Bu çalışma Sağlık Araştırma MOP-81.158 Kanada Enstitüleri ile hibe tarafından desteklenmiştir.

1. Kültürlü İlköğretim Hipokampal Nöronlar gelen Hedef Protein Ekstraksiyonu <ol><li> Proteaz inhibitörleri ile; primer hipokampal hücrelerinde endojen protein hasat öncesinde, bir Lysis Buffer (Tablo 1 LB) hazırlamak. Lizis tamponu 10 ml, 10 mM bir son konsantrasyon için 0.1 ml çözelti fenilmetansülfonil florür (PMSF) ekleyin ve 1 proteaz önleyici kokteyl tablet ekleyin. </li><li> Liyofilize toz N-etilmaleimid (NEM) solüsyonu (Tablo 1) hazırlayın. Yavaşça oda sıcaklığında (RT),% 100 EtOH içinde çözülür. Her deney günü taze NEM solüsyon hazırlanır. </li><li> Sonraki lizis tamponu ve NEM birleştirir. Bir taze 50 ml konik tüpe 2M NEM çözeltinin 0.5 ml ilave edilir. 20 üstünden ml LB, ve hızlı bir şekilde yer LB Ekle 4 bir sallanan bir platform ° C tam 5 dakika boyunca karıştırmak için + NEM (50mM final konsantrasyon). Her zaman düzgün bir şekilde karıştırmak için iki şekilde, NEM / EtOH çözelti birinci ve ikinci LB ekleyin. </li><li> Inkübatör ve buz * üzerine yerden kültürü nöronlar çıkarın. Yavaşça hücresel ortamı çıkarın ve hafifçe soğuk fosfat ile iki kez yıkayın salin (PBS) 1x tamponlu. Tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı ile hipokampal nöronlar, ve kazıma hücrelerinin birinci oyuğa 300 ml LB + 50 mM NEM ekleyin. Hücre lisatı toplayın, o zaman bu grubun iyi bir sonraki içine lizat deşarj. Hücre kaldırıcı kullanarak iyi ikinci olan hücreleri kazıyın, toplamak ve daha lizat konsantre etmek gerekirse, bir üçüncü de kullanarak tekrarlayın. </li><li> Bir önceden soğutulmuş (buz üzerinde), 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine hücre lisatı toplayın. Kalan hücre lizat toplamak için LB 100 ul + 50mM NEM kullanarak 1.4 adımı yineleyin. Çözüm içine kabarcıklar darbe için dikkatli olmak, mekanik parçalanma yardımcı olmak için bir 26 ½ göstergesi şırınga 5-6 kez ile total hücre lizatı pas. Ekipman varsa biri yerine, buz üzerinde 15 saniye boyunca sonikasyon yapabilirsiniz. 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle ≥ hücre lisatı Nutate </li><li> Hücre lysa Açıkladılarte sipariş pelet un-parçalanan hücreler ve deterjan-çözünmeyen malzeme 16,000 xg / 30 dk santrifüj tarafından. </li><li> Buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş 1.5 ml tüp hücre lizat (süpernatant) temizlenir toplayın. Hücrelerin tüm gruplar için hasat protokolü tekrarlayın. Tedbir protein BCA assay kullanarak tüm lizat örneklerinde konsantrasyon ve 500 mcg, önerilen minimum, tam olarak eşit toplam protein olması hücre gruplarının tüm lizat örneklerin hacim normalleştirmek. Tüm örneklerde LB + 50mM NEM ile 500 ul toplam hacmi kadar ekleyin. </li><li> Lizat, örneğin her için hedef proteine ​​karşı yöneltilmiş birincil antikor 1-5 ug ekleyin. 4 gecede antikor-lizat karışık numune ° C. Nutate </li></ol> * Birincil fare hipokampal nöronlar bir nöronal B27 eki ihtiva eden bir serumsuz ortam içinde, / iyi bir 6-çanak içinde yaklaşık olarak 250,000 hücrelik bir yoğunlukta kültür az olmalıdır, daha önce arzu 5 için tarif edilmiştir ve yetiştirilend zaman uzunluğu, olgunluk elde etmek için tipik olarak 14-16 gün-in-vitro (DIV). Toplam protein, 500 ug en az başarılı bir şekilde immunoprecipitate ve tipik olarak 6-çanak 2-3 kuyu gerektiren bir hedef nöronal protein, biotinylate tavsiye edilir. 2. Antikor-Bağımlı Hedef Protein yağış <ol><li> Bir hedef protein hızlandırıcı ve hareketsizleştirici önce, protein A veya protein G-Sepharose boncuk kaplı% 50 bulamaç hazırlanır. Özellikle, tüm örnekler boncuk eşit miktarda sahip olmasını sağlamak, 1.5 ml tüpler için örnek başına Sepharose boncuk ≥ 60 ul ekleyin. Donanım mevcut olduğu takdirde manyetik boncuklar da uygundur. </li><li> Her bir antikor-lisatı numune için en az% 50 bulamaç eşit hacimde bir ekleyin ve 4 ≥ 1 saat boyunca nutate ° C. </li></ol> 3. Açil-Biotin Değişim: Hidroksilamin (HAM) Dilinim <ol><li> Adım 2.2 gerçekleştirirken, di lizis tamponu (LB) ile tüpler bir dizi hazırlamakfferent pH. PH adımları için çok önemlidir ve her zaman bir pH metre kullanılarak ayarlanmalıdır. LB numune başına pH 7,2 ve numune başına