><td> Hanks çözeltisi, herhangi bir kalsiyum, magnezyum </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ekim </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin (10.000 U / ml) / streptomisin (10.000 mg / ml) çözelti </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat salin (PBS), Kalsiyum, hiçbir magnezyum, 1x ve 10x çözümleri tamponlu </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sodyum pentobarbital% 26 </td><td> Fort Dodge Hayvan Sağlığı </td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labware </td></tr><tr><td> Plakalar 12, 24, 96 kuyu </td><td> Şahin </td><td></td><td></td></tr&gt; <tr><td> Transferi Pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-9BM </td><td></td></tr><tr><td> Tüp, EDTA kaplamalı </td><td> Sarstedt </td><td> 2013-08 </td><td></td></tr><tr><td> Tüpler 0.65 ml ve 1.7 ml mikro-santrifüj </td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tüpler 12 x 75 mm polipropilen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956-1D </td><td></td></tr><tr><td> Tüpler, çeşitli boyutlarda, polipropilen </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Forseps, Dumon 5. Güzel </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps, ekstra ince Graefe-0.5mm ipuçları kavisli </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11152-10 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps, ekstra fine Graefe-0.5mm ipuçları düz </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Kanül 18ga, 19 ga </td><td> BD </td><td> Hassas Glide İğneler </td><td> Dışında Optimum uzunluk, baskılanmış ve kesin bir kaba dış yüzey oluşturmak için rasped </td></tr><tr><td> Makas, Disektör makas ince bıçakları 9cm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14081-09 </td><td></td></tr><tr><td> BAL, örgülü ipek sütür için Sütür 4-0 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Sağ kalp kateterizasyonu, örgülü ipek sütür, 6-0 için Sütür </td><td> Teleflex tıbbi </td><td> 18020-60 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga, 1 ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> Amplifikatör, PowerLab 4/30 </td&gt; <td> ADInstrument </td><td> Model ML866 </td><td></td></tr><tr><td> Kateter, basınç F1.4 </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Diseksiyon </td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Forseps, Vannas yay makas-2mm bıçakları </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Halojen Danışma Büyütücü Işıklı </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td> Dizüstü bilgisayar </td><td> Asus </td><td> Model numarası A52F i5 işlemci; 15 inç </td><td></td></tr><tr><td> Işık kaynağı </td><td> Amscope </td><td> HL-250-A </td><td></td></tr><tr><td> Basınç Kontrol Ünitesi </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> PKB-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Yazılım, Labchart-Pro V.7 </td><td> MSstruments </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

Sağ kalp fonksiyonu böylece sağ kalp fizyolojisi ve pulmoner vasküler fizyoloji bağlayan, akciğerler aracılığıyla kan pompalamak için. Enflamasyon hücresel infiltrasyon, sitokinler ve büyüme faktörlerinin üretimi, tertipleyerek tarafından ve biçimlenme süreçleri 1 başlatarak, kalp ve akciğer fonksiyon ortak bir düzenleyicidir. Sol ventrikül ile karşılaştırıldığında, sağ ventrikül basınç değişikliklerinin nispeten dar bir bölgede faaliyet gösteren bir alçak basınç pompası. Artmış pulmoner arter basıncı akciğer vasküler yatak ve pulmoner hipertansiyon 2 içinde basınç artması ile ilişkilidir. Pulmoner hipertansiyon, iltihaplı sık sık akciğer hastalıkları, örneğin kronik obstrüktif akciğer hastalığı, otoimmün hastalıkların ya da 3 ile ilişkilidir. Pulmoner hipertansiyon yaşam ve yaşam beklentisi kalitesi için kötü prognoz bahşeder Çünkü çok araştırma bu mig mekanizmalarının anlaşılması yöneliktirht ilaç müdahalesi 4 için hedefler. Pulmoner hipertansiyon için etkin yönetim araçları geliştirilmesi için temel zorluk, moleküler ve hücresel sağ kalp değişiklikler, akciğer ve bağışıklık sisteminin eş zamanlı anlayış karmaşıklığı kalır. Burada, farelerin sağ kalp basınç değişiklikleri hızlı ve hassas ölçümü için bir usul iş akışı ve kalp, akciğerler ve bağışıklık dokulardan örnekler eşzamanlı hasat sunuyoruz. Yöntemi ilk pulmoner arter 5-13 baskıların vekil ölçüsü olarak 1990&#39;ların sonunda geliştirilen yakın göğüslü farelerde juguler ven yoluyla sağ ventrikül doğrudan kateterizasyon dayanmaktadır. Organize ekip yaklaşımı çok hızlı bir sağ kalp kateterizasyonu tekniğini kolaylaştırır. Bu da kendiliğinden oda nefes farelerde ölçümlerini yapar. Farklı iş alanlarında iş akışının organizasyonuzaman gecikmesi azaltır ve eşzamanlı fizyolojisi deneyleri ve hasat bağışıklık, kalp ve akciğer dokularında gerçekleştirme imkanı açar. Burada özetlenen usul akışı büyük ilaç tarama testleri, küçük, hedeflenen deneyler, laboratuvar ortamlarında ve çalışma tasarımları geniş bir yelpazede için adapte edilebilir. Ekokardiyografi 5,14-17 ve kalp, akciğer ve bağışıklık dokuların hasat kapsayacak şekilde genişletildi olabilir kalp fizyolojisi verilerin eşzamanlı edinimi ileri bilimsel bilgi temeli taşımak veri elde etmek için ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltır. Burada sunulan usul iş akışı aynı zamanda bağışıklık, akciğer ve kalp fonksiyonu bağlantı ağları bilgi kazanıyor için ideal bir temel sağlar. Burada özetlenen aynı ilkeler gerektiği gibi başka veya ilave organlar çalışmaya adapte edilebilir.

