Acyl-reçin destekli yakalama veya Acyl-RAC biyolojik örneklerin çeşitli protein S-acylation tespit etmek için kullanılabilecek hassas ve güvenilir bir yöntemdir. Bu protokol, metabolik etiketleme ve radyo etiketlemenin bazı sınırlamalarını atlar ve birden fazla proteinin S-alasyonunun eşzamanlı olarak algılanmasını sağlar. Sadece canlı hücreler değil, aynı zamanda birincil dokular ve dondurulmuş örnekler.
S-aylasyon protein ticareti, plazma membran hedefleme, sinyal transdüksiyonu, demir taşıma ve protein-protein etkileşimleri gibi çeşitli hücresel süreçleri düzenleyebilir. Tiyoester bağının verimli ve spesifik bir dekoltesini sağlamak için her deney için özenle ayarlanmış pH ile taze hazırlanmış hidroksilin çözeltisi kullanmak önemlidir. Bu yöntemin bir gösteri ile kloroform, metanol yağış gibi adımlar için kritik.
Bu adımda elde edilen gözleme şekli pelet çok dikkatli kullanılmalıdır. Bu kırılgan olabilir ve adım sırasında numunenin kısmi kaybı düzensiz numune kurtarma yol açabilir. Prosedürü gösteren Savannah West, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.
Hücre lysates elde etmek için, konik bir santrifüj tüp içine ilgi hücreleri toplamak. Ve santrifüj ile herhangi bir hücre enkaz kaldırın. PBS 5 mililitre pelet yıkayın.
Ve hemen taze hazırlanmış lysis tampon 600 mikrolitre hücreleri askıya. Numuneyi dakikada 1,500 devirde bir termo shaker'da 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede çalkalayın. Lysates, pelet deterjan ve çözünür malzeme yi temizlemeden önce santrifüj ile.
Santrifüj sonunda, önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik mikrocentrifuge tüp buz üzerinde temizlenmiş lysate toplamak. Ve standart protokollere göre protein konsantrasyonu tahmin etmek için bir Bradford veya bicinchoninic asit test gerçekleştirin. 2:1 oranında lysate metanol ve kloroform ekleyin.
Homojen bir süspansiyon oluşturmak için titizlikle çalkalayın ve sulu ve organik evreler arasındaki arabirimde bir protein peleti toplamak için numuneyi santrifüj edin. Tüpü yatırarak, mümkün olduğunca çok çözücü aspire etmek için bir iğne veya jel yükleme ucu kullanın. Protein peletini hava birkaç dakika kurutun.
Yavaşça metanol 600 mikrolitre ile tüp içeriğini karıştırmadan önce, pelet kırmak için değil dikkat. Dikkatle metanol yıkama çıkardıktan sonra, yaklaşık beş dakika boyunca bir tezgah üst üzerinde protein pelet kuru. Daha sonra, 2SHB tampon 200 mikrolitre protein pelet resuspend.
Ve 42 santigrat derece ve bir termo shaker dakikada 1,500 devrimler girdap. Pelet çözündüğünde, numuneye 2SHB'de %0,2 MMTS'lik 200 mikrolitre ekleyin. Ve proteini 42 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yaslayın ve termoshake'de dakikada 1,500 devir.
Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi 3:4 kloroform-metanol yağışları gerçekleştirin. MMTS'yi çıkarmak için peleti 100 mikrolitre taze 2SHB tamponu girdapla eritin. Ve her yağıştan sonra 300 mikrolitre tampon A ile numuneyi seyreltin.
Son yağıştan sonra, numuneleri 2SHB tamponunun 200 mikrolitresinde çözün ve 240 mikrolitre tampon a.Measure ile seyreltin ve her numuneden giriş kontrolleri olarak 40 mikrolitre ayırın. Örnekleri 200 mikrolitrelik iki eşit hacime bölün. Tüpleri artı hidroksilin ve eksi hidroksilin olarak işaretleyin.
Artı hidroksilin tüpüne 400 milimolar son konsantrasyonuna taze hazırlanmış nötr iki molar hidroksilin 50 mikrolitre ekleyin. Ve negatif kontrole nötr iki azılı sodyum klorür 50 mikrolitre, eksi hidroksilamin tüpü. Sonra her tüp için TS boncuk bulamaç 30 mikrolitre ekleyin.
Ve tüpleri oda sıcaklığında 1-2 saat döndürün. Kuluçka sonunda herhangi bir artık hidroksilin kaldırmak için tampon A% 1 SDS ile boncuk dört kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, tüm boncuk örneklerini üç nazik bir dakikalık mikrosantrifüjlerle yıkayın.
Supernatants dikkatle spirating ve her yıkamada tampon A% 1 SDS 500 mikrolitre boncuk resucan. Son yıkamadan sonra, yavaşça gösterildiği gibi boncuk aşağı spin. Ve boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok süpernatant aspire edin.
Boncuklardan proteinleri kurtarmak için, her tüpe %4 SDS numune tamponunun 50 mikrolitresini ekleyin ve numuneleri termo shaker'da 15 dakika boyunca dakikada 80 santigrat derece ve 1,500 devirde kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, tamamen boncuk pelet için santrifüj önce örnekleri soğumaya bırakın. Daha sonra yeni 1.5 mililitretüpler içine eluted proteinleri aktarmak için bir jel yükleme ucu kullanın.
Ve örnekleri Bir SDS-PAGE jelüzerinde çalıştırın batı lekeleme tarafından ilgi proteinlerin S-acylation analiz etmek. Tirozin kinaz Lck nötr iki molar hidroksilin ile tedavi lizatlarda saptayabilir. sistein kalıntıları ve yağ asidi moiety arasındaki tiyoester bağı cleave.
Soyunma ve proteinlere karşı antikorlar ile reprobing asil-rezorin destekli yakalama test aynı anda birden fazla protein S-aylation analiz etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, Lck, Fyn ve LAT S-acylation kolayca birincil fare splenositler tespit edilebilir. Bu modifikasyonun iki tür arasında korunduğuna işaret ediyor.
Yeni S-asilated proteinlerin tanımlanmasına ek olarak, bu yöntem farklı biyolojik koşullar altında protein S-acilesyon değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir. Yeni tanımlanan S-acylated proteinlerin sayısı çift kadar acyl-RAC gibi hızlı ve güvenilir bir teknik anlamına geliyordu sonra muazzam artmıştır. Yeni S-asilated proteinlerin tanımlanmasına ek olarak, bu yöntem farklı biyolojik koşullar altında protein S-acilesyon değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir.