Sıkı Tampon (Tablo 1) 0,5 ml 2 ml hazırlayın. Ayrıca adımları 1.1-1.3 olarak, 0.5 ml LB numune başına + 10mM NEM hazırlamak. Adım 1.1 &#39;de olduğu gibi, her lizis tampon ile PMSF ve proteaz inhibitörü tablet ekleyin. </li><li><ol class="lalpha"><li> Hidroksilamin (HAM) olan bölünme palmitat ve sistein dan biyotinilasyon (Şekil 1) için gerekli olan bir kuvvetli indirgeyici madde, ve HAM bölünme ihmal bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Iki örnek, HAM dilinim adım (-HAM) atlayarak biri ve HAM adım (+ HAM) dahil olmak üzere tek bir boncuk her numune Böl. HAM tedavisi neden protein parçalanması için normalize etmek için, bir-HAM kontrolü için kullanılan boncuk 1/3 ile, üçe bölünmüş her bir numune gerekir, ve geriye kalan 2/3 + HAM tedavi etmek için kullanılır. </li><li> Ek 1 hazırlayın.Her bir numune için-HAM kontrol olarak etiketlenmiş buz üzerinde 5 ml borular. Adım 2.2 takiben, hafifçe 4 ° C (bu hız, süre, ve aksi belirtilmedikçe bütün geri kalan adımları için sıcaklığında santrifüj) 0.5 xg / 1 dak tüm örneklerde &#39;boncuk santrifüj, buz üzerinde tüp yerleştirin, süpernatant kaldırmak ve LB + 10mM NEM 600 ul boncuklar tekrar askıya. </li></ol></li><li> Lizis tamponu + NEM 10mM yeniden askıya örnekleri &#39;boncuklar sonra, hemen buz üzerinde bu numune-HAM tüp içine 200 numunenin lizat-boncuk bulamaç ul ve deşarj toplamak. LB ilave bir 300 ul +-HAM örnek için 10 mM NEM eklendi, ve her bir numune içinde 500 ul toplam + HAM örnek için ilave bir 100 ul ekle. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Yeniden askıya (yıkama)-HAM ve + HAM örnekleri yavaşça 0.5 ml sıkı tampon, numune başına. Daha uzun bir SDS inkübasyon dan bağlı antikor çıkarılması neden olacağı için, hızlı bir şekilde bu adım gerçekleştirmeboncuk. </li><li> Yavaşça LB pH 7,2 ve 0,5 ml / numune içindeki tüm numunelerin üç kez yıkayın, ve adım 3.2b gibi Yıkamalar arasında aşağı doğru döndürün. </li><li> Adım 3.5 gerçekleştirirken, HAM tamponu (Tablo 1) hazırlayın. 0.5 ml LB pH 7.2, HAM + her numune hacmi içinde 1 M arasında bir nihai konsantrasyon elde etmek için, yeni bir boru ile hidroksilamin solüsyonu uygun miktarda ekleyin. Her deney günü taze HAM tamponu hazırlayın. Tüm-HAM örnekler ve tüm + HAM örnekleri HAM tamponu 0.5 ml / numune LB pH 7,2 ve 0,5 ml / numune ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) 1 saat için tüm örnekler Nutate. 1 saat aşmayın. </li></ol> 4. Açil-Biotin Değişim: Biotin-BMCC Etiketleme <ol><li> Adım 3.6 gerçekleştirirken, LB pH 2 ml hazırlamak adım 3.1 &#39;de olduğu gibi numune başına 6.2 (Tablo 1). Ihtiyaç kadar buz üzerinde LB pH 6.2 yerleştirin. Ayrıca kullanımdan hemen önce Biotin-BMCC (Tablo 1) bir stok solüsyon hazırlanır. Exac üzerinden tartılırBiotin-BMCC arasında tly 2.1 mg, 1.5 ml tüp içinde toplamak ve yavaşça 8mm konsantrasyon (tozu dağıtmak için bir pipet kullanmayan elde etmek için, oda sıcaklığında bir sallanan platform üzerine yerleştirilerek 0.5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülür ). </li><li> Adım 3.6 tamamlandığında, yavaşça rezidüel HAM tampon kaldırmak için, pH 6.2 lizis tamponu kez boncuk yıkayın. Süpernatantı ve buz üzerinde örnekleri yer. </li><li> Biotin-BMCC sistein serbest tiyol grupları (Şekil 1) için yüksek bir afiniteye sahiptir, bir maliemide biyotin konjuge bir moleküldür. Adım 4.2 gerçekleştirirken, 5 uM, 0,5 uM arasında çalışan konsantrasyonda, numune başına Biotin-BMCC Tamponu içinde 0.5 ml (Tablo 1) hazırlanması. 5 mcM aşan konsantrasyonlar olasılıkla hedef protein 6 doyurabilecek olacak ve genellikle aşılmamalıdır, ancak bu istenilen hedef protein bağlı olarak değişebilir. Her numune için Biotin-BMCC tamponu 0.5 ml ekleyin ve ve 4 de tam 1 saat nutatedeg; C. 1 saat aşmayın. </li></ol> 5. Biotin-konjuge Hedef Protein ve SDS-PAGE ve elüsyon <ol><li> Adım 4.3 tamamlandığında, yavaşça LB pH 6.2 &#39;de bir kez tüm örnekler yıkayın. Yıkamalar arasında buz üzerinde tüm örnekler tutun. -20 ° C depolama hiçbir indirgeyici ajanlar (Tablo 1) ile 2x SDS Örnek Tamponu çıkarın ve yavaşça buz üzerinde eritin. </li><li> Yavaşça LB pH 7.5 &#39;te örnekleri üç kez yıkayın + PMSF / İnhibitörleri ve yıkar