Sağ kalp baskı eğrisi elde etmek için birincil sonuç sağ kalp kateteri doğru pozisyon elde edilir. Sağ ventrikül kateter içinin doğru yerleştirme (Şekil 4) basınç yaylaları neden olacağından basınç zaman eğrisinin şekli önemlidir. Spiky eğrileri yerine, sağ ventrikül duvarına solunum veya kalp atım hareketi ile taşınır bir kateter göstermektedir. Hayvanların hayatta kalma evresi ile olası sorunları tespit etmek, ΔP, standart sapma ve kalp hızı hesaplanır gerekmekte...

Watch this Scientific Journal Video about Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice at JoVE.com

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice | Immunology and Infection | Video

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Aynı anda sağ kalp fonksiyonu, akciğer iltihabı ve bağışıklık yanıtı araştırmak için bir özel ve hızlı bir protokol bir öğrenme aracı olarak tanımlanmaktadır. Video ve rakamlar büyük ölçekli çalışmalara küçük kullanılmak üzere uyarlanabilir bir organize ekip yaklaşımı, fizyoloji ve mikrodiseksiyon teknikleri anlatıyoruz.

Akciğer ve Fareler immün Doku Örneklerinde Hasat ile kombinasyon Sağ Ventrikül Sistolik Basınç Ölçümleri

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

right-ventricular-systolic-pressure-measurements-combination-with

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Human Biology

Circulatory and Pulmonary Systems

SCIENTISTS IN ACTION

25.0K Görüntüleme.  New York University School of Medicine, Tuxedo. Aynı anda sağ kalp fonksiyonu, akciğer iltihabı ve bağışıklık yanıtı araştırmak için bir özel ve hızlı bir protokol bir öğrenme aracı olarak tanımlanmaktadır. Video ve rakamlar büyük ölçekli çalışmalara küçük kullanılmak üzere uyarlanabilir bir organize ekip yaklaşımı, fizyoloji ve mikrodiseksiyon teknikleri anlatıyoruz.

Video: Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

(C I) Viral Mimik Poli ile Orta gebelik Sahnesi&#39;nde Farelerde Anne Bağışıklık aktivasyonu indüksiyon

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Fare Buzağılarına Tutarlı Masaj Benzeri Pertürbasyonların Uygulanması ve Bunun Sonucu Kas içi Basınç Değişikliklerinin İzlenmesi

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Farelerde Gardnerella vaginalis Mesane Maruziyeti Tarafından Tetiklenen Tekrarlayan Escherichia coli İdrar Yolu Enfeksiyonu

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

İnsan Balgam Örneklerinde Nötrofil Elastase ve Katepsin G Aktivitesinin İzlenmesi

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

Enfeksiyöz Mononükleozlu Çocuklardan Periferik Kan Örneklerinde İmmün Hücre Alt Popülasyonlarının Ayrılması

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, periodontal ligament, cementum, and alveolar bone. In this study, a simple method of PD induction in rats is described. We provide detailed instructions for placement of the ligature model around the first maxillary molars (M1) and a combination of injections of lipopolysaccharide (LPS), derived from Porphyromonas gingivalis at the mesio-palatal side of the M1. The induction of periodontitis was maintained for 14 days, promoting the accumulation of bacteria biofilm and inflammation. To validate the animal model, IL-1&#946;, a key inflammatory mediator, was determined by an immunoassay in the gingival crevicular fluid (GCF), and alveolar bone loss was calculated using cone beam computed tomography (CBCT). This technique was effective in promoting gingiva recession, alveolar bone loss, and an increase in IL-1&#946; levels in the GCF at the end of the experimental procedure after 14 days. This method was effective in inducing PD, thus being able to be used in studies on disease progression mechanisms and future possible treatments.

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

In this study, a rat model of induction of periodontitis is presented via a combination of retentive ligature and repetitive injections of lipopolysaccharide derived from Porphyromonas gingivalis, over 14 days around the first maxillary molars. The ligation and LPS injection techniques were effective in inducing peridontitis, resulting in alveolar bone loss and inflammation.