arasında buz örnekleri tutmak. </li><li> Tüpün alt içinde kalan tampon ile bir bulamaç içinde peletlenmiş boncuklar bırakarak, üçüncü yıkama süpernatantı. Bulamaç ile tüpün çok dibine küçük çaplı ucu (bir jel yükleme ucu veya P2 pipet yeterlidir) ile bir pipet batırın ve hızlı bir şekilde herhangi boncuk almak için dikkatli olmak, kalan tampon toplamak. </li><li> 5 mM nihai konsantrasyon elde etmek üzere DL-ditiyotretol (DTT) ile 2x SDS numune tamponu Supplement. EklemekHer numune için 2x Sample Buffer 40-50 ul + 5mM DTT. Gerekirse, vorteks boncuklar tamamen numune tamponu ile karıştırılması halinde, derhal numune tamponu batırılmış bir pelet tüm boncuk, toplamak için yüksek hızda santrifüj. </li><li> 75-80, 10 dakika için tüm örnekler kaynatılır ° C. Tamamen pelet boncuk 16.000 az ≥ 10 tezgah üstüne dk ve santrifüj xg / 3 dk RT serin örnekleri edelim. </li><li> Batı SDS-PAGE 7 kullanıyorsanız, kurutma için uygun bir poliakrilamid jel içinde tek şeride her örnekten Elüsyonlanan protein (süpernatant) tam hacmi ekleyin. Tek bir örnek için kontrol-HAM ve çıkarıcı solvent + HAM eluent SDS-PAGE (Şekil 2) boyunca birbirine hemen bitişik çalıştırılır ki bütün test edilen düzenleme. SDS-PAGE takiben, PVDF veya nitroselüloz membrana transfer. </li></ol> 6. Blotting ve Hedef Protein Palmitoylation Algılama Batı <ol><li> Adım 5.6 tamamlandığında, membran yıkamaİki kez RT de sallanan bir platform üzerinde 10 dakika süreyle Salin (TBS 1x) Tris tamponlu. </li><li> TBS 1x bir hacim içinde% 3 ağırlık elde etmek için, (BSA), Bovine Serum Albumin üzerinden tartı ile spesifik olmayan etiketleme engellemek için bir engelleme tampon hazırlanması + tamamen batırmak zar için yeterli olan Tween-20% 0.05 (TBS-T) . Streptavidin kurutma için, her zaman BSA ile bloke değil, süt tozu. Bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat için zar engelleme. </li><li> TBS-T +% 0.3 BSA bir antikor çözeltisi hazırlayın. Streptavidin-HRP antikor ekleme 1:5,000-1:10,000 seyreltilmiş distile su içinde 1 mg / ml &#39;de sulandırılır. Bir kez adım 6.2 tamamlandıktan sonra, 10 dakika için TBS-T içinde bir kere zar yıkayın, sonra 4 ° C de bir gece oda sıcaklığında 1 saat için ya da için bir sallanan platform üzerinde Streptavidin antikor çözeltisi içinde inkübe zar, ya da </li><li> Bir sallanan platform üzerinde 10 dakika için TBS-T içinde zar üç kez yıkayın. Palmitoylation sinyali tespit etmek için, bir kimya kullanılarak HRP parlaklık sergilemekiluminescent substrat kiti. </li><li> Immunoprecipitated olan ilgili proteini miktarı ile palmitoylation düzeylerini normal etmek için, oda sıcaklığında bir sallanan platform üzerinde 5-10 dakika için western blot sıyırma tamponu kullanılarak membran şeridi. 6.4 aslında immünopresipitasyon için kullanılan ilgili proteini karşı birincil antikor kullanarak - adımlar 6.1 tekrarlayın. </li><li> Görüntü analiz programı kullanılarak ilgilenilen proteinin palmitoylation ölçmek ve immunoprecipitated protein miktarı palmitoylation seviyelerini normale. </li></ol>

<ol>
	<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456, 904-909 (2008).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36, 276-285 (2004).</li><li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+proteins:+purification+and+identification.">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).</li><li>Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+hippocampal+and+cortical+neurons+in+a+mixture+of+MEM++and+B27-supplemented+neurobasal+medium.">Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium.</a> Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).</li><li>Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+protein+palmitoylation.">Assays of protein palmitoylation.</a> Methods. 40, 127-134 (2006).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. W. e. s. t. e. r. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>Huang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+palmitoyl+acyl+transferases+exhibit+distinct+substrate+specificity.">Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity.</a> FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).</li><li>Noritake, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+DHHC+palmitoylating+enzyme+mediates+activity-sensitive+synaptic+targeting+of+PSD-95.">Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95.</a> J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).</li><li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+by+DHHC5/8+Targets+GRIP1+to+Dendritic+Endosomes+to+Regulate+AMPA-R+Trafficking.">Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li><li>Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+palmitoylation+of+NR2+subunits+regulates+NMDA+receptor+trafficking.">Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking.</a> Neuron. 64, 213-226 (2009).</li><li>Ho, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Nitrosylation+and+S-Palmitoylation+Reciprocally+Regulate+Synaptic+Targeting+of+PSD-95.">S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95.</a> Neuron. 71, 131-141 (2011).</li><li>Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+protein+palmitoylation+in+cellular+signaling.">Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling.</a> Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan IP-ABE tahlil çoğunlukla standart biyokimyasal teknikler kullanılarak, kültürlü primer hipokampal nöronlarda palmitoylated proteinleri tespit etmek için basit ve son derece hassas bir yöntemdir. Bu zaten batı blot malzemeleri ile donatılmış laboratuarlar için tahlil kolaylıkla adapte edilebilir. IP-ABE tahlil hızlı bir substrat protein palmitat düzeylerini tespit etmek için daha önce tarif ABE kimyası 2-4 ardından bir hedef protein izolatı ve hareketsiz bir standart immünopresipitasyon protokolü, birleştirir. ABE tekniği büyük ölçekli Palmitoyl-proteomik küresel palmitoylation profillerin tarama ve tek bir hedef proteinin palmitoylation düzeylerinin hızlı bir şekilde saptanması dahil olmak üzere, çeşitli doku ve hücre hatları palmitoylated proteinleri incelenmesi için çok geniş bir uygulama alanına sahiptir. ABE kimya Önceki açıklamaları farklı yöntemler hücre parçalama ve nöronal prot deterjan ekstraksiyon faydalanmışeins 2, 9, serbest tiyol-blokaj 10, 11, biyotinilasyon, ve hedef protein 4 saflaştırılması, deney uygulamaya bağlı olarak değişebilir. Bir hedef proteinin palmitoylated fraksiyonu kendi hücre membranları karşı hedefleme ve tespit edilmesi de nöronal protein sonuçlar palmitat ve ayrıca bu örtüleri arasında çıkarma gerektirir. Daha önce anlatılan yöntemler ABE arzu edilen hedef proteinin elde etmek için iyonik 9 ve non-iyonik deterjanlar 8, çeşitli kullanılan, ve belli bir deterjan kullanılması hedef proteini ve bilinen zar ticareti bağlıdır. Burada, biz kullanmak non-denatüre ve non-iyonik deterjan IGEPAL CA-630 biz palmitoylated nöronal protein δ-katenin (Şekil 2) çıkarılması ve tespiti için geçerliliği palmitoylated proteinler, ayıklayın. IGEPAL CA-630 yapısı değil hantal ve katı olmayan kutup başını grup içeriryerli protein konformasyonu veya etkileşimleri bozabilir, ancak böylece onlara karışabilirliği görüşmekte ve onların çıkarma izin, membran-ilişkili proteinlerin hidrofobik bölgeleri ile ilişkisini sağlayan. Sinapsların sinaptik membran ya da post-sinaptik yoğunluğu lokalize birçok nöronal protein IGEPAL CA-630 ile elde edilmelidir, ancak bazı tamamen çözünür olmayabilir ve var Triton X-100 gibi farklı bir sigara denatüre deterjan kullanılması gerekebilir Daha önce ABE kimya, 2, 8 için kullanılmıştır. ABE kimyanın çeşitli tanımları aynı zamanda protein saflaştırma 4 farklı araç gerektirmektedir Biotin-HPDP (Thermo Scientific) denilen burada tarif molekül, farklı bir tiyol-reaktif biyotinilasyon reaktifi faydalanmış. Biotin-HPDP yapısal d maliemide linker kolunda bir disülfid bağı içeren başka bir tiyol-reaktif, maliemide-konjuge biotin moleküldürbu disülfid bağı ihtiva etmez Biotin-BMCC, onu ifferentiating. Biotin-HPDP göre bir proteinin serbest ya da palmitoylated sisteinin tiol-biyotinilasyon ardından, hedef protein ve biotin grup ile sonuçlanan disülfid bağı biyotinilasyon yapma, biotin grup serbest bırakmak ve değiştirilmemiş haliyle protein yeniden üretmek için reaktifler azaltarak parçalanabilen Biotin-HPDP geçici ve geri dönüşümlü tarafından. Bu biyotinilasyon reaktif örneğin streptavidin kaplı boncuklar gibi hareketsiz avidin reaktifler, bir hedef proteinin saflaştırılması gerekir Bu nedenle, kullanım. Bununla birlikte, Biotin-BMCC ile bir hedef proteinin tiyol-biyotinilasyon, burada açıklandığı gibi, stabil ve nispeten kalıcı olup, bir antikor hedef karşı yönlendirilmiş ve Sepharose boncuklar üzerinde hareketsiz tutulan göre olan hedef proteinin saflaştırılması gerekir. Her iki ABE teknikler, daha önce büyük ölçekli ekranlar, ve tek proteinleri 2, 8-10, 12 palmitoylation tespiti için kullanılan, ve edilmiştirBurada tarif IP-ABE tahlil tek nöronal Hedef proteinlere palmitoylation hızlı tespiti için en uygunudur. Hücresel palmitoylation ezici bir çoğunluğu, sistein ve tiyol grubu (biz bu protokolde &#39;palmitoylation&#39; olarak genellemek S-palmitoylation, adlandırılır) için palmitat ve tersinir ek içerir, protein ancak çok sınırlı bir grup glisin de geri dönüşümsüz palmitoylation tabi tutulur ve istikrarlı bir amid bağı oluşumu yoluyla sistein artıkları, N-palmitoylation 13 olarak adlandırılır. Abe kimya bir sınırlama amid bağı kararlılık, N-palmitoylation sayesinde tespit yeteneksizliği ve böylece palmitoylation için yeni bir hedef proteinin tarama 3H-palmitat metabolik etiketleme 1 kullanılarak teyit edilmelidir. Daha önce belirtildiği gibi, IP-ABE tahlil kolayca tran de dahil olmak üzere birden fazla kaynaktan gelen protein özleri de palmitoylation incelemek için adapte edilebilirheterolog hücre hatları, primer doku, ve çoklu beyin bölgelerinden primer nöronal kültürlerin sfected. IP-ABE tahlil, bazal koşullar altında 10 kültürü nöronlar sinaptik proteinlerin dinamik palmitat ciro incelenmesi için, bir hedef protein 8 boyunca bir palmitoylated sistein yerini belirlemek için mutasyona sistein-to-serin proteinlerin palmitoylation yeterliliğini incelemek için kullanılmıştır ve nöronal protein palmitoylation düzeylerindeki değişiklikleri nöronal aktivitenin 9 indüksiyonundan sonra. IP-ABE testinin duyarlılığı ve adaptasyon nöronal protein palmitoylation profilleri inceleyerek ve palmitoylation dinamik değişiklikleri tespit için optimal için ideal uygun hale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> Sigma </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaz İnhibitör Kokteyl </td><td> Roche Komple Mini </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Milli Ekonomi Modeli&#39;nde </td><td> Sigma </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> HAM çözümü </td><td> Sigma </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td> Seçilen deterjan ile uyumluluk sağlayın </td></tr><tr><td> Protein G / A-Sepharose boncuk kaplı </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> Biotin-BMCC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21126 </td><td> Su içinde 1 mg / ml &#39;de sulandırın </td></tr><tr><td> Western Blot Sıyırma Tampon </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (abe)

Palmitoylation labil bir tioester bağı ile alt tabaka proteinlerin sistein artıkları için bir 16-karbon doymuş yağ asidi, palmitat, ve eki içeren post-translasyon lipit modifikasyonu [1 gözden]. Bir alt tabaka proteininin Palmitoylation onun hidrofobik arttırır, ve tipik olarak hücresel membranlarda doğru olan ticareti kolaylaştırır. Son çalışmalar, palmitat devir bu hücrelerin proteinlerin hedefleme ve ticareti kontrol eden önemli bir mekanizmadır geldiğini gösteren, nöron 1, 2, en sık lipit modifikasyonları biri olduğu palmitoylation göstermiştir. Palmitoylated yüzeylerin belirlenmesi ve tespiti dolayısıyla nöronların protein kaçakçılığı anlayışımızı daha iyi yapamaz. Geçmişte protein palmitoylation saptanması teknik olarak bağlı olarak alt tabaka proteinler arasında bir uzlaşma dizisi olmaması nedeniyle çok ve metabolik labeli bağımlılığın olmuştur3 H-palmitat, düşük hassasiyet ile zaman alıcı bir biyokimyasal test ile ng Palmitoyl-proteinler. Açil-Biotin Borsası (ABE) Testin Geliştirilmesi palmitoylated proteinlerin 2-4 daha hızlı ve yüksek hassasiyet algılama sağlar ve nöronal proteinler üzerinde palmitat dinamik ciro ölçmek için en uygunudur. Abe tahlil üç biyokimyasal adımda (Şekil 1) oluşur: 1) değiştirilmemiş sisteyin tiyol gruplarının geri dönüşsüz blok N-ethylmaliemide (NEM), 2) spesifik bölünme ve hidroksilamin (HAM) ile palmitoylated sistein en tiyol grubunun kuşkuya kullanarak, ve bir tiol-reaktif biyotinilasyon reaktifi kullanılarak palmitoylated sistein 3) seçmeli işaretlemesi, biyotin-BMCC. Abe adımlar aşağıdaki tiyol-tinile proteinlerin saflaştırılması deney genel amacına bağlı olarak, farklılık göstermektedir. Burada, birincil hippocamp bir ilgi palmitoylated proteini saflaştırmak için bir yöntem tarifbir ilk immünopresipitasyon (IP) Abe tahlil ve batı direkt olarak IP-ABE tahlil adlandırılır o proteinin palmitoylation seviyelerini ölçmek için kurutma ve ardından protein, karşı yöneltilmiş bir antikor kullanarak, basamak al nöronlar. Embriyonik sıçan hipokampal nöronların Düşük yoğunluklu kültürlerde yaygın IP-ABE deneyi kullanılarak nöronal protein palmitoylation eğitim için onları ideal uygun hale lokalizasyonu, fonksiyon ve nöronal protein ticareti incelemek için kullanılmıştır. IP-ABE tahlil ağırlıklı standart IP ve batı blot reaktifler gerektirir ve yalnızca hedef yüzeye karşı antikor durumu ile sınırlıdır. Bu testte kolaylıkla heterolog bir hücre kültürleri, fare ve sıçan gerekse çeşitli beyin dokusundan türetilmiş birincil nöronal kültürler, ve hatta primer beyin dokusunun kendisi de palmitoylated transfekte edilmiş proteinlerin saflaştırılması ve tespit için adapte edilebilir.

IP-ABE tahlil, özellikle alt tabaka boyunca proteinlerin sistein kalıntıları arasında tiyol-palmitoylation algılar, ve Şekil 1 &#39;de gösterilen bir tarzda immunoprecipitated nöronal protein palmitoylation tespit etmek için de kullanılabilir. HAM (Şekil 1) ile immunoprecipitated nöronal protein işlenmesi daha sonra Western blotting kullanılarak tespit edilebilir yeni kullanılabilir tiol grubu, üzerine biyotin-BMCC spesifik birleşme sağlayan, palmitat ve bir sistein en tiol grubu arasındaki bağlantı tioester ayırır. Ham (eksi-HAM) bölünme ihmal biyotin-BMCC dahil edilmesi ve artı-HAM örnek spesifik Palmitoyl-biyotinilasyon için bir negatif kontrol olarak işlev önler ve bu nedenle, her zaman için batı artı-HAM örnek bitişik çalıştırılması gerekir SDS-PAGE (Şekil 2) tarafından blotting. Optimize edilmiş bir deney (Şekil 2A), palmitoylation yılındanöronal protein δ-katenin 2&#39;nin sinyal kolayca paralel eksi ve artı-HAM örnekleri karşı, HRP ile konjüge streptavidin, 1 uM &#39;lik bir konsantrasyon biyotin-BMCC için blotting ile tespit edilebilir. Δ p-katenin için spesifik palmitoylation sinyali sadece artı-HAM örnek olarak, 160kD onun tahmin boyutta görüntülenir. Bu sinyalin özgüllüğü başlangıçta öngörülen aynı boyutta iki HAM tedavilerinde bir sinyal ile sonuçlanan, bu immunoprecipitate için kullanılan spesifik antikor ile δ p-katenin için reprobing tarafından teyit edilmiştir. IP-ABE assay (Şekil 2A) optimizasyonu artı-HAM örnek kolayca ayırt edilebilir bir eksi-HAM örnek bir batı blot profili neden ve hiçbir palmitoylation sinyal minimal sergiler olacak. Palmitoylated sissteinler etiketlemek için kullanılır biotin BMCC konsantrasyonu dikkatli optimizasyonu gerektirir, ve eğer bi süper doyurarak konsantrasyonuotin-BMCC ABE kimya adımda (Şekil 2B), aşırı arka plan ve özel olmayan sinyal sırasında kullanılan görünür olacaktır. Biotin-BMCC kullanılarak bir palmitoylated nöronal protein, α7 nikotinik asetilkolin reseptör biyotinilasyon için bir lineer tepki eğrisi önceden belirlenmiş 6, 5-10 uM bir konsantrasyonda komple doyma yakın göstermemektedir. Biotin-BMCC en uygun konsantrasyon hafifçe nöronal hedef protein bağlı olarak sapma olsa da, 5 uM aşan bir konsantrasyonda biyotin-BMCC ile tedavi edilmesi görünür bir arka plan ile western blot profil hedef protein, ve sonuç süper-doyurmak olacaktır ve spesifik olmayan sinyaller. Biotin-BMCC, 0.5 uM&#39;lik bir konsantrasyon önceden SNAP-25, huntingtin, AMPA reseptör alt birimlerinin GluA1 ve GluA2, ve paralemmin 8, ve bir yeni için optimum konsantrasyonu belirlenmesi de dahil olmak üzere diğer nöronal protein palmitoylation tespit etmek için kullanılmıştırhedef protein burada tarif 0.5-5 uM aralığında başlangıç, deneme ve lineer olarak hata ile gerçekleştirilebilir. Farklı boyutlarda, bu uygunsuz biyotinilasyon meydana gösterir ilave arka plan sinyallerini 4 uM biyotin-BMCC (Şekil 2B) ile muamele zaman δ p-katenin için palmitoylation eksi ve artı-HAM örnekleri arasında oluşabilecek streptavidin western blot profilleri benzer görünür. Hidroksilamin güçlü bir indirgen ajan tioester bağ, etkin bölünme ek olarak hedef proteinin sınırlı düşmesine yol açtığını göstermiştir. Sonuç olarak, ABE kimya optimizasyonu eksi ve artı-HAM numuneleri (- 3.3 adımlar 3.2) için kullanılan immunoprecipitated protein miktarı, normalize etmek için bir gerektirmektedir. Normalleştirme aslında ayırt edilemez Wester sonuçlanan artı-eksi-vs HAM örnek, immobilize hedef proteinin çift miktarda kullanımını gerektirir,n, δ-katenin (Şekil 2A, B) için gösterildiği gibi hedef protein için profiller blotting. Immobilize edilen hedef proteinin miktarı eksi ve artı-HAM örnekleri arasında normalize Bununla birlikte, eğer, artı-HAM örnek olarak hedef protein için sonuç western blot analizi δ p-katenin için gösterildiği gibi, kayıp olabilir, eşit miktarları Her iki protein HAM tedaviler (Şekil 2C) kullanılmıştır. Palmitoylated proteinler etiketlenmesi için ABE kimya özgüllüğü çok hassastır ve optimizasyon gerektirir. IP-ABE tahlil sırasında karşılaşılan genel tuzaklar sub-optimal Şekiller 2B ve 2C gösterilen sonuçlar, ve tipik olarak büyük reaktifler ve tamponlar neden olduğu HAM tedavisi, ve hatalı pH&#39;sinden bağımsız olan, hedef protein yıkımı içerir. Bu tuzaklardan kaçınmak ve alt-optimal ABE kimya düzeltmek için, reaktiflerin tazelik ve konsantrasyon için gerekliTablo 1&#39;de listelenen tampon her zaman incelenmesi gerektiğini, ve tüm tampon pH düzenlemesi için her zaman, deneme öncesi kontrol edilmelidir. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tampon </td><td> Çalışma Konsantrasyon </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Lizis Buffer (LB) </td><td> 1% IGEPAL CA-630, 50 mM Tris-HCI, pH7.5 150mm NaCl,% 10 gliserol: damıtık H2O içinde </td><td> N / A </td><td> 4 de deney ve mağaza önce hazırlayın ° C </td></tr><tr><td> NEM Çözüm </td><td> NEM liyofilize toz:% 100 EtOH içinde </td><td> 2 M </td><td> Kullanımdan hemen önce taze hazırlayın. </td></tr><tr><td> Sıkı Tampon </td><td> 10 mM MEM% 0.1 SDS: libre </td><td> N / A </td><td> Kullanmadan önce kısa bir süre hazırlayın, buz üzerinde tutmak. </td></tr><tr><td> LB pH 7.2 </td><td> LB: tam 7.2 PH ayarlama </td><td> N / A </td><td> Kullanımdan hemen önce pH&#39;ı ayarlamak için bir pH metre kullanımı. </td></tr><tr><td> HAM Tampon </td><td> Stok HAM çözüm: LB pH 7,2 olarak </td><td> 1 M (nihai konsantrasyon HAM) </td><td> Kullanımdan hemen önce hazırlanır. </td></tr><tr><td> LB pH 6.2 </td><td> LB: tam 6.2 pH ayarlama </td><td> N / A </td><td> LB pH 7.2 ile aynı </td></tr><tr><td> Stok Biotin-BMCC Çözümü </td><td> DMSO: 2.1 mg çözelti Biotin-BMCC </td><td> 8 mM </td><td> Kullanımdan hemen önce hazırlanır. </td></tr><tr><td> Biotin-BMCC Tampon </td><td> LB pH 6.2 In: Biotin-BMCC çözümü ekle </td><td> 1-5 uM (biyotin-BMCC nihai konsantrasyon) </td><td> Kullanımdan hemen önce hazırlanır. </td></tr><tr><td> 2x SDS Örnek Tamponu, hayır indirgeyici ajanlar </td><td> % 5 SDS,% 5 gliserol 125mm, Tris-HCl, pH 6.8% 0.01 Bromophenol Blue damıtık H2O içinde </td><td> N / A </td><td> Kullanıma kadar -20 ° C&#39;de deney ve mağaza önce hazırlayın. Kullanmadan önce 5 mM DTT ile tamamlayın. </td></tr></tbody></table> Tablo 1. IP-ABE tahlil için gereken Tamponlar ve reaktifler. Lizis tampon çoğu Abe kimya başarılı olmasını sağlamak için bu deney, ancak pH kontrol edilmesi ve bir pH metre ile kullanımdan hemen önce ayarlanmış, başlamadan önce hazırlanabilir. Stok çözeltileri çoğunluğu, kullanımdan hemen önce, her deney için taze hazırlanmış olmalıdır. Arabellekleri çoğu biyokimya için donatılmış en laboratuvarları ortak reaktifler gerektirir ve satıcı bilgileri ile özel reaktifler reaktifler ve ekipman tabloda listelenmiştir. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> Şekil 1. Nöronal protein palmitoylation arındırmak ve tespit etmek için immünopresipitasyon ve asil-Biotin Değişim (IP-ABE) tahlil şematik. Cultured hipokampal nöronlar lize edilir, (1) bir hedef protein daha sonra bir hedef özgü antikor kullanarak saflaştınldı ve Sefaroz üzerinde immobilize edilir, boncuklar saflaştırılmış hedef protein (2) daha sonra geri döndürülemez biçimde bağlanır ve değiştirilmemiş sistein (C) boyunca serbest tiyol (-SH) grupları bloke etmek N-ethylmaliemide (NEM) ile muamele edilir, protein G ya da A ile kaplanmıştır. Hedef protein daha sonra (3) palmitoylated sistein ve bir serbest palmitoylated tiol grubu (-SH) ve kuşkuya da tiyoester bağlarının belirli bir yarılma sonucunda, hidroksilamin (HAM) ile muameleye tabi tutulmuştur. Daha sonra, hedef protein (4) olup treatepalmitoylated sistein spesifik biyotinilasyon ile sonuçlanan bir tiol-reaktif biotin molekül, biyotin-BMCC, d. Son olarak, (5) biyotinile hedef protein elüt ve antikor ve boncuk kaldırılır. Biotin ile etiketlendi onun palmitoylated sistein (ler) ile hedef protein hemen SDS poli-akrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile saflaştırılmış nöronal protein palmitoylation için tespit etmek için streptavidin ile Western blot için uygundur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">daha büyük bir şekil görüntülemek için</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> Şekil 2. IP-ABE deneyi kullanılarak nöronal protein δ-katenin palmitoylation tespiti. Primer sıçan hipokampal nöronlar öncesi olarak yetiştirilmiştirdilmiş, 14DIV olgunluğa kadar 130 hücre / mm 2 &#39;lik bir yoğunlukta, 5 tarif sonra lize edildi ve kısa bir süre önce tanımlanmış palmitoylated nöronal alt tabaka, δ-katenin 2 palmitoylation tespit etmek için IP-ABE tahlil tabi tutulmuştur. Saflaştırılmış (IP) δ-katenin (hedef protein) immunoprecipitates numune başına δ-katenin antikor 5 mikrogram (BD Transduction Laboratories) kullanılarak izole edildi ve daha sonra paralel eksi ve artı-hidroksilamin (HAM) SDS-PAGE tabi tutulmuştur örnekleri. Palmitoylation batı streptavidin-HRP (palmitoylation) ile (WB) blotting ile tespit edildi, ve membran sıyrılmış ve δ p-katenin için bir reprobe WB tabi tutuldu. IP örnekleri tiyol-palmitoylated proteinleri saptamak için Abe kimya özgüllüğü gösteren palmitoylated δ-katenin (ok başı) 1 uM biyotin-BMCC ile muamele edilmiş, (A) için optimize edilmiş bir temsili IP-ABE sonuçlanır. (B) Bir alt-optimal temsilher ikisi de eksi ve artı-HAM örnekleri (oklar) non-spesifik sinyaller ve arka edilen 4 uM biyotin-BMCC aşırı konsantrasyon kullanılmıştır δ P-katenin, temsilsici için IP-ABE sonuçlanır. (C) Biotin-BMCC aşırı 4 uM konsantrasyon kullanılmıştır δ P-katenin, ve ayrıca-HAM IP numune için kullanılan protein miktarı için bir başka alt optimum temsil eden IP-ABE WB HAM-aracılı için normalize edildi δ-katenin için reprobe WB kayıp bir sinyal ile sonuçlanan protein yıkımı,. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE at JoVE.com

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Proteinlere palmitat arasında reversibl Ayrıca hücre içi protein ticaretinin önemli bir düzenleyicisidir. Bu birçok sinaptik proteinlerin palmitoylated edilir nöronların özel bir ilgi alanıdır. Biz birden fazla hücre tipleri ve dokuları için adapte edilebilir kültürü nöronlar içinde palmitoylated proteinleri tespit etmek için basit bir biyokimyasal yöntem kullanmaktadır.

Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

detection-protein-palmitoylation-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

35.2K Görüntüleme.  University of British Columbia. Proteinlere palmitat arasında reversibl Ayrıca hücre içi protein ticaretinin önemli bir düzenleyicisidir. Bu birçok sinaptik proteinlerin palmitoylated edilir nöronların özel bir ilgi alanıdır. Biz birden fazla hücre tipleri ve dokuları için adapte edilebilir kültürü nöronlar içinde palmitoylated proteinleri tespit etmek için basit bir biyokimyasal yöntem kullanmaktadır.

Video: Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Nörobilim

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Kültür sempatik nöronlar bulunan dendritik Büyüme indükleyen